CN114164106B - 诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，包括：软光刻支撑流道和双光子光刻轴突生长支架；软光刻支撑流道上开设有第一交互接口和第二交互接口，软光刻支撑流道内设置有第一细胞腔室和第二细胞腔室；第一细胞腔室与第一交互接口连通，第二细胞腔室与第二交互接口连通；双光子光刻轴突生长支架嵌合于软光刻支撑流道内，双光子光刻轴突生长支架包括贯通双光子光刻轴突生长支架的生长空腔，生长空腔的第一端与第一交互接口连通，第二端与第二交互接口连通；生长空腔包括至少一个上升段，上升段由生长空腔在Z轴方向上变化形成。本申请解决了相关技术中的流道难以实现定向流动条件下神经轴突的三维定向生长的问题。
Description
技术领域
本申请涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道。
背景技术
可诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维人造微流道是人类神经退行性疾病研究和临床医学测试中不可或缺的重要神经组织模型。定向生长的神经轴突可用于损伤测试和分泌物分析，对研究阿尔兹海默症、帕金森病和亨廷顿氏舞蹈病等不可逆病症研究有极大的指导意义。
现有的可诱导原代皮层神经元轴突定向生长的人造微流道主要为二维微流道，而仅有的三维微流道仅包括凝胶填充二维微流道构成的“3D”微流道和光刻胶打印的3D微流道等。其中，凝胶填充二维微流道构成的“3D”微流道受静水压力作用，皮层神经元轴突沿压力降低梯度定向生长，但其流道构型仍为二微形状，且轴突只能实现二维定向生长。
相比之下，光刻胶打印的3D微流道构型复杂多样，可实现极微尺度的精密3D效果，但其流道尺寸有限，仅能实现毫米级以内的流道制作，流道与外界交互界面过小，流体难以生成定向流动，且操作精度过高、难以控制。因此，上述流道难以实现定向流动条件下神经轴突的三维定向生长，而这恰恰是神经组织模型研究中原代皮层神经元轴突定向生长的最关键因素之一。
针对相关技术中的流道难以实现定向流动条件下神经轴突的三维定向生长，导致难以在神经组织模型中研究原代皮层神经元轴突定向生长的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
本申请的主要目的在于提供一种诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，以解决相关技术中流道难以实现定向流动条件下神经轴突的三维定向生长，导致难以在神经组织模型中研究原代皮层神经元轴突定向生长的问题。
为了实现上述目的，本申请提供了一种诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，该诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道包括：软光刻支撑流道和双光子光刻轴突生长支架；其中，
所述软光刻支撑流道上开设有第一交互接口和第二交互接口，所述软光刻支撑流道内设置有第一细胞腔室和第二细胞腔室；
所述第一细胞腔室与所述第一交互接口的下端连通，所述第二细胞腔室与所述第二交互接口的下端连通；
所述双光子光刻轴突生长支架嵌合于所述软光刻支撑流道内，所述双光子光刻轴突生长支架包括至少一个贯通双光子光刻轴突生长支架的生长空腔，所述生长空腔的直径略小于待培养细胞胞体的直径；
所述生长空腔的第一端与所述第一交互接口连通，第二端与所述第二交互接口连通；所述生长空腔包括至少一个上升段和/或至少一个下降段，所述上升段和/或所述下降段由所述生长空腔在Z轴方向上变化形成。
进一步的，生长空腔包括两段水平段和一段上升段，所述上升段设于两段所述水平段之间；
其中一个所述水平段的端部与所述第一细胞腔室连通，另一个所述水平段的端部与所述第二细胞腔室连通。
进一步的，上升段由所述生长空腔在Z轴方向上高度逐渐增加形成。
进一步的，与所述第二细胞腔室连接的所述水平段的高度高于另一个所述水平段的高度。
进一步的，生长空腔的截面设置为圆形或椭圆形。
进一步的，软光刻支撑流道内开设有支架打印腔室；
所述双光子光刻轴突生长支架嵌合于所述支架打印腔室内，且所述双光子光刻轴突生长支架的上端面与所述支架打印腔室的内顶面之间具有打印间距。
进一步的，双光子光刻轴突生长支架设置为多个，多个所述双光子光刻轴突生长支架并排嵌合于所述支架打印腔室内。
进一步的，第一交互接口和所述第二交互接口设为开设在所述软光刻支撑流道上的圆柱形凹槽。
进一步的，第一细胞腔室和所述第二细胞腔室远离所述双光子光刻轴突生长支架的一侧设置为与对应的所述第一交互接口和所述第二交互接口的外表面匹配的弧形。
根据本申请的另一方面，提供一种细胞培养装置，该细胞培养装置包括上述的诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道。
在本申请实施例中，通过设置软光刻支撑流道和双光子光刻轴突生长支架；其中，软光刻支撑流道上开设有第一交互接口和第二交互接口，软光刻支撑流道内设置有第一细胞腔室和第二细胞腔室；第一细胞腔室与第一交互接口的下端连通，第二细胞腔室与第二交互接口的下端连通；双光子光刻轴突生长支架嵌合于软光刻支撑流道内，双光子光刻轴突生长支架包括至少一个贯通双光子光刻轴突生长支架的生长空腔，生长空腔的直径略小于原代皮层神经元细胞胞体的直径；生长空腔的第一端与第一交互接口连通，第二端与第二交互接口连通；生长空腔包括至少一个上升段和/或至少一个下降段，上升段和/或下降段由生长空腔在Z轴方向上变化形成，达到了将较为微观的双光子光刻轴突生长支架和较为宏观的软光刻支撑流道进行结合，以较为宏观的第一交互接口、第二交互接口、第一细胞腔室和第二细胞腔室配合实现培养液的定向流动，以较为微观的且具有至少一个上升段和/或至少一个下降段的生长空腔形成三维流道，使细胞的轴突可在生长空腔内三维定向生长的目的，从而实现了构建一个便于操作的细胞三维定向生长的三维流道，以便于在神经组织模型中研究原代皮层神经元轴突定向生长的技术效果，进而解决了相关技术中的流道难以实现定向流动条件下神经轴突的三维定向生长，导致难以在神经组织模型中研究原代皮层神经元轴突定向生长的问题。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是根据本申请实施例的结构示意图；
图2是根据本申请实施例中双光子光刻轴突生长支架的局部纵剖结构示意图；
图3是根据本申请实施例中双光子光刻轴突生长支架的另一纵剖结构示意图；
其中，1软光刻支撑流道，2第一交互接口，3双光子光刻轴突生长支架，，31生长空腔，311水平段，312上升段，4第一细胞腔室，5第二交互接口，6第二细胞腔室。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例。
在本申请中，术语“上”、“下”、“内”、等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系。这些术语主要是为了更好地描述本申请及其实施例，并非用于限定所指示的装置、元件或组成部分必须具有特定方位，或以特定方位进行构造和操作。
并且，上述部分术语除了可以用于表示方位或位置关系以外，还可能用于表示其他含义，例如术语“上”在某些情况下也可能用于表示某种依附关系或连接关系。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解这些术语在本申请中的具体含义。
此外，术语“设置”、“设有”、“连接”、“固定”等应做广义理解。例如，“连接”可以是固定连接，可拆卸连接，或整体式构造；可以是机械连接，或电连接；可以是直接相连，或者是通过中间媒介间接相连，又或者是两个装置、元件或组成部分之间内部的连通。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
另外，术语“多个”的含义应为两个以及两个以上。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
相关技术中对于细胞培养而言一般单独采用双光子光刻技术打印构造的细胞生物微支架或者单独采用软光刻技术制备的单层或多层PDMS微流道结构。
然而，对于单独采用双光子光刻技术打印构造的细胞生物微支架而言，由于该细胞生物微支架为较为微观的结构，难以实现培养液的流入和流出，从而难以构建一个定向流道。若采用双光子光刻技术打印一个密闭的空间来构建流动条件就需要将支架打印的较为宏观，导致构建的流道壁较厚，而由于配套的光刻胶自带荧光属性，在流道壁较厚的情况下，难以观测到细胞的生长。
而基于软光刻技术制备的单层或多层PDMS微流道结构，虽然为较为宏观的结构，可以实现动态条件下的多细胞共培养，但由于制作工艺的限制，只能加工复杂的二维形状流道或二维流道堆叠成的简单三维流道，无法实现复杂立体的三维微流道，而这恰恰是影响细胞生长的最关键因素之一。
因此，为构建一个便于操作的细胞三维定向生长的三维流道，如图1至图3所示，本申请实施例提供了一种诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，该诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道包括：软光刻支撑流道1和双光子光刻轴突生长支架3；其中，
软光刻支撑流道1上开设有第一交互接口2和第二交互接口5，软光刻支撑流道1内设置有第一细胞腔室4和第二细胞腔室6；
第一细胞腔室4与第一交互接口2的下端连通，第二细胞腔室6与第二交互接口5的下端连通；
双光子光刻轴突生长支架3嵌合于软光刻支撑流道1内，双光子光刻轴突生长支架3包括至少一个贯通双光子光刻轴突生长支架3的生长空腔31，生长空腔31的直径略小于待培养细胞胞体的直径；
生长空腔31的第一端与第一交互接口2连通，第二端与第二交互接口5连通；如图2所示，生长空腔31包括至少一个上升段312和/或至少一个下降段，上升段312和/或下降段由生长空腔31在Z轴方向上变化形成。
本实施例中，该诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道主要是将较为宏观但简单的软光刻技术制备的单层或多层PDMS微流道结构和较为微观但复杂的双光子光刻技术打印构造的细胞生物微支架进行结合而形成新的三维微支架嵌合流道。因此，该三维组合微流道主要包括软光刻支撑流道1和嵌合在软光刻支撑流道1内的双光子光刻轴突生长支架3。
具体的，需要说明的是，本实施中的软光刻支撑流道1作为该三维组合微流道的外围结构，其采用软光刻技术制备的PDMS微流道结构，为透明结构，在使用时可直接观测到软光刻支撑流道1内部的结构，其形状可为长方体。通过较为宏观的软光刻支撑流道1可利于培养液的流入和流出，从而进行定向流道的构建。在构建定向流道时，该软光刻支撑流道1至少开设有两个用于交互接口，其中一个交互接口为第一交互接口2，其作为培养液的流入口，另一个交互接口为第二交互接口5，其作为培养液的流出口。
为便于第一交互接口2和第二交互接口5与双光子光刻轴突生长支架3两端的连接，以及细胞的定位生长，在软光刻支撑流道1内还设置有第一细胞腔室4和第二细胞腔室6，第一细胞腔室4和第二细胞腔室6分别与第一交互接口2和第二交互接口5连通，而双光子光刻轴突生长支架3的两端则分别与第一细胞腔室4和第二细胞腔室6连通。当培养液灌注入第一交互接口2时，培养液可通过第一细胞腔室4流入双光子光刻轴突生长支架3内，然后再流出第二细胞腔室6至第二交互接口5内，从而实现培养液的定向流动，以建立细胞定向培养的定向流道。
双光子光刻轴突生长支架3作为该三维组合微流道的内部结构，作为神经元轴突定向生长的支架，其采用双光子光刻技术打印嵌合软光刻支撑流道1内。由于采用双光子光刻技术打印，因此使得双光子光刻轴突生长支架3可具有更为复杂的三维结构。
具体的，在本实施例中，如图2所示，该双光子光刻轴突生长支架3包括至少一个贯通双光子光刻轴突生长支架3的生长空腔31，该生长空腔31的第一端与第一交互接口2连通，第二端与第二交互接口5连通，使得培养液可在生长空腔31内定向流动。当神经元轴突延伸至生长空腔31中时，在培养液定向流动的作用下，使得神经元轴突可定向生长。
为仅使细胞轴突在生长空腔31内定向生长，生长空腔31的直径略小于细胞胞体的直径。以原代皮层神经元细胞为例，为仅使神经元轴突进入生长空腔31中，而避免神经元胞体进入生长空腔31中，生长空腔31的直径略小于原代皮层神经元细胞胞体的直径。因此仅细胞轴突可在流体力作用下通过生长空腔31生长进入另一侧细胞腔室，胞体由于尺寸限制仍留在原细胞腔室内；流道被双光子光刻轴突生长支架3分为相互独立的两个细胞腔室，用于维持原代皮层神经元正常生长，第一细胞腔室4和第二细胞腔室6分别定位原代皮层神经元胞体与轴突。
以原代皮层神经元细胞为例，为仅使神经元轴突进入生长空腔31中，而避免神经元胞体进入生长空腔31中，生长空腔31的直径略小于原代皮层神经元细胞胞体的直径。
为便于实现定向流动条件下神经轴突的三维定向生长，双光子光刻轴突生长支架3内的生长空腔31应该为三维流道，换言之，即生长空腔31的走向在Z轴上有一定的变化，该变化可为在Z轴上的持续降低或持续升高，又或者降低与升高连续。对应在生长空腔31的结构上而言，要求生长空腔31应当包括至少一个上升段312和/或至少一个下降段，上升段312和/或下降段由生长空腔31在Z轴方向上变化形成。
以生长空腔31内包含有一个上升段312为例，当细胞的轴突延伸入生长空腔31内时，随着培养液的定向流道而定向生长，当其生长至上升段312时，由于生长空腔31内的培养液的流道被抬升，使得细胞的轴突可沿着生长空腔31向上生长，从而实现细胞轴突的三维定向生长。
生长空腔31内包括下降段则同理，而对于同时还有上升段312和下降段而言，生长空腔31会有直线型转变为连续的波浪形，由于结构变的更为复杂，在采用该结构时，需要考虑细胞轴突的生长特性来判断是否选择该类型的生长空腔31。
本实施例达到了将较为微观的双光子光刻轴突生长支架3和较为宏观的软光刻支撑流道1进行结合，以较为宏观的第一交互接口2、第二交互接口5、第一细胞腔室4和第二细胞腔室6配合实现培养液的定向流动，以较为微观的且具有至少一个上升段312和/或至少一个下降段的生长空腔31形成三维流道，使细胞的轴突可在生长空腔31内三维定向生长的目的，从而实现了构建一个便于操作的细胞三维定向生长的三维流道，以便于在神经组织模型中研究原代皮层神经元轴突定向生长的技术效果，进而解决了相关技术中的流道难以实现定向流动条件下神经轴突的三维定向生长，导致难以在神经组织模型中研究原代皮层神经元轴突定向生长的问题。
如图2所示，生长空腔31包括两段水平段311和一段上升段312，上升段312设于两段水平段311之间；
其中一个水平段311的端部与第一细胞腔室4连通，另一个水平段311的端部与第二细胞腔室6连通。
具体的，需要说明的是，为便于细胞轴突的三维定向生长，本实施例中的生长空腔31仅包括一段上升段312，上升段312位于整个生长空腔31的中部区域，两个水平段311位于上升段312的两端，分别与第一细胞腔室4和第二细胞腔室6连通。为使培养液在生长腔室内流动平缓而均匀，以及为便于轴突的定向生长，水平段311和上升段312之间的应较为平缓的过度，即上升段312和水平段311之间的夹角为较大的钝角，可在150°-170°之间。
如图3所示，上升段312由生长空腔31在Z轴方向上高度逐渐增加形成，为便于配合生长空腔31内的上升段312和水平段311，与第二细胞腔室6连接的水平段311的高度高于另一个水平段311的高度。为便于细胞轴突的定向生长，生长空腔31的截面设置为圆形或椭圆形。
以生长空腔31的截面为椭圆形为例，椭圆长轴6μm，短轴2μm，整体生长空腔31的尺寸为长8mm，宽1mm，高0.3mm。
为便于将双光子光刻轴突生长支架3打印嵌合在软光刻支撑流道1内，软光刻支撑流道1内开设有支架打印腔室；
双光子光刻轴突生长支架3嵌合于支架打印腔室内，且双光子光刻轴突生长支架3的上端面与支架打印腔室的内顶面之间具有打印间距。
软光刻支撑流道1和双光子光刻轴突生长支架3的嵌合打印方式为：利用抽吸入支架打印腔室内的光刻胶进行双光子光刻加工，得到可施加定向流动的内部嵌有3D光刻胶生物微支架的流道(即双光子光刻轴突生长支架3)。
为便于同时对多个细胞轴突定向生长进行观测研究，双光子光刻轴突生长支架3设置为多个，多个双光子光刻轴突生长支架3并排嵌合于支架打印腔室内，如图1所示，本实施例中双光子光刻轴突生长支架3设置为6个，而每一个双光子光刻轴突生长支架3内均开设有一条生长空腔31。通过该三维组合微流道，可实现至少6个细胞的培养。
进一步的，第一交互接口2和第二交互接口5设为开设在软光刻支撑流道1上的圆柱形凹槽，更为具体的，圆柱形凹槽高5mm，底面直径10mm。
进一步的，第一细胞腔室4和第二细胞腔室6远离双光子光刻轴突生长支架3的一侧设置为与对应的第一交互接口2和第二交互接口5的外表面匹配的弧形，从而提高第一细胞腔室4和第一交互接口2的匹配度，以及第二细胞腔室6和第二交互接口5的匹配度。
根据本申请的另一方面，提供一种细胞培养装置，该细胞培养装置包括上述的诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，其特征在于，包括：软光刻支撑流道和双光子光刻轴突生长支架；其中，
所述软光刻支撑流道上开设有第一交互接口和第二交互接口，所述软光刻支撑流道内设置有第一细胞腔室和第二细胞腔室；
所述第一细胞腔室与所述第一交互接口的下端连通，所述第二细胞腔室与所述第二交互接口的下端连通；
所述双光子光刻轴突生长支架嵌合于所述软光刻支撑流道内，所述双光子光刻轴突生长支架包括至少一个贯通双光子光刻轴突生长支架的生长空腔，所述生长空腔的直径略小于待培养细胞胞体的直径；
所述生长空腔的第一端与所述第一交互接口连通，第二端与所述第二交互接口连通；所述生长空腔包括至少一个上升段和/或至少一个下降段，所述上升段和/或所述下降段由所述生长空腔在Z轴方向上变化形成。
2.根据权利要求1所述的诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，其特征在于，所述生长空腔包括两段水平段和一段上升段，所述上升段设于两段所述水平段之间；
其中一个所述水平段的端部与所述第一细胞腔室连通，另一个所述水平段的端部与所述第二细胞腔室连通。
3.根据权利要求2所述的诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，其特征在于，所述上升段由所述生长空腔在Z轴方向上高度逐渐增加形成。
4.根据权利要求3所述的诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，其特征在于，与所述第二细胞腔室连接的所述水平段的高度高于另一个所述水平段的高度。
5.根据权利要求1至4任一项所述的诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，其特征在于，所述生长空腔的截面设置为圆形或椭圆形。
6.根据权利要求5所述的诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，其特征在于，所述软光刻支撑流道内开设有支架打印腔室；
所述双光子光刻轴突生长支架嵌合于所述支架打印腔室内，且所述双光子光刻轴突生长支架的上端面与所述支架打印腔室的内顶面之间具有打印间距。
7.根据权利要求6所述的诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，其特征在于，所述双光子光刻轴突生长支架设置为多个，多个所述双光子光刻轴突生长支架并排嵌合于所述支架打印腔室内。
8.根据权利要求1所述的诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，其特征在于，所述第一交互接口和所述第二交互接口设为开设在所述软光刻支撑流道上的圆柱形凹槽。
9.根据权利要求8所述的诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道，其特征在于，所述第一细胞腔室和所述第二细胞腔室远离所述双光子光刻轴突生长支架的一侧设置为与对应的所述第一交互接口和所述第二交互接口的外表面匹配的弧形。
10.一种细胞培养装置，其特征在于，包括如权利要求1至9任一项所述的诱导原代皮层神经元轴突定向生长的三维组合微流道。
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