CN105385595A - 用于检测细胞迁移的微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程领域，特别涉及微流控芯片，其包括单元A、单元B和连接所述单元A和所述单元B之间的圆环毛细管道；所述单元A包括平行于同一平面的三根通道，依次为高浓度液体通道、细胞培养通道和缓冲液通道，所述三根通道在近所述圆环毛细管道端两两通过垂直相交的侧支通道相连通，所述细胞培养通道同所述圆环毛细管道相连通；所述单元B包括高浓度液体池和毛细管道，所述圆环毛细管道和所述高浓度液体池通过所述毛细管道相连通；所述单元A由高强度琼脂糖凝胶制成，所述单元B由PDMS制成。该微流控通道可以产生多维度的浓度梯度，适用作细胞迁移装置。

Description

用于检测细胞迁移的微流控芯片
技术领域
本发明属于生物工程领域，特别涉及微流控芯片。
背景技术
微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。因为具有微型化、集成化等特征，微流控装置通常被称为微流控芯片，也被称为芯片实验室(LabonaChip)和微全分析系统(micro-TotalAnalyticalSystem)。微流控的早期概念可以追溯到19世纪70年代采用光刻技术在硅片上制作的气相色谱仪，而后又发展为微流控毛细管电泳仪和微反应器等。微流控的重要特征之一是微尺度环境下具有独特的流体性质，如层流和液滴等。借助这些独特的流体现象，微流控可以实现一系列常规方法所难以完成的微加工和微操作。目前，微流控被认为在生物医学研究中具有巨大的发展潜力和广泛的应用前景。
细胞迁移(cellmigration)也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。
申请人为重庆医科大学、申请号为201010164032.7的中国专利介绍了一种用于检测细胞迁移的琼脂糖凝胶微流动腔装置，包括口字型有机玻璃框及垫在所述口字型有机玻璃框下的一块载玻片，所述口字型有机玻璃框内灌注琼脂糖凝胶；三条处于同一深度的平行微通道贯穿于琼脂糖凝胶内，口字型有机玻璃框的两侧壁凿有导入口和导出口；进液管和出液管通过导入口和导出口插入凝胶中，与两侧的微通道相连；本装置制作工艺简单，密封性好，能在较短的时间内产生稳定的浓度梯度，可广泛运用于各类细胞迁移试验中。该微流控芯片虽然能很稳定的产生浓度梯度，但是，所产生的浓度梯度为单因素的；而多因素多维度的浓度梯度更接近体内的环境。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种微流控装置，其能够产生多维度的浓度梯度，营造较为复杂的浓度梯度环境。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种微流控装置，包括单元A、单元B和连接所述单元A和所述单元B之间的圆环毛细管道；所述的圆环毛细管道可以由硅胶管制成。所述单元A包括平行于同一平面的三根通道。所述三根通道可以为圆柱体，被包埋与机制材料中。三根通道依次为高浓度液体通道、细胞培养通道和缓冲液通道，所述三根通道在近所述圆环毛细管道端两两通过垂直相交的侧支通道相连通，所述细胞培养通道同所述圆环毛细管道相连通；所述侧支通道可以是毛细管，也可以不是，但所述侧支通道的半径要小于主通道(即高浓度液体通道、细胞培养通道和缓冲液通道)，其中，所述高浓度液体通道和所述缓冲液通道最好是等径。所述单元B包括高浓度液体池和毛细管道，所述圆环毛细管道和所述高浓度液体池通过所述毛细管道相连通。
作为优选的方案，所述单元A由高强度琼脂糖凝胶制成，所述单元B由PDMS制成。高强度琼脂糖凝胶可以很快速的实现浓度梯度稳定。
作为优选的方案，所述的微流控装置所述单元A中的所述所述高浓度液体通道的下方设置有与之平行的缓冲液通道Ⅱ。
进一步，所述的微流控装置，高浓度液体通道、缓冲液通道和缓冲液通道Ⅱ均设置有进液管道和出液管道。
进一步，所述的微流控装置，所述单元A下方有载玻片，便于在显微镜下观察细胞。
进一步，所述的微流控装置，所述圆环毛细管道由透明材质制成。
进一步，所述的微流控装置，所述细胞培养通道与所述毛细管道位于同一水平位置，或是同一直线水平位置。
进一步，所述的微流控装置，所述圆环毛细管道设置有刻度。刻度便于定位细胞的迁移情况，也便于量化分析细胞迁移。
本发明的目的之二在于提供一种检测细胞迁移的方法，该方法是利用上述微流控装置作为检测工具的，可以实现多维度浓度梯度影响下的细胞迁移实验。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
运用所述的微流控装置检测细胞迁移的方法：
1)在细胞培养通道中培养细胞24小时，拍照，得照片A；一般培养24小时候，细胞都能在细胞培养通道中较好的生长，有时候，有的细胞只需要8个小时。2)同时在所述高浓度液体池中添加待测液体或趋化因子(含有细胞喜好的物质)，同时匀速在所述高浓度液体通道中通入所述待测液体，同时开启恒速泵在所述缓冲液通道和/或缓冲液通道Ⅱ中通入空白缓冲溶液，使琼脂糖凝胶中形成浓度梯度；通道中液体的输送可以借助恒速泵进行。3)保持琼脂糖凝胶中的浓度梯度持续不少于8小时，观察细胞并拍照，得照片B；4)比较照片A和照片B中的区别。
作为优选的方案，所述的微流控装置检测细胞迁移的方法，步骤1)中所述细胞为血管内皮细胞。
作为优选的方案，所述的方法步骤4)中通过比较照片A和照片B中的区别，分析细胞迁移结果。
本发明的有益效果在于：1)本装置可以产生多维的浓度梯度，其中，“一维”是由高浓度液体通道和缓冲液通道中分别流动的高浓度液体和空白缓冲液体所产生的；“另一维”是由高浓度液体通道和缓冲液通道Ⅱ中分别流动的高浓度液体和空白缓冲液体所产生的；还有“一维”是由B单元(高浓度液体池)和A单元产生的。2)本装置可以定位和统计细胞的迁移情况，主要是圆环毛细管道设置有刻度，这样可以统计单因素、双因素或三因素的浓度梯度情况下细胞的迁移情况，比起传统的transwell小室检测细胞迁移更科学和系统。3)本装置检测浓度梯度可以精确到毫秒。
更多的有益效果，详见具体实施方式。
附图说明
图1为所述微流控装置的俯视的结构示意图。
图2为所述微流控装置的侧视的结构示意图。
图3为Transwell小室细胞迁移实验中含空白溶液的实验结果图。
图4为Transwell小室细胞迁移实验中的含趋化因子溶液的实验结果图。
图5为照片A。
图6为照片B。
具体实施方式
一微流控芯片
一种微流控装置，如图1或图2所示，包括单元A1、单元B2和连接所述单元A和所述单元B之间的圆环毛细管道3；所述单元A包括平行于同一平面的三根通道，依次为高浓度液体通道4(直径为100μm)、细胞培养通道5(直径为1mm)和缓冲液通道6(直径为100μm)，所述三根通道在近所述圆环毛细管道端两两通过垂直相交的侧支通道7相连通，所述细胞培养通道同所述圆环毛细管道相连通；所述单元B2包括高浓度液体池8和毛细管道9，所述圆环毛细管道和所述高浓度液体池通过所述毛细管道相连通；所述单元A由高强度琼脂糖凝胶制成，所述单元B由PDMS制成。所述单元A中的所述所述高浓度液体通道的下方设置有与之平行的缓冲液通道Ⅱ10(直径为100μm)。高浓度液体通道4、缓冲液通道6和缓冲液通道Ⅱ10均设置有进液管道和出液管道。所述单元A下方有载玻片。所述圆环毛细管道由透明材质制成。所述细胞培养通道与所述毛细管道位于同一水平位置。所述圆环毛细管道设置有刻度。
上述装置的制备可参照申请号为201010164032.7和201010164041.6中提及的方法制备。也可以直接委托微流控加工企业或实验室制作(如大连物化所)。由于微流控芯片的制备是非常成熟且商业化的，在此就不过多的描述其制备工艺过程了。
二浓度梯度检测
(一)一维浓度梯度的检测
将通道各自的进液管同微注射泵相连，同高浓度液体通道4相连接的注射器中装有按标准方法配置的荧光素溶液，同缓冲液通道6相连接的注射器中装有蒸馏水，高浓度液体池8不填充液体，缓冲液通道Ⅱ10不连接注射泵。微注射泵的流速设定为50Μl/min,将荧光素溶液和蒸馏水接触琼脂糖凝胶起设定为t＝0。采用倒置荧光显微镜(OlympusIX51)拍摄通道中的荧光强度图片，
实验前十分钟内每十分钟拍照一次，一小时后，每5分钟拍照一次。将拍摄的照片用Photoshop进行灰度处理，用灰度值代表荧光强度并进行数据统计。统计结果详见表1。
表1“一维”浓度梯度的检测
(二)二维浓度梯度的检测
将通道各自的进液管同微注射泵相连，同高浓度液体通道4相连接的注射器中装有按标准方法配置的荧光素溶液，同缓冲液通道6相连接的注射器中装有蒸馏水，同缓冲液通道Ⅱ10相连接的注射器中装有蒸馏水，高浓度液体池8不填充液体。微注射泵的流速设定为50Μl/min,将荧光素溶液和蒸馏水接触琼脂糖凝胶起设定为t＝0。采用倒置荧光显微镜(OlympusIX51)拍摄通道中的荧光强度图片，实验前十分钟内每十分钟拍照一次，一小时后，每5分钟拍照一次。将拍摄的照片用Photoshop进行灰度处理，用灰度值代表荧光强度并进行数据统计。统计结果详见表2。
表2“二维”浓度梯度的检测
(三)三维浓度梯度的检测
将通道各自的进液管同微注射泵相连，同高浓度液体通道4相连接的注射器中装有按标准方法配置的荧光素溶液，同缓冲液通道6相连接的注射器中装有蒸馏水，同缓冲液通道Ⅱ10相连接的注射器中装有蒸馏水，高浓度液体池8填充有按标准方法配置的荧光素溶液(同高浓度液体通道4的相同)。微注射泵的流速设定为50ml/min,将荧光素溶液和蒸馏水接触琼脂糖凝胶起设定为t＝0。采用倒置荧光显微镜(OlympusIX51)拍摄通道中的荧光强度图片，实验前十分钟内每十分钟拍照一次，一小时后，每5分钟拍照一次。将拍摄的照片用Photoshop进行灰度处理，用灰度值代表荧光强度并进行数据统计。统计结果详见表3。采用本装置检测浓度梯度，其时间准确性可以精确到毫秒。
表3“三维”浓度梯度的检测
三细胞迁移实验
人内皮细胞株EA.Hy926,购自中国科学院上海生科科学研究院细胞资源中心；DMEMF12培养基，购自Invitrogen公司；胎牛血清，购自杭州四季青公司；琼脂糖凝胶，购自Advancebiomatrx公司(美国)；PBS缓冲液，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Transwell小室，购自于Corningcostar公司。
用吸管取2ml配制好的含10％胎牛血清的EMEM/F-12培养基轻轻加入培养瓶，注意，吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧部。并进行细胞传代培养。
设置实验组和对照组两个组。实验组为采用所述微流控装置进行的细胞迁移实验。对照组为采用Transwell小室进行的细胞迁移实验。
Transwell小室实验具体为：选用槽底部膜面积为4.76cm2，膜上小孔直径为8μm的Transwell小室进行。PBS两次洗涤己贴壁的EA.hy926细胞，经胰酶消化吹散，离心收集并计数细胞。每个迁移孔中加入含有1.5ml含有10％胎牛血清的1640培养基，细胞收集计数后以lxl06/孔接种。在Transwell小室下层分别加入以体积分别为0(空白溶液)和含体积百分浓度25％细胞喜好的趋化因子(CXCR-4)，将Transwell小室置于37℃，5％CO2的孵箱中培养8h,将Transwell小室取出，用棉签将膜上层未迁移的细胞小心擦去，50％的甲醇和10％乙醇固定膜45S，PBS洗膜1min，再用甲苯胺蓝染色305，70％乙醇脱色，100％乙醇脱水30秒，膜在水中反复漂洗数次，显微镜下随机计数5个高倍镜视野中细胞。空白溶液的结果如图3所示，肉眼可见仅有极少量的细胞实验的迁移。含25％细胞喜好的趋化因子的实验结果如图4所见，肉眼可见有大量的细胞实验了迁移。但是，Transwell小室存在的问题较多：其仅能实验上、下两室单因素的浓度差，上、下小室的势差因素及时间因素的不可调节导致了浓度梯度不可控。随着时间的影响，上、下小室的浓度差逐渐缩小让浓度梯度极不稳定。
实验组：将生长状态良好的血管内皮细胞进行消化并吹散打匀,通过进液管导入所述微流装置的所述细胞培养通道5中,放入培养箱内进行培养。每2h进行一次换液，4h后细胞大部分贴壁。细胞在芯片内生长72h后,先通入PBS清洗5min,再通入含2μmol/LCalceinAM在室温下孵育30min。
将通道各自的进液管同微注射泵相连，同高浓度液体通道4相连接的注射器中装有含体积百分浓度25％细胞喜好的趋化因子(CXCR-4)，同缓冲液通道6相连接的注射器中装有PBS缓冲溶液，同缓冲液通道Ⅱ10相连接的注射器中装有PBS缓冲溶液，高浓度液体池8填充有含体积百分浓度25％细胞喜好的趋化因子(CXCR-4)。微注射泵的流速设定为50ml/min,将趋化因子溶液和PBS缓冲溶液接触琼脂糖凝胶起设定为t＝0。用显微镜拍摄所述细胞培养通道5中的血管内皮细胞照片，得照片A(如图5所示)。保持琼脂糖凝胶中的浓度梯度持续8小时，观察细胞并拍照，得照片B(如图6所示)。照片A和照片B中的箭头指向了高浓度梯度方向。将照片A和照片B进行比较，在照片B的左上角的圆圈处，出现了血管内皮细胞极具群。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种微流控装置，包括单元A(1)、单元B(2)和连接所述单元A和所述单元B之间的圆环毛细管道(3)；
所述单元A包括平行于同一平面的三根通道，依次为高浓度液体通道(4)、细胞培养通道(5)和缓冲液通道(6)，所述三根通道在近所述圆环毛细管道端两两通过垂直相交的侧支通道(7)相连通，所述细胞培养通道同所述圆环毛细管道相连通；
所述单元B(2)包括高浓度液体池(8)和毛细管道(9)，所述圆环毛细管道和所述高浓度液体池通过所述毛细管道相连通；
所述单元A由高强度琼脂糖凝胶制成，所述单元B由PDMS制成。
2.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于：所述单元A中的所述，所述高浓度液体通道的下方设置有与之平行的缓冲液通道Ⅱ(10)。
3.根据权利要求2所述的微流控装置，其特征在于：高浓度液体通道(4)、缓冲液通道(6)和缓冲液通道Ⅱ(10)均设置有进液管道和出液管道。
4.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于：所述单元A下方有载玻片。
5.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于：所述圆环毛细管道由透明材质制成。
6.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于：所述细胞培养通道与所述毛细管道位于同一水平位置。
7.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于：所述圆环毛细管道设置有刻度。
8.运用权利要去1-7任一项所述的微流控装置检测细胞迁移的方法，其特征在于：
1)在细胞培养通道(5)中培养细胞不少于24小时，拍照，得照片A；
2)同时在所述高浓度液体池(8)中添加待测液体，同时匀速在所述高浓度液体通道(4)中通入所述待测液体，同时运输在所述缓冲液通道(6)和/或缓冲液通道Ⅱ(10)中通入空白缓冲溶液，使琼脂糖凝胶中形成浓度梯度；
3)保持琼脂糖凝胶中的浓度梯度持续不少于8小时，观察细胞并拍照，得照片B；
4)比较照片A和照片B中的区别。
9.根据权利要求8所述的微流控装置检测细胞迁移的方法，其特征在于：步骤1)中所述细胞为血管内皮细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤4)中通过比较照片A和照片B中的区别，分析细胞迁移结果。
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