CN101858844A - 用于检测细胞迁移的琼脂糖凝胶微流动腔装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测细胞迁移的琼脂糖凝胶微流动腔装置，包括口字型有机玻璃框(1)及垫在所述口字型有机玻璃框下的一块载玻片(2)，所述口字型有机玻璃框(1)内灌注琼脂糖凝胶(3)；三条处于同一深度的平行微通道贯穿于琼脂糖凝胶(3)内，口字型有机玻璃框(1)的两侧壁凿有导入口(7)和导出口(8)；进液管(9)和出液管(10)通过导入口(7)和导出口(8)插入凝胶中，与两侧的微通道(4)(5)相连；本装置制作工艺简单，密封性好，能在较短的时间内产生稳定的浓度梯度，可广泛运用于各类细胞迁移试验中。

Description

用于检测细胞迁移的琼脂糖凝胶微流动腔装置

技术领域

本发明涉及生物芯片领域，尤其涉及用于检测细胞迁移的琼脂糖凝胶微流动腔装置。

背景技术

细胞迁移在众多生理、病理程中扮演着重要的角色。传统的细胞迁移检测装置有Boyden小室和Transwell小室，其技术方案为：Boyden小室和Transwell小室为一种小盒装置，盒中以一片3～5μm孔径的微孔滤膜将盒分为上、下两小室，上室加受检细胞的悬液；下室加趋化因子，置37℃温育数小时，上室中的细胞因受下室内趋化因子的诱导，使细胞由滤膜微孔进入滤膜内，最后取滤膜，经固定、干燥、着染、脱色等步骤，将处理后的滤膜置显微镜下对细胞进行计数。但是，Boyden小室和Transwell小室存在浓度梯度不稳定及难以实现实时监测活细胞迁移的缺点。

Shing-Yi Cheng在A hydrogel-based microfluidic device for thestudies of directed cell migration(J)lab on chip，2007，7：763-769公开了一款琼脂糖凝胶微流动腔装置，其技术方案为：用光刻法将三条平行的通道印制在琼脂糖凝胶表面，微通道末端为储液池，将印制了通道的凝胶夹持于两块透明平板之间形成一个“三明治”结构。该装置通过在储液池两端加入不同浓度的液体产业浓度梯度来诱导细胞迁移。但是，此装置采用非键合方式导致其密封性差，时常发生漏液是导致实验失败。另外，该装置也不能通过微注射泵来调节其液体流速。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够产生稳定浓度梯度的细胞迁移检测装置，并实现实时监测迁移结果，为实现该目的，本发明的技术方案如下：

用于检测细胞迁移的琼脂糖凝胶微流动腔装置，具体由以下结构组成：口字型有机玻璃框(1)及垫在所述口字型有机玻璃框下的一块载玻片(2)，所述口字型有机玻璃框(1)内灌注有厚度为0.5～1cm、宽度为2～3cm、长度为4～6cm的琼脂糖凝胶(3)；三条处于同一凝胶深度的平行微通道贯穿于所述琼脂糖凝胶(3)内，其中位于两侧的第一通道(4)和第三通道(5)孔径为100～500μm，位于中间的第二通道(6)孔径为1mm；所述口字型有机玻璃框(1)的两侧壁凿有与所述微通道(4)(5)(6)相连通的导入口(7)和导出口(8)；进液管(9)插入所述琼脂糖凝胶(3)中，通过导入口(7)与第一通道(4)、第三通道(5)连通；出液管(10)插入所述琼脂糖凝胶(3)中，通过导出口(8)与第一通道(4)、第三通道(5)连通。

进一步，所述进液管(9)的游离端同双道微注射泵连接；所述出液管(10)的游离端同废液管相连；

进一步，所述微通道之间的水平距离为2～5mm。

本发明的有益效果为：本装置能快速产生稳定的浓度梯度，且密封性好，能通过连接微注射泵来实现流速控制，并进一步通过流速来控制浓度梯度达到平衡的时间。本装置能够对活细胞进行实时监测，为仅通过染色、计数来判断细胞迁移提供了新思路，并为细胞迁移的后续试验(如血管内皮细胞迁移的后续试验为血管生成)提供了新平台。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶微流控装置制作步骤中的排布微丝示意图；

图2为琼脂糖凝胶微流控装置的结构示意图；

图3为无口字型有机玻璃框存在的琼脂糖凝胶与通道的结构示意图；

图4在为流速为50μl/min时，三处通道的浓度梯度(灰度值)分析图；

图5为血管内皮细胞迁移前、后的照片(20倍显微镜下)，图A为迁移前的照片，图B为迁移后的照片，箭头所指方向代表浓度梯度方向。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例

1.1主要材料

人内皮细胞株EA.hy926，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；DMEM F₁₂培养基，购自Invitrogen公司(美国)；胎牛血清，购自杭州四季青公司；趋化因子；琼脂糖凝胶，购自Advancebiomatrx公司(美国)。

1.2细胞培养

细胞贴壁生长于含10％胎牛血清中，在37℃，5％CO₂培养箱中培养。

1.3微流控装置的制作

排布微丝：将内径长6cm、宽3cm、厚1cm的口字型有机玻璃框(1)的前、后两侧壁进行激光穿孔，得孔径为1mm的导入口(7)和导出口(8)各3处，将4根管径为1mm的铁氟龙细管一一插入两侧导入口(7)和导出口(8)，其中与导入口(7)相连的为进液管(9)，与导出口(8)相连的为出液管(10)。将1根管径为1mm的铁氟龙细管插入并连接位于中间的导入口(7)和导出口(8)。两侧的进液管(9)和出液管(10)分别通过直径为100μm的细丝(11)连接，详见图1。

浇注固化：在所述口字型有玻璃框(1)的下方垫载玻片(2)，将浓度为3％的琼脂糖溶液用微波炉加热后迅速倒入口字型玻璃框(1)内，在凝胶冷却前保持细丝的拉直状态。

抽丝：待琼脂糖溶液冷却后得琼脂糖凝胶(3)，迅速抽出连接于两侧进液管(9)和出液管(10)的细丝和位于中间的铁氟龙细管，得所述用于检测细胞迁移的琼脂糖凝胶微流动腔装置，详见图2和图3。

上述装置中，第一通道(4)和第三通道(5)孔径为100μm，分别为药物趋化因子供应腔和缓冲液供应腔。第二通道(6)孔径为1mm，为细胞培养通道。

1.4密封性检测

将进液管(9)的口字型有机玻璃框(1)外的游离端同双道微注射泵连接，出液管(10)的有口字型机玻璃框(1)外的游离端同标示有体积刻度的废液缸相连。微注射泵的注射器中装有蒸馏水，通过计算废液管中回收液体的体积，来计算流动腔的密封性能，回收率＝(回收体积/输出体积)X100％，三次回收率的结果分别为92％，95％和94％，同时通过肉眼观察未发生漏液现象，仅少量液体因滞留于进液管(9)、出液管(10)及琼脂糖凝胶(3)内。

1.5浓度梯度检测

将进液管(9)的口字型有机玻璃框(1)外的游离端同双道微注射泵连接，双道注射泵的其中一支注射器中装有蒸馏水，另一支注射器中装有按标准方法配制的荧光素溶液。微注射泵的流速设定为50μl/min，将荧光素溶液和蒸馏水接触琼脂糖凝胶起设定为t＝0。采用倒置荧光显微镜(Olympus IX51)拍摄通道中的荧光强度图像，实验前十分钟内每十分钟拍照一次，一小时后，每5分钟拍照一次。将拍摄的照片用Photoshop进行进行灰度处理，用灰度值代表荧光强度并进行数据统计。在较短的时间内，位于第一通道(4)和第三通道(5)之间的琼脂糖凝胶(3)各处荧光强度达到平衡稳定状态，形成稳定的浓度梯度，详见图4。

1.6趋化因子浓度梯度诱导血管内皮细胞迁移

将制作好的微流动装置灭菌后，用50ug/mL的纤粘蛋白(Fn)对第二通道(6)进行裱衬。将生长状态良好的细胞进行消化，吹散打匀，通过注射泵将密度为4×10⁴个/ml的细胞悬液40μl一分钟内泵入到第二通道(6)内，然后放入培养箱中培养4h，待大部分细胞贴壁后用PBS冲洗未贴壁的细胞。换入新鲜培养基。同时，第一通道(4)用微注射泵注入趋化因子溶液，第三通道(5)用微注射泵注入缓冲液，从而使位于第一通道(4)和第三通道(5)之间的第二通道(6)保持恒定的浓度梯度。用显微镜观察趋化因子浓度梯度建立6h后血管内皮细胞较初始状态的迁移情况，将第二通道(6)划分为四等分，统计诱导后每个区间的细胞数目，与初始细胞数目相比较，最后进行数据分析，详见图5。迁移后的图5-B中，图片从左到右的顺序将划分的四等分分别标示为1、2、3、4区，其中1区大约有7％细胞数量减少、2区大约有3％的细胞数量减少，而3区大约有9％细胞数量增加、4区大约有2％的细胞数量增加。

本权利要求书和说明书中技术方案中包含：“三条处于同一深度的平行直线微通道贯穿于所述琼脂糖凝胶(3)内”，它可以理解为微通道被包埋于琼脂糖凝胶而非暴露于琼脂糖凝胶的表面，而采用光刻法制作的微流控芯片通常为印制在材料(聚二甲基硅氧烷、凝胶)的表面。另外，本实施例中选用血管内皮细胞为对象进行迁移实验，公知常识可知血管内皮细胞发生迁移现象的时间长于其他细胞，在稳定的浓度梯度诱导条件下，运用本装置可以检测出血管内皮细胞的迁移，同样也能检测其他迁移时间较短的细胞的迁移。另外，本实施例中装置的大小及通道的尺寸根据本实验室现有材料而设定的，可以在不花费创造性劳动的前提下变换装置的大小及通道的尺寸而不影响实验效果。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (3)

1.用于检测细胞迁移的琼脂糖凝胶微流动腔装置，其特征在于：所述琼脂糖凝胶微流动腔装置包括：口字型有机玻璃框(1)及垫在所述口字型有机玻璃框下的一块载玻片(2)，所述口字型有机玻璃框(1)内灌注有厚度为0.5～1cm、宽度为2～3cm、长度为4～6cm的琼脂糖凝胶(3)；三条处于同一凝胶深度的平行微通道贯穿于所述琼脂糖凝胶(3)内，其中位于两侧的第一通道(4)和第三通道(5)孔径为100～500μm，位于中间的第二通道(6)孔径为1mm；所述口字型有机玻璃框(1)的两侧壁凿有与所述微通道(4)(5)(6)相连通的导入口(7)和导出口(8)；进液管(9)插入所述琼脂糖凝胶(3)中，通过导入口(7)与第一通道(4)、第三通道(5)连通；出液管(10)插入所述琼脂糖凝胶(3)中，通过导出口(8)与第一通道(4)、第三通道(5)连通。

2.根据权利要求1所述的用于检测细胞迁移的琼脂糖凝胶微流动腔装置，其特征在于：所述进液管(9)的游离端同双道微注射泵连接；所述出液管(10)的游离端同废液管相连。

3.根据权利要求1所述的用于检测细胞迁移的琼脂糖凝胶微流动腔装置，其特征在于：所述微通道之间的水平距离为2～5mm。

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