CN114350515A - 用于内皮细胞三维培养灌注的器官芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于内皮细胞三维培养灌注的器官芯片及其应用，属于生物组织工程技术领域。所述器官芯片，包括依次叠合设置的上层结构层、中间微制造通道层和下层空白板层；所述上层结构层上设置有贯通的基质灌注口；所述中间微制造通道层上设置有细胞外基质池，所述中间微制造通道层的侧面端面上设置有连通所述细胞外基质池且贯穿所述中间微制造通道层的水平灌注口；当所述上层结构层和所述中间微制造通道层相互叠合时，所述基质灌注口与所述细胞外基质池连通。本发明利用器官芯片技术，以具有良好生物相容性、透光性的材料为芯片材料，设计的芯片可培养内皮细胞和观察内皮细胞的灌注条件，在体外模拟血管。功能完善，操作简单，具有普适性。

Description

用于内皮细胞三维培养灌注的器官芯片及其应用

技术领域

本发明属于生物组织工程技术领域，具体涉及一种用于内皮细胞三维培养灌注的器官芯片及其应用。

背景技术

血管几乎存在于人体的每一个器官中，是人体循环系统的主要组成部分，是细胞生长和分化、器官发育和成熟、人体生理和病理过程所必需的。众所周知，血管系统在各种生理和病理过程中，通过血液与其他组织之间进行营养物、代谢物和其他分子的交换。特别是病理过程，血管结构和功能的异常会导致或伴随着各种疾病的发生和进展，例如，黄斑变性，动脉粥样硬化，骨质疏松，哮喘和肿瘤。

目前，传统的细胞生物学实验主要依赖于2D单层细胞培养，通常在孔板、培养皿或培养瓶中培养细胞。常规的2D细胞培养已经有50多年的历史，被用于在体外评估药物对于不同细胞的作用，至今依然在生命科学研究领域被广泛使用。该方法被证明具有一定的价值，并且他们操作简单、可重复性强、为科研人员提供了便利。但是简单的静态环境无法真实地反映出体内复杂的相互作用信息，并且细胞的分化和功能受到限制，缺乏相应的血管系统和机械线索的信息。

器官芯片是一种微流控设备，依托于微流体技术，在特定材料（如PDMS）组成的模具上培养多种细胞，以模拟组织和器官的生理和病理过程。通过构建组织和器官水平的最小功能单元，来概括多细胞结构、组织-组织界面、理化性质、机械线索、血管结构等。器官芯片作为一种新型的体外模型，与传统的体外模型相比，有更好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于内皮细胞三维培养灌注的器官芯片及培养灌注内皮细胞的方法，特别是对于人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein EndothelialCells，HUVEC）的培养和灌注。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种器官芯片，包括依次叠合设置的上层结构层、中间微制造通道层和下层空白板层；

所述上层结构层上设置有贯通的基质灌注口；

所述中间微制造通道层上设置有细胞外基质池，所述中间微制造通道层的侧面端面上设置有连通所述细胞外基质池且贯穿所述中间微制造通道层的水平灌注口；

当所述上层结构层和所述中间微制造通道层相互叠合时，所述基质灌注口与所述细胞外基质池连通。

进一步地，所述基质灌注口的四周设置一个以上垂直灌注口，当所述上层结构层和所述中间微制造通道层相互叠合时，所述垂直灌注口与所述水平灌注口连通。

进一步地，所述培养通道至少为一个。

进一步地，所述上层结构层、中间微制造通道层和下层空白板层的材质均为PDMS。

在本发明的一个实施例中，所述上层结构层的层高度为0.5-5mm，所述中间微制造通道层的层高度为0.1-1mm，所述下层空白板层的层高度为0.5-5mm。

进一步地，所述叠合设置的方式可拆卸。

一种内皮细胞三维培养灌注的方法，采用上述器官芯片，包括以下步骤：

步骤1，从水平侧面的水平灌注口将贯穿中间微制造通道层的培养通道完全封闭，向细胞外基质池注入细胞外基质溶液，经孵育后细胞外基质溶液凝固形成凝胶，从而得到贯穿中间微制造通道层的中空培养通道；

步骤2，将内皮细胞悬液从水平灌注口加至培养通道中，将器官芯片置于培养箱中孵育，取出后用PBS缓冲液冲洗侧面细胞培养通道，洗去未贴壁的细胞和残留的培养基；

步骤3，采用灌注液对步骤2得到的贴壁细胞进行灌注培养，即可实现对内皮细胞培养状态的实时追踪。

进一步地，所述内皮细胞为人脐静脉内皮细胞。

进一步地，所述细胞外基质溶液由纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液组成。优选地，所述纤维蛋白原溶液的浓度为10mg/mL，所述凝血酶溶液的浓度为100U/mL，纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液的体积比为5：1。

本发明所提供的血管模拟及灌注培养方法，能够实现不同培养条件下内皮细胞培养状态的实时追踪，获得体外模拟血管的血管系统和机械线索的信息。

本发明所提供的血管模拟及灌注培养方法，可采用生物学上常用的细胞检测手段对培养的细胞进行实时观察和生物学检测，包括细胞免疫荧光染色、细胞死活标记染色等。

本发明利用器官芯片技术，以具有良好生物相容性、透光性的PDMS为芯片材料，设计的芯片可培养HUVEC细胞和观察HUVEC细胞的灌注条件，在体外模拟血管。功能完善，操作简单，具有普适性。

附图说明

图1为本发明器官芯片的分层和整体示意图，其中A层为上层结构层，B层为中间微制造通道层，C层为下层空白板层。

图2为本发明器官芯片上层结构层和中间微制造通道层的详解示意图，其中A1为四个相同的垂直灌注口，A2为基质灌注口，B1为水平灌注口，B2为细胞外基质池。

图3为不同浓度的细胞悬液在侧面细胞培养通道中贴壁培养形成的情况。

图4为不同流速在在侧面细胞培养通道中灌注培养形成的情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

实施例1

如图1和图2所示，本实施例的器官芯片，包括依次叠合设置的上层结构层A、中间微制造通道层B和下层空白板层C，A、B、C层均由PDMS材料构成，所述叠合设置的方式可拆卸。

所述上层结构层A上设置有贯通的基质灌注口A2，用于向细胞外基质池中灌注细胞外基质溶液。

所述中间微制造通道层B上设置有细胞外基质池B2，所述中间微制造通道层B的侧面端面上设置有连通所述细胞外基质池B2且贯穿所述中间微制造通道层B的水平灌注口B1。

当上层结构层A和中间微制造通道层B相互叠合时，所述基质灌注口A2与所述细胞外基质池B2连通。

同时，所述基质灌注口A2的四周设置一个以上垂直灌注口A1，当所述上层结构层A和所述中间微制造通道层B相互叠合时，所述垂直灌注口A1与所述培养通道连通。

所述上层结构层的层高度为0.5-5mm，所述中间微制造通道层的层高度为0.1-1mm，所述下层空白板层的层高度为0.5-5mm。

实施例2

一种内皮细胞三维培养灌注的方法，具体过程如下：

（1）芯片基质灌注及侧面培养通道形成

采用1mL注射器的针头，外径约为0.5mm，从侧面水平灌注口水平插入培养通道中，将其封堵。向基质灌注口注入细胞外基质，细胞外基质溶液采用纤维蛋白胶配方溶液（由纤维蛋白原和凝血酶构成），将纤维蛋白原10mg溶于1mL生理盐水中，溶解完全后用0.22μm水系滤头无菌过滤，取0.5mL溶液于1.5mL EP管中置于冰上。100U/mL凝血酶和芯片提前放在冰上冷却，取100μL凝血酶至500μL纤维蛋白原溶液中混合均匀，用200μL移液器取100μL混合液加入到中间细胞外基质池。将芯片放置在培养皿中，在芯片四周加适量PBS缓冲液，保持湿润，将培养皿放入培养箱中孵育30min凝胶。凝胶牢固后，拔出针头，形成中空的侧面细胞培养通道。

（2）芯片细胞接种及培养

将HUVEC分别制成150万、300万、1500万、3000万细胞/mL的细胞悬液，用20μL的移液器取5μL水平加入到侧面细胞培养通道中，显微镜下确定细胞铺满侧面细胞培养通道，细胞均匀分散且不堆积。用镊子将芯片转移至孔板中，在芯片水平灌注口添加适量细胞培养基封口，防止侧面细胞培养通道中的液体干涸，影响细胞生长。将孔板整体移入37℃培养箱中放置，孵育4h。用20μL的移液器取20μL的PBS缓冲液冲洗侧面细胞培养通道，洗去未贴壁的细胞和残留的培养基，显微镜下观察细胞贴壁以及贴壁是否均匀。在孵育4h后，通过荧光显微镜观察细胞贴壁情况，分别拍摄了4X和10X视野下的图片，其结果如图3所示。可见由浓度为1500万细胞/mL的细胞悬液，贴壁形成的效果较好，分散均匀，较为致密且不堆积。更高的浓度3000万细胞/mL，细胞容易在通道中堆积，不利于细胞生长；更低的浓度150万和300万细胞/mL，细胞贴壁不够致密。筛选出1500万细胞/mL的细胞悬液浓度，相比于其他三种浓度，效果较好。

实施例3

一种内皮细胞三维培养灌注的方法，具体过程如下：

（1）芯片基质灌注及侧面培养通道形成

操作流程如实施例2。

（2）芯片细胞接种及培养

选用HUVEC的细胞悬液浓度为1500万细胞/mL，其他操作流程如实施例2。

（3）芯片细胞的灌注

选用外径为1.0、内径0.5mm的塑料管，一端连接注射泵，一端通过培养箱的过滤口进入培养箱内部。芯片放置在100mm培养皿中，培养皿侧面凿出两个小孔，便于导入塑料管，然后塑料管插入芯片的水平灌注口。确定细胞贴壁生长之后，选用0.05、0.10、0.20、0.30mm/s四种不同的流速，对细胞进行灌注培养，定时拍照，观察细胞的形态变化。在灌注24h之后，通过荧光显微镜观察细胞贴壁情况，分别拍摄了4X和10X视野下的图片，其结果如图4所示。可见在0.10mm/s的流速灌注下，细胞生长状态较好。在更高的流速0.20和0.30mm/s下，细胞脱落较多；在更低的流速0.05mm/s下，通道中培养基更新较慢，细胞生长状态不佳。筛选出0.10mm/s的灌注流速，相比于其他三种流速，效果较好。

Claims (8)

1.一种器官芯片，其特征在于：包括依次叠合设置的上层结构层（A）、中间微制造通道层（B）和下层空白板层（C）；

所述上层结构层（A）上设置有贯通的基质灌注口（A2），

所述中间微制造通道层（B）上设置有细胞外基质池（B2），所述中间微制造通道层（B）的侧面端面上设置有连通所述细胞外基质池（B2）且贯穿所述中间微制造通道层（B）的水平灌注口（B1），两个水平灌注口（B1）之间形成培养通道；

当所述上层结构层（A）和所述中间微制造通道层（B）相互叠合时，所述基质灌注口（A2）与所述细胞外基质池（B2）连通。

2.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于：所述基质灌注口（A2）的四周设置一个以上垂直灌注口（A1），当所述上层结构层（A）和所述中间微制造通道层（B）相互叠合时，所述垂直灌注口（A1）与所述培养通道连通。

3.根据权利要求1或2所述的器官芯片，其特征在于：所述上层结构层（A）、中间微制造通道层（B）和下层空白板层（C）的材质均为PDMS。

4.根据权利要求1或2所述的器官芯片，其特征在于：所述叠合设置的方式可拆卸。

5.一种内皮细胞三维培养灌注的方法，其特征在于：采用权利要求1或2所述的器官芯片，包括以下步骤：

步骤1，从水平侧面的水平灌注口将贯穿中间微制造通道层的培养通道完全封闭，向细胞外基质池注入细胞外基质溶液，经孵育后细胞外基质溶液凝固形成凝胶，从而得到贯穿中间微制造通道层的中空培养通道；

步骤2，将内皮细胞悬液从水平灌注口加至培养通道中，将器官芯片置于培养箱中孵育，取出后用PBS缓冲液冲洗侧面细胞培养通道，洗去未贴壁的细胞和残留的培养基；

步骤3，采用灌注液对步骤2得到的贴壁细胞进行灌注培养，即可实现对内皮细胞培养状态的实时追踪。

6.根据权利要求5所述的内皮细胞三维培养灌注的方法，其特征在于：所述细胞外基质溶液由纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液组成。

7.根据权利要求6所述的内皮细胞三维培养灌注的方法，其特征在于：所述纤维蛋白原溶液的浓度为10mg/mL，所述凝血酶溶液的浓度为100U/mL，纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液的体积比为5：1。

8.根据权利要求5所述的内皮细胞三维培养灌注的方法，其特征在于：所述内皮细胞为人脐静脉内皮细胞。

Images