DK141409B - Fremgangsmaade og celledyrkningsenhed til dyrkning og vedligeholdelse af levende menneskelige eller dyriske celler in vitro - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 1^1409 DANMARK (51) lnt Cl 3 c 12 m 3/oo «(21) Ansøgning nr. 1 977/75 (22) Indleveret den · 1 973 (23) Løbedag 1 1 · apr. 1 975

(44) Ansøgningen fremlagt og 1 nRO

fremlæggelsesskriftet offentliggjort den * ^ · yOJ

Dl REKTORATET FOR

PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET (30> Pri°ritet beg*r« fra den

18. maj 1972, 254678, US

(71) CELLCO INC., Bethesda, Maryland, US.

(72) Opfinder: Richard Allan Knazek, 9007 Seneca Lane, Bethesda, Mary* land 20054, US: Pletro MTchele Gullino, 85202 Melody Court, Bethesda, Maryland 20054, US: William Robert Kidwell, 9ΟΟ5 Seneca Lane, Bethesda, Maryland 20054, US: Robert Lyle~Dedrick, 1655 Warner Avenue, Mc= Lean, Virginia 22101, US.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Firmaet Chas. Hude.

(54) Fremgangsmåde og celledyrkningeenhed til dyrkning og vedligeholdel* se af levende menneskelige eller dyriske celler in vitro.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde og en celledyrkningsenhed til dyrkning af levende menneskelige eller dyriske celler in vitro.

Forsøg på dyrkning af celler til tætheder og/eller strukturer, som nærmer sig levende væv, har omfattet forskellige hjælpemidler for tilførsel af næringsmedium til cellerne. Der er f.eks. opnået meget store celletætheder i suspensionskulturer, selv om disse ikke nærmer sig levende vævs (Bryant, J.C. Ann.N.Y.Acad.Sci., 159, Art.l, p. 145(1966)). Der er endvidere blevet fremkaldt tredimensional vækst af tumorceller i tynde lag i små stykker cellulosesvamp, hvilket er en teknik, som synes at begunstige næringstilførelse til og tilvejebringe en understøtningsmatrix for cellevækst (Leighton, J., G.Justh, 2 UU09 M. Esper, R.E. Kronenthai, Science, 155, p.1259(1967)). Endvidere har omgivelsesteknik muliggjort opnåelse af tykkelser på ca. 17 cellelag (Kruse, Jr., P.E., L.N. Keen, ¥.1. Whittle, In Vitro, 6, l‘, p.75(1970)). Sådanne tidligere kendte fremgangsmåder har ikke frembragt en organlignende struktur in vitro.

Resultaterne af forskning på dette område peger mod visse grundlæggende problemer, som må overvindes med henblik på dyrkning af en organlignende struktur in vitro. Det første og mest nærliggende problem er, at komponenterne i mediet skal diffundere gennem cellelagene for at nå alle celler, og denne diffusion bliver selvsagt vanskeligere, når tykkelsen af cellelaget stiger.

Et andet problem i forbindelse med dyrkning af en organlignende struktur in vitro kan være opretholdelsen af passende "mikroomgi-velser" ved konventionel celledyrkning. Væsken umiddelbar op ad den voksende celle ændres således kontinuerligt, efterhånden som det cellulare stofskifte skrider frem, og den vender kun trinvis tilbage til sin oprindelige tilstand, når dyrkningsmediet ændres eller omrøres en masse.

Et tredje problem synes at være nødvendigheden af et gitter eller et passende materiale, hvorpå den organlignende struktur kan dyrkes.

Den foreliggende oprindelse tager sigte på at angive en fremgangsmåde og en celledyrkningsenhed, hvormed der tilvejebringes: (a) næringsstofkilder inden i cellemassen, som tilfører både store og små essentielle molekyler, (b) dræn inden i cellemassen til fjernelse af stofskifteprodukter, (c) passende mikroomgivelser, (d) et gitter til muliggørelse af vækst i tre dimensioner, og (e) et overfladeareal til mono- og/eller multilagscellekulturer, som er stort i forhold til de rumfang, der kræves til standardcel-ledyrkningsteknik.

3 141409

Fremgangsmåden i følge opfindelsen er ejendommelig ved det 1 krav 1 kendetegnende del anførte, og til fremgangsmådens udførelse anvendes en celledyrkningsenhed, der er ejendommelig ved det i krav 6's kendetegnende del anførte.

Ted hjælp af fremgangsmåden og celledyrkningsenheden i følge opfindelsen muliggøres vækst af organiserede cellekolonier, der i høj grad minder om normalt væv.

Udformningen af celledyrkningsenheden er baseret på 3 principper: (1) animalske celler, som er organiseret i kolonier (væv), opfører sig anderledes end celler,som vokser i en væskesuspension eller i monolag, (2) celler i et væv in vivo er omgivet af stabile mikroomgivelser, som kan være afgørende for dyrkning af organiserede cellestrukturer, der fungerer som normalt væv, og (3) in vivo-væv gennemtrænges af kapillarrør, der fungerer som et middel til næringsstoftilførsel og spildproduktfjemelse.

Afstanden mellem kapillarrørene skal være fastsat maksimalt til muliggørelse af tilstrækkelig udveksling af næringsstoffer og spildprodukter. Celler, som vokser på et kapillarrør, modtager deres næring fra det pågældende kapillarrør og deler sig gentagne gange til opbygning af lag, som bliver tykkere, og som vokser bort fra det understøttende kapillarrør. Når cellelagshøjden bliver så stor, at celler, som vokser længst borte fra kapillarrøret, ikke længere kan få næring, eller fjernelsen af spildprodukter bliver ineffektiv, standser cellevæksten. For at muliggøre fortsat vækst af cellelagene, skal disse modtage næring fra et eller flere yderligere kapillarrør inden for en afstand, som er lig med eller mindre end den effektive diffusionsafstand for næringsstofferne og spildprodukterne i det flydende medium. Dette gør det muligt for cellerne at vokse i retning mod sekundære kapillarrør og danne voksende lag af vævslignende masser.

I en udførselsform for fremgangsmåden i følge opfindelsen udvin des celleprodukter, som passerer fra cellerne gennem kapillarrø-

4 UUQS

renes vægge til perfusatet. Herved bliver det muligt at udvinde celleprodukter, f.eks. mælkesyre og hormoner eller andre biologiske stoffer, som dannes ved cellernes stofskifteproces.

Celler, som er suspenderet i et næringsmedium, får således til at begynde med lov til at sætte sig på den ydre overflade af kapillarrørene, hvorigennem et oxygeneret næringsmedium strømmer. Næringsstoffer passerer fra det perfuserende medium gennem kapillarvæggen og ind i cellen, medens celleprodukter, f.eks. mælkesyre og hormoner, passerer fra cellen gennem kapillarvæggen og ind i perfusatet. Disse produkter kan derpå udvindes ved hjælp af passende midler.

I en yderligere udførelsesform for fremgangsmåden i følge opfindelsen anvendes kapillarrør, hvoraf i det mindste nogle har vægge, som er gennemtrængelige for næringsmidler og celleprodukter med stor molekylvægt, og i det mindste nogle har vægge, som er gennemtrængelige for gasser, hvorhos der kan benyttes kapillarrør, som har vægge fremstillet af forskellige semipermeable materialer, af hvilke nogle er mere gennemtrængelige for gasser end andre. Herved forøges omfanget af stofskifteprocesser, som kan finde sted ved fremgangsmåden i følge opfindelsen, og dermed antallet af celleprodukter, som kan udvindes.

Celler og væv, der dyrkes eller ernæres in vitro, forbruger oxygen med stor hastighed, og mangel på oxygen ville kunne indebære uoprettelig beskadigelse af mange celletyper. Et stort oxygenforbrug kræver derfor, at en oxygenkilde kontinuerligt stilles til rådighed, hvis cellerne skal forblive i en stofskiftebalancetilstand, der efterligner in vivo-tilstanden. Denne indebærer imidlertid, at de aktive celler ved deres stofskifteproces producerer affaldsstoffer ud fra de tilførte næringsstoffer, og nogle af disse affaldsstoffer er i stand til at ændre pH-værdien i cellernes umiddelbare nærhed.

Det er derfor hensigtsmæssigt ved udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, at perfusatet oxygeneres, og at pH-værdien indstilles, før perfusatet føres gennem det intrakapillære rum.

Celler kræver såvel tilførsel af næringsstoffer som fjernelse af stofskifteprodukter, hvis de skal fungere korrekt. Dette opnås in vivo ved hjælp af den kontinuerlige blodstrøm gennem vævet. Den samme tilstand skal foreligge in vitro, hvis in vivo-tilstanden skal UH09 5 efterlignes. Der skal derfor tages hensyn til ethvert stof, som cellerne har brug for, eller som produceres af cellerne. Disse stoffer indbefatter ikke alene sådanne stoffer som sukkerarter, aminosyrer, vitaminer, salte, metalioner, syrer, etc., men også gasser, såsom oxygen og carbondioxid. Medens disse stoffer alle kan kan diffundere gennem en kapillarvæg in vivo,sætter kunstige kapillarer sig mere eller mindre imod en sådan stoftransport, afhængigt af karakteren af det pågældende stof. Heraf følger, at modifikationer i sammensætningen af in vitro-kapillarerne selektivt kan lette eller hæmme transporten af næringsstoffer eller stofskifteprodukter. Det har vist sig, at celluloseacetatkapillarer er meget gennemtrængelige for sådanne stoffer som sukkerarter, aminosyrer og små proteiner, men mindre gennemtrængelige for oxygen. Siliconpolycarbonat er derimod gennemtrængeligt for oxygen, men ikke gennemtrængeligt for de andre ovennævnte stoffer. I overensstemmelse hermed kan kapillarrørene i en celledyrkningsenhed ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt have vægge dannet af forskellige semi-permeable materialer, og nogle kapillarrør kan være mere gennemtrængelig for gasser end andre, hvorhos nogle af kapillarrørene kan have vægge fremstillet af celluloseacetat, og nogle af kapillarrørene kan have vægge fremstillet af siliconpolycarbonat.

En blanding af de to kapillarrørstyper vil tilvejebringe gennemgang af såvel oxygen som opløselige næringsstoffer og i meget høj grad efterligne in vivo-tilstanden. Ikke alle celler forbruger oxygen med meget høj hastighed in vitro, men de der gør det, vil nyde fordel af tilstedeværelsen af kapillarer, som tilvejebringer en høj oxygengennemgang.

Ved udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der opbygges et system omfattende mindst en celledyrkningsenhed sammen med et mediereservoir, en gasudveksler, et pH-meter og en pumpe til frembringelse af styrede strømningshastigheder for perfusatet. Gunstige koncentrationsgradienter muliggør diffusion af næringsstoffer gennem kapillarrørsvæggene ind i cellerne, medens celleprodukter diffunderer ind i perfusatet. Cellevæksten kan bedømmes på en af flere måder: (a) trypsinbehandling af kapillarbundter med efterfølgende celletællinger, UU09 6 (b) mikroskopisk undersøgelse af farvede dele af bundterne, (c) måling af cellekomponenter eller -produkter, eller (d) optagelse af næringsstoffer og/eller markeringsstoffer.

Et træk ved opfindelsen ud over dyrkningen af celler involverer udvinding fra kulturen af produkter fra celler dyrket på kapillarrørene, medens kulturen selv forbliver uforstyrret. Eksempler på disse produkter omfatter hormoner og andre biologiske stoffer, som tidligere er blevet opnået fra levende væv eller ekskre-tionsprodukter ved hjælp af standardteknik.

På tegningen viser fig. 1 skematisk et diagram af et system til dyrkning af celler på kapillarrør ifølge opfindelsen, fig. 2 en celledyrkningsenhed ifølge opfindelsen, og fig. 3 en grafisk afbildning af koncentrationen af forskellige stoffer i reservoiret for perfusatet som funktion af tiden.

I den i fig. 1 og 2 viste udførelsesform for opfindelsen angives et apparat 10 til dyrkning af celler på kapillarrør. Apparatet 10 omfatter en eller flere celledyrkningsenheder 11 indeholdende mindst et kapillarrør 12 fremstillet af semipermeabelt materiale. Når der anvendes mere end en celledyrkningsenhed 11, kan enhederne anvendes arrangeret parallelt som vist i fig. 1 eller i serie. Fortrinsvis anvendes flere.kapillarrør 12 i hver celledyrkningsenhed 11. En sådan flerhed af kapillarrør, som tilsammen danner et bundt, danner et system, som efterligner et kar-netværk i levende væv. Kapillarrørene 12, som typisk har en længde på ca. 7,5 - 10 cm, er indsat i et hus 13, som er fremstillet af glas eller et lignende indifferent materiale, og enderne af disse dele 12 er fastgjort i endestykker 14 fremstillet af epoxyharpiks eller et andet passende forseglingsmateriale ved hver ende af huset 13, således at et flydende næringsmedium, som strømmer ind i en ende af celledyrkningsenheden 7

141 AOS

11, vil passere gennem kapillarrørene 12 og komme ud gennem den modsatte ende af enheden 11. Således vil et næringsmedium, som indføres på kammersiden af kapillarrørene 12, ikke undergå bulk-blanding med perfusatet. Separat perfusion af kammersiden af kapillarrørene via åbninger 15 uden blanding med perfusatet, som strømmer gennem kapillarrørene, er også mulig.

Der findes et reservoir 16 for perfuseringsmediet, idet indholdet fortrinsvis omrøres med sådanne midler som f.eks. en rørepind 17.

En lukket polyethylencylinder med en kapacitet på 80 ml er blevet anvendt med gode resultater. Næringsmediet passerer fra en komponent af systemet til en anden gennem silicongummirør eller andet passende rørmateriale, fortrinsvis med en udvendig diameter på ca. 3 mm.

Gasoverførsel til perfuseringsmediet sker ved hjælp af en oxygenator 18 eller et kunstigt lungeudstyr med en membran af silicongummi eller andet passende materiale til opnåelse af tilstrækkelig gasoverførsel til perfuseringsmediet. Der er til dette formål blevet anvendt en i handelen gående "Mini-Iung" fremstillet af Dow Corning Corporation. Enten luft-COg- eller oxygen-COg- blandinger kan anvendes til opnåelse af midler for såvel pOg- som pH-styring. Perfuseringsmediet bør udsættes for en passende blanding af CO2 i luft eller oxygen, før det pumpes gennem kapillarrørene 12 i celledyrkningsenheden 11. En blanding af 5% COg i luft har været benyttet. Gassen bør være fugtet, inden den kommer ind i gasudveksleren for at hindre for stort vandtab fra perfusatet.

Et pH-meter 19 er blevet tilsluttet i ledningen til opnåelse af en kontinuerlig on-line aflæsning af pH-værdier. En pumpe 20 frembringer passende perfusatstrømningshastigheder. Når celledyrkningsenhederne 11 anvendes i et parallelt arrangement, har det vist sig gunstigt at have et separat pumpehoved for hver celledyrkningsenhed til frembringelse af identiske strømningshastigheder gennem hver celledyrkningsenhed.

Kapillarrørene 12 kan være fremstillet af ethvert af en lang række semipermeable materialer. Disse muliggør celledyrkning i tre dimensioner, samtidig med at de gør det muligt for næringsmedium at diffundere gennem kapillarrørsvæggene 12 til ernæring af cellerne, me- UU09 8 dens celleprodukter diffunderer fra cellerne tilbage gennem kapillar-rørsvæggene 12 ind i perfusatet. Egnede materialer omfatter forskellige cellulosematerialer eller andre polymere materialer. Materialer, som er særlig velegnede, omfatter semipermeable celluloseacetatmem-braner med form som hule,rørformede fibre, såsom de hule fibre, der fremstilles af Dow Chemical Company, og de hule fibre af et polymert materiale, som fremstilles af Amicon Corporation, idet sådanne fibre er almindeligt anvendt til ultrafiltrering og dialyse. De hule fibre, som fremstilles af Dow Chemical Company, har typisk en indvendig diameter fra 180 til 200 mikron, en udvendig diameter på 230 til 250 mikron og er i stand til at muliggøre passage af molekyler med en molekylvægt op til ca, 30.000 gennem væggene. En type materiale fra Amicon Corporation har en større diameter og vægtykkelse og muliggør diffusion af stoffer med molekylvægte op til ca. 50.000.

En yderligere type kapillarrør, som kan anvendes, er fremstillet af et siliconpolycarbonatmeteriale. Sådanne materialer muliggør hurtig diffusion af gasser. Det er således ofte fordelagtigt at anvende kapillarrør af forskellige materialer i en enkelt celledyrkningsenhed, såsom en blanding af celluloseacetatkapillarrør og siliconpo-lycarbonatelementer, til forbedring af oxygengennemgangen fra perfusionsmediet ind i cellerne.

Kapillarrør overtrukket med collagen synes at muliggøre hurtigere celleformering ved enten at konditionere mediet eller tilvejebringe en yderligere matrix for celleunderstøtning mellem og på kapillarrørene .

Bundtet af kapillarrør 12 inden i celledyrkningsenheden danner en matrix, hvorpå cellerne har mulighed for at vokse. Der kan foretages variationer i kapillaropbygningen eller -sammensætningen med henblik på at begrænse størrelsen af molekyler, som diffunderer gennem kapillarrørsvæggen, og således tilvejebringe selektivitet med hensyn til komponenterne, som skal gøres tilgængelige for cellerne, eller produkterne, som skal fjernes.

Mediet, som anvendes til tilføring af næringsstoffer til cellevækst, kan være et hvilket som helst egnet materiale, som vil stille de næringsstoffer til rådighed, som cellerne kræver til vækst og/eller 141409 9 funktion. Yalget af medium vil generelt afhænge af den cellelinie, som anvendes på et bestemt tidspunkt.

Under drift indføres celler suspenderet i et næringsmedium på celledyrknings enheden 11*s kammerside gennem en åbning 15, og cellerne får lov til at sætte sig på kapillarrørene 12, som kontinuerligt perfuseres med et oxygeneret næringsmedium.

Hvert kapillarrør bør fortrinsvis have en diameter, som er lille nok til, at en gruppe i et bundt tilsammen vil få et så stort overfladeareal, at betydelige cellemængder kan dyrkes indenfor et lille volumen. Kapillarrørenes diameter bør i et sådant bundt være lille nok til, at en celle, som vokser på et vilkårligt af kapillarrørene, og som har nået grænsediffusionslængden for næringstilførelse og produktfjernelse, som opnås med det pågældende kapillarrør, derefter vil komme inden for påvirkningsradien for et eller flere tilstødende kapillarrør. Afstanden, til hvilken cellerne vil vokse, begrænses af den afstand, hvortil næringsstoffer eller toksiske produkter kan bevæge sig til eller fra cellen. Placering af mere end ét kapillarrør i nærheden af cellen forøger derfor næringsstoftilgængeligheden og affaldsfjernelsen, og chancen for overlevelse, vækst og cellefunktion forbedres således.

Kør arbejdet påbegyndes, steriliseres hele apparatet 10 med f.eks. ethylenoxid i 6 timer, udsættes for luft i fra en til to dage og gennemskylles derefter med sterilt næringsmedium i fra en til to dage til fjernelse af eventuelle restspor af ethylenoxid. Der kan arbejdes med apparatet 10 i en inkubator ved ca. 37°C og nær ved 100$ fugtighed.

Procedurerne ved dyrkning af celler med celledyrkningsenheden ifølge opfindelsen belyses ved hjælp af følgende eksempler.

Eksempel 1.

Tre i handelen gående T-formede rør indeholdende ca. 110 hule cel-luloseacetatfibre med en indvendig diameter på 200 mikron og en vægtykkelse på 25 mikron (Dow c/HFU-l/20 T-tube ultrafilter CA-C hollow fibers) blev anbragt parallelt som vist på fig. 1. Alt udstyr med undtagelse af pH-elektroden blev gassteriliseret i seks timer med 141409 10 ethylenoxid og derefter luftet i 48 timer. Spidsen af pH-elektroden, som skal være i berøring med perfusionsmediet, blev behandlet med 70$ ethanol i 2 timer. Apparatet blev derefter anbragt i en inkuba-tor, som blev holdt ved 37°C og nær ved 100$ fugtighed. Sterilt Eagle's 2 Basal Spinner-medium indeholdende 10$ kalvefosterserum, 30 mg/100 ml glutamin, 5,0 mg/100 ml streptomycin og 2,08 mg/100 ml penicillin, blev anbragt i reservoiret og cirkuleret gennem celledyrkningsenheden i 48 timer og blev derefter kasseret. Kammersiden - af hver celledyrkningsenhed blev også fyldt med samme type medium i dette tidsrum.

En samlet mængde på 220.000 L-celler fra mus (en underlinie af klon 929) blev suspenderet i 2 ml af samme type medium og derefter indført på den tømte kammerside af celledyrkningsenheden 48 timer senere. Åbningen blev derefter lukket. Perfusionsmediet blev på dette tidspunkt udskiftet ved fjernelse af mediet fra reservoiret og ved .at udskifte det med 80 ml friskt, varmt medium. Mediet blev derefter pumpet gennem hver enhed i en mængde på 0,3 ml pr. minut.

Der blev pr. minut ført ca. 1,5 liter 5$ C02 i luft til gasudveksleren, og pH-værdien blev holdt ved ca. 7,0. Efterfølgende mediumændringer blev foretaget hver anden dag i de første otte dage og derefter dagligt. Seks dage efter podning viste mikroskopisk undersøgelse af celledyrkningsenheden mange celleklumper med en diameter på ca. 200 mikron, medens kun et tyndt lag celler var fastgjort til glashuset. Iagttagelse på den 14. dag viste mange flere klumper med op til 600 mikron i diameter. En af celledyrkningsenhederne resulterede i en DNA-mængde, som er ækvivalent med ca. 17,3 x 10^ celler, efter to ugers vækst under anvendelse af Burton-fremgangsmåden. (Burton, K., Biochem.J., 62, p.315(1956)). Celleklumperne fortsatte med at vokse og nåede en diameter på ca. 800 mikron den 28. dag. Manipulering med celledyrkningsenhederne fjernede mange cellemasser fra bundtet, og de faldt ned på glashuset. Der blev imidlertid ikke dannet nogen klumper på glashuset.

Forsøget blev standset efter 29 dage. Kammersidemediet blev fjernet og erstattet med varm 4$ agarose. Efter afkøling blev begge ender af enheden brudt itu, og agaroseproppen indeholdende bundtet og cellerne blev fjernet.· Dele af bundtet blev fikseret og farvet med Hema= 11 141409 toxylin og Eosin. Der voksede celler både mellem og ovenpå kapillarrørene .

Samtidige prøver fra hus og perfusat viste,at pH, glucose- og lac-tatkoncentrationer var næsten ens.

Eksempel 2.

To "Dow c/HFU-1/20 T-tube ultrafilter CA-C hollow fiber units" blev anbragt parallelt som vist skematisk i fig. 1 og steriliseret i seks timer i ethylenoxid. Spor af ethylenoxid blev derefter fjernet ved luftning af systemet i to dage og derefter skylning af systemet med sterilt Ham's F-10 dyrkningsmedium (Gibco #155) indeholdende 13,5# hesteserum, 3,2# kalvefosterserum, 2,08 mg/100 ml penicillin og 5,0 mg/100 ml streptomycin i 2 dage, idet mediet derefter blev kasseret, luft indeholdende 5# COg blev ledt gennem gasudveksleren. Frisk medium blev derefter anbragt i reservoiret, og 2 ml af dette medium

C

indeholdende i alt 2 x 10 nyligt trypsinerede humane choriocarci-nomaceller (type JEG-l) (Kohler, P.O., and W.E. Bridson.-J.Clin.

Endocr.Metab.. 32. 5, p.683(1971)) blev indført på kammersiden af hver celledyrkningsenhed gennem kammeråbningen, som derefter blev lukket.

Mikroskopisk undersøgelse af celledyrkningsenheden under forsøget viste en gradvis forøgelse i antallet af celler fastgjort til kapillarrørene.

Perfusatet blev opsamlet og/eller erstattet periodisk i løbet af de følgende 40 dage og analyseret for glucose-, lactat- og HCG-(humant chorionisk gonadotropin)-indhold. Kurven i fig. 3 viser glucose-, lactat- og HCG-mængder i perfusatet under forløbet af forsøget. Glucosekoncentrationer blev målt under anvendelse af Worthington Biochemical Corporation "Glucostat"-reagens 7451 og den dertil hørende teknik. lactatkoncentrationer blev bestemt tander anvendelse af Boehringer Mannheim Corporation Test TC-B 15972 TLAA.

Radioimmunalyser (Odell, W.D., P.I. Rayford, G.T. Ross, J.Lab.Clin.

Med.. 70. p.973(1967)) viste, at HCG-koncentrationerne var betydeligt højere i kammersidemediet end i perfusatet. Dette skyldes sandsyn- 12

141 AOS

ligvis, at HCG kun moderat kan trænge gennem den anvendte type celluloseacetat. (Et bundt af kapillarrør, som muliggør gennemgang af større molekyler, skulle gøre det muligt for HCG og andre produkter med høj molekylvægt at blive fjernet hurtigere fra kammersidemediet.

Et sådant materiale er de hule fibre af XM-50 polymer fremstillet af Ami con Corporation, som er gennemtrængelige for molekyler med en molekylvægt op til ca. 50.000).

Perfusionsmediets stadigt voksende HCG-titer under den indledende 3 ugers periode viser muligheden for at fjerne et celleprodukt fra cellekulturen, uden at dennes levedygtighed forstyrres, og uden at man behøver at tage tilflugt til kostbare manipulationsprocedurer.

Eksempel 5.

En kombination af 30 nXM-50"-kapillarrør og 30 siliconpolycarbonat= kapillarrør blev anbragt i et glasrør med en indvendig diameter på 6 mm og en udvendig diameter på 8 mm og med to åbninger som vist i fig. 2.

Tætningsmidlet, som anvendtes til at holde bundtenderne i huset, var en blanding af 12 g flydende I,RT7-ll"-silicongummi fra General Electric og 8 g "Dow Corning 360 Medical Fluid" (en siliconholdig opløsning til fortynding af den flydende "GE RTY-ll"-silicongummi-• monomer) katalyseret af 1 dråbe Tenneco Nuocure 28-Nuodex (en stann-ooctoatkatalysator) ved stuetemperatur.

Derefter blev begge ender af kapillarrørsbundtet fastholdt tæt for at hindre tætningsmiddel i at trænge ind i kapillarrørene. En ende af enheden blev derefter anbragt i det katalyserede tætningsmiddel i 12-24 timer. Yed afslutningen af dette tidsrum blev det størknede forseglingsmiddel fjernet fra den ydre del af huset, og .bundtet blev skåret i flugt med enden af huset. Proceduren blev derefter gentaget til tætning af den anden del af kapillarrørsbundtet inden i huset.

Der blev anvendt en modifikation af fremgangsmåden ifølge Leighton et al (Leighton, et al., Supra.) til behandling af kapillarrørsbundterne som følger: UU09 13

En opløsning af 1 del collagendispersion (Ethicon, Inc., C14N-C150K

T.D. %29) i 4 dele deioniseret vand blev indsprøjtet på kammersiden i hver celledyrkningsenhed og fik lov til at forblive der natten over. De blev derefter lufttørret i 12 timer, gennemstrømmet med en opløsning af 50% methanol og 0,5% ammoniumhydroxid i deioniseret vand i 12 timer og derefter skyllet med deioniseret vand i 2 timer.

Fire celledyrkningsenheder blev behandlet på denne måde og blev med undtagelse af fraværet af pH-elektroden anbragt parallelt som vist i fig. 1.

Apparatet blev steriliseret i ethylenoxid i 6 timer, luftet i 1 dag og skyllet med medium MS 109 indeholdende 10% kalvefosterserum, 5 mg/100 ml insulin, 6,2 mg/100 ml cortisonacetat, 2,08 mg/100 ml penicillin og 5,0 mg/100 ml streptomycin i 1 dag, hvorefter mediet blev kasseret.

Mediet, som anvendtes til både perfusatet og cellesuspensionen, var Ham's F-10 som beskrevet i eksempel 2 med undtagelse af, at der tilsattes 5 mg/100 ml insulin, 6,2 mg/100 ml cortisonacetat og ca. 500 mg/100 ml glucose. 19 dage efter cellepodningen var glucosekoncentra-tionen ændret til ca. 100 mg/100 ml.

Reservoiret blev fyldt med ca. 100 ml frisk medium, som blev pumpet gennem hver celledyrkningsenhed med en hastighed på 0,7 ml pr. minut. Kammeret blev derefter fyldt med en suspension af ca, 1,5 x 10^ frisk trypsinerede JEG-7 humane choriocarcinomaceller (Kohier, et al, Supra.) pr. ml, hvorefter åbningerne blev lukket. Gaskoncentrationen, som førtes ind i oxygenatoren, var ca. 5% COg i luft.

Apparatet blev holdt nær ved 37°C og 100% fugtighed. Mediet i reservoiret blev udskiftet og/eller opsamlet hver anden til hver fjerde dag.

Cellemassen blev gradvis synlig for det blotte øje på kapillarrørsbundtet samtidig med, at hastigheden af HCG-produktionen gradvis voksede.

UU09 14

Eksempel 4.

To celledyrkningsenheder blev opbygget som beskrevet i eksempel 3, men blev ikke behandlet med collagen. De blev derefter anbragt parallelt som vist på fig. 1, men uden en pH-elektrode. Apparatet blev steriliseret i ethylenoxid i 6 timer, luftet i 2 dage og gen-nemskyllet med "MS 109" medium indeholdende 10$ kalvefosterserum, 2,08 mg/100 ml penicillin og 5,0 mg/100 ml streptomycin i 2 dage, hvorefter mediet blev kasseret.

Perfusatet og cellesuspensionsmediet var Ham's P-10 som beskrevet i eksempel 2.

Perfusatreservoiret blev fyldt med 100 ml Ham's P-10 medium, som derefter perfuserede hver enhed med en hastighed på 5 ml pr. minut.

g

Hvert kammer blev fyldt med en suspension indeholdende 1,8 x 10 JEG-7 humane choriocarcinomaceller pr. ml. Luft indeholdende ca.

2$ COg strømmede gennem oxygenatoren. Hele apparatet blev atter holdt nær ved 37°C og 100$ fugtighed. Cellemasserne på kapillarrørsbundterne voksede gradvis i størrelse og blev synlige for det blotte øje samtidig med, at hastigheden for HCG-produktionen steg som i eksempel 3.

Som det fremgår af de foregående eksempler, indebærer den foreliggende opfindelse mange fordele, idet den muliggør dyrkning af celler in vitro samtidig med, at den også muliggør udvinding af celleprodukter. Det er f.eks. unødvendigt at manipulere cellerne for at ændre næringsmediet, eftersom frisk tilførsel stilles til rådighed ved udskiftning af mediet i reservoiret. Opfindelsen muliggør styrede driftsbetingelser og muliggør optimalisering af cellevækst og -funktion. Det vil fremgå, at forskellige ændringer kan foretages vedrørende apparatet og fremgangsmåden, uden at man afviger fra opfindelsens ånd og rammer eller giver afkald på alle dens materielle fordele, idet de ovenfor beskrevne varianter blot er foretrukne udførelsesformer for opfindelsen.

Claims (6)

1A1409 15 Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til dyrkning og vedligeholdelse af levende menneskelige eller dyriske celler in vitro, kendetegnet ved, at den omfatter: (a) placering af flere kapillarrør i et kammer til efterligning af et vaskulært netværk, hvilke kapillarrør har vægge, som er gen-nemtrængelige for næringsmidler, som kræves til cellevækst, og for celleprodukter, som skal fjernes, og hvilke kapillarrør er placeret med de enkelte kapillarrør forløbende i det væsentlige indbyrdes parallelle i kammeret, hvorved kammeret ved hjælp af kapillarrørenes vægge deles i et indre kapillarrørsrum i kapillarrørene og et.ydre kammer uden for kapillarrørene, hvorved det indre kapillarrørsrum og kammeret uden for kapillarrørene kun er indbyrdes i forbindelse med hinanden yia kapillarrørenes vægge, hvorhos kapillarrørene er indbyrdes adskilte til frembringelse af et tilstrækkeligt stort kammer uden for kapillarrørene til muliggørelse af tredimensional vækst af et stort antal celler, idet kapillarrørene er placeret tilstrækkelig nær ved hinanden til, at enhver celle vil blive påvirket af perfusat, som passerer gennem i det mindste ét kapillarrør, (b) indføring af levende celler i kammeret uden for kapillarrørene, således at cellerne vil afsættes på kapillarrørene, og (c) gennemledning af perfusat gennem det intrakapillære rum,

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at celleprodukter, som passerer fra cellerne gennem kapillarrørenes vægge til perfusatet, udvindes.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes kapillarrør, hvoraf i det mindste nogle har væg- 16 UUOfi ge, som er gennemtrængelige for næringsmidler og celleprodukter med stor molekylvægt, og at i det mindste nogle af kapillarrørene har vægge, som er gennemtrængelige for gasser.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der benyttes kapillarrør, som har vægge fremstillet af forskellige semi-permeable materialer, af hvilke nogle er mere gennemtrængelige for gasser end andre.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at perfusatet oxygeneres, og at pH-værdien indstilles, før perfusatet føres gennem det intrakapillære rum.

6. Celledyrkningsenhed (il) til udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter (a) et hus (13), som har adskilte endedele (13a) og afgrænser et aflangt kammer mellem endedelene, (b) kapillarrør (12) til efterligning af et vaskulært netværk i kammeret, hvilke kapillarrør omfatter flere individuelle kapillarrør, som forløber i det væsentlige indbyrdes parallelle i huset (13) og for i det mindste nogles vedkommende har vægge, som er gennemtrængelige for næringsmidler og celleprodukter med stor molekylvægt samt for i det mindste nogles vedkommende har vægge, som er gennemtrængelige for gasser, hvorhos nævnte kammer ved hjælp af kapillar-rørenes (12) vægge deles i et indre kapillarrørsrum inden i kapillarrørene og et kammer uden for kapillarrørene, og det intrakapil-lare rum og kammeret uden for kapillarrørene kun er tilsluttet hinanden via kapillarrørenes vægge, og hvor kapillarrørene er indbyrdes adskilte til frembringelse af et tilstrækkeligt stort rum uden for kapillarrørene til muliggørelse af tredimensional vækst af et stort antal celler, idet kapillarrørene er tilstrækkelig nær ved hinanden til, at enhver celle vil blive påvirket af perfusat, som passerer gennem i det mindste ét kapillarrør, (c) midler, som er tilsluttet det intrakapillare rum til at lede perfusat derigennem, og