DE2319120A1

DE2319120A1 - Verfahren und vorrichtung zum zuechten von zellkulturen in vitro

Info

Publication number: DE2319120A1
Application number: DE2319120A
Authority: DE
Inventors: Bethesda, Md; Robert Lyle Dedrick; Pietro Michele Gullino; William Robert Kidwell; Richard Allan Knazek
Original assignee: Cellco Inc
Current assignee: Cellco Inc
Priority date: 1972-05-18
Filing date: 1973-04-16
Publication date: 1973-12-06
Also published as: NO135642C; DK141409B; DE2319120C2; DK141409C; NL7306659A; IT987281B; US3821087A; FR2184960B1; CH564086A5; DD103925A5; FR2184960A1; GB1395291A; BE799675A; NL162430B; JPS546634B2; NL162430C; SE386687B; NO135642B; AT325210B; JPS4941579A

Description

PATENTANWÄLTE
Dipl.-Ing. WERNER COHAUSZ · Dipl.-Ing. WILH ELM FLORACK · DipUng. RUDOLF KNAUF

4 Düsseldorf, Schumannsfraße 97 2319120

CELLCO, INC. ₁₅. _April

Bethesda, Maryland

U.S.A.

Verfahren und Vorrichtung zum Züchten von Zellkulturen in vitro

Die Erfindung -betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten von Zellkulturen in vitro, bei denen die Zellen sich auf einer halbdurchlässigen, rohrförmigen Membran ansiedeln, die im folgenden als Kapillare bezeichnet wird.

Bei Versuchen zur -Züchtung von Zellen in Kolonien, deren Dichte und/oder Struktur diejenige lebenden Gewebes erreicht, sind die verschiedensten Mittel zur Zufuhr von Nährstofflösungen zu den Zellen verwendet worden. Sehr hohe Zelldichten sind z.B. in Suspensionskulturen erhalten worden, obwohl nicht die Dichten lebender Gewebe erreicht wurden (Bryant, J.C. Ann.N.Y. Acad.Sci., 139> Art.l, Seite 143 (1966)). Auch die dreidimensionale Züchtung von Tumorzellen in dünnen Schichten in kleinen Stücken von Celluloseschwamm ist ausgeführt worden, eine Methode, die die Nährstoffzufuhr zu den Zellen zu begünstigen scheint und zugleich eine Stützmasse für das Zellwachstum liefert (Leighton, J., G.Justh, M. Esper, R.L. Kronenthal, Science 155, Seite 1259 (1967)). Bei Umspülungsmethodeη konnten Zelldicken bis zu etwa 17 Zellschichten erreicht werden (Kruse, Jr., P.Fi, L.N. Keen, W.L. Whittle, In Vitro, 6, 1, Seite 75 (1970)). Mit diesen bekannten Methoden lieflen sich

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0RK3INAL INSPECTEO

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jedoch organähnliche Strukturen in vitro nicht erzeugen. . -

Die Ergebnisse von Forschungen auf diesem Gebiet zeigten, daß bestimmte grundlegende Probleme gelöst werden müssen, um eine organähnliche struktur in vitro zu züchten. Das erste und offensichtlichste Problem besteht darin, daß die Bestandteile der Nährlösung durch die Zellschichten diffundieren müssen, um alle Zellen zu erreichen, und daß diese Diffusion um so schwieriger wird, je dicker die Zellschicht ist.

Ein zweites Problem bei der Züchtung einer organähnlichen Struktur in vitro kann die' Aufrechterhaltung einer geeigneten "Mikroumge.bung" bei einer herkömmlichen Zellkultur sein. Die Flüssigkeit in unmittelbarer Umgebung der wachsenden Zelle ändert mit fortschreitendem Zellstoffwechsel ständig ihre Zusammensetzung und wird nur schrittweise in den ursprünglichen Zustand zurückversetzt, wenn die Nährflüssigkeit ausgetauscht oder" als Ganzes umgerührt wird.

Ein drittes Problem scheint darin zu bestehen, daß das Vorhandensein eines Gitters oder geeigneten Materials notwendig ist, auf dem die organähnliche Struktur wachsen kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Lösung für die vorstehend skizzierten Probleme zu bieten und ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum Züchten von Zellen anzugeben, die folgendes bieten?

a) Nährstoffquellen innerhalb der Zellkolonie, die sowohl große als auch kleine essentielle Moleküle liefernj

b) Ableitungen innerhalb der Zellkolonie zur Entfernung von Stoff Wechselprodukten;

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c) eine geeignete Mikroumgebung;

d) ein Gitterwerk für das Wachstum in drei Dimensionen; und

e) eine Oberfläche für einschichtige und/oder mehrschichtige Zellkulturen, die im Verhältnis zu dem Volumen, das bei Standard-Zellkulturmethoden benötigt wird, verhältnismäßig groß ist.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß durch eine in einer Kammer angeordnete, für zum Wachstum der Zellen benötigte Nährstoffe durchlässige Kapillare eine Nährstofflösung geleitet und in die Kammer eine lebende Zellen enthaltende Nährstoff lösung so eingeführt wird, daß die Zellen sich auf der Kapillare ansiedeln.

Bei der vorliegenden Erfindung werden also zu Beginn Zellen, die in einer Nährlösung suspendiert sind, auf der Außenseite von Kapillaren angesiedelt, durch die kontinuierlich eine mit Sauerstoff beladene Nährlösung strömt. Nährstoffe diffundieren aus dem Strömungsmedium durch die Kapillarwand in die Zellen, während Stoffwechselprodukte der Zellen, z.B. Milchsäure und Hormone, aus der Zelle durch die Kapillarwand in die strömende Flüssigkeit übergehen. Diese Produkte können dann in geeigneter Weise gewonnen werden.

Gemäß der Erfindung kann eine Einrichtung aufgebaut werden, die mindestens aus einer Zellkultureinheit., einem Vorratsbehälter für die Nährlösung,, einer Begasungsvorrichtung, einem pH-Meßgerät und einer Pumpe zur Förderung der Lösung mit einer bestimmten DurchflußmengeiT Günstige Konzentrationsgefälle lassen die Nährstoffe durch die Wände der Kapillaren in die

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Zellen diffundieren,, während die Zellprodukte in das Perfusat diffundieren. Das Zellwachstum kann mit Hilfe einer der folgenden Methoden bestimmt werden:

1.

a) Behandlung der Kapillarbündel mit Trypsin und nachfol- gendes Zählen "der Zellen;

b) mikroskopische Untersuchung fleckiger Abschnitte,der Bündel; · '

c) Messung der Zellbestandteile oder -produkte; oder

d) Bestimmung des Verbrauchs von Nährstoffen und/oder •Markierungsmitteln.

•Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung neben der Züchtung von Zellen besteht darin, daß aus der an den Kapillaren wachsenden Zellkultur Produkte gewonnen werden'können, während.die Kultur selbst ungestört bleibt. Zu Beispielen dieser Produkte gehören Hormone und andere biologische Stoffe, die bisher nach Standardmethoden aus lebendem Gewebe oder Exkreten gewonnenworden sind.

Anhand der Zeichnungen wird die Erfindung veranschaulicht. Es zeigen? . .

Pig. 1 eine schematische Darstellung einer Einrichtung zum Züchten von Zellen auf Kapillaren gemäß vorliegender Erfindung!

Fig. 2 einen Aufriß einer Zellkultureinheit gemäß vorliev. ,^gender Erfindung; und . ■

Pig*· 3 :.·---- eiü..Diagramm, in dem die Konzentration der verschie-.

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denen Stoffe.in dem Perfusat des Vorratsbehälters 'über der Zeit aufgetragen ist.

Bei der in den Figuren 1 und 2 dargestellten Ausführungsform der Erfindung ist 10 die Einrichtung zum Züchten von Zellen auf Kapillaren. Die Einrichtung 10 umfaßt eine oder mehrere Zellkultureinheiten 11, die jeweils mindestens eine Kapillare 12 aus halbdurchlässigem Material enthalten. Wenn mehrere Zellkultureinheiten 11 verwendet werden, können diese Einheiten parallel, wie in Fig. 1 dargestellt, oder in Reihe angeordnet werden. In jeder Zellkultureinheit 11 ist vorzugsweise eine Mehrzahl von Kapillaren 12 untergebracht. Eine solche Mehrzahl von Kapillaren, die zusammen ein Bündel bilden, ergibt ein System, das das Gefäßnetz eines lebenden Gewebes simuliert. Die Kapillaren 12, die typischerweise eine Länge von 75 bis 100 mm haben, sind in einer Ummantelung 1> eingesetzt, die aus Glas oder einem ähnlichen inerten Material besteht, und die Enden der Kapillaren 12 sind an jedem Ende der Ummantelung 15 in Endstücken 14 aus Epoxyharz oder einem anderen geeigneten Dichtungsmaterial befestigt, so daß eine an einem Ende in die Zellkultureinheit 11 eingeleitete Nährlösung durch die Kapillaren 12 ist und am anderen Ende der Einheit

11 wieder austritt. Eine auf der Mantelseite der Kapillaren

12 eingeleitete Nährlösung kann sich daher nicht en masse mit dem Perfusat mischen. Eine separate Perfusion auf der Mantelseite durch die öffnungen 15 ohne en-masse-Mischung mit dem durch die Kapillaren fließenden perfusat ist ebenfalls möglich.

Zur Aufnahme des Perfusionsmittels ist ein Vorratsbehälter 16 vorgesehen, dessen Inhalt vorzugsweise mit einem Propellerrührer gerührt wird. Mit guten Ergebnissen ist hierzu ein geschlossener Polyäthylenzylinder mit einem Fassungsvermögen

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von 8O cnr benutzt worden. Die Nährlösung strömt von einem ,Teil des Systems zu einem anderen durch Schläuche aus Silicongummi oder einem geeigneten anderen Schlauchmaterial, wobei die Schläuche vorzugsweise einen Außendurchmesser von etwa 3 mm haben. " . .

Die Begasung der Perfusionsflüssigkeit wird durch einen Begaser 18 oder eine künstliche Lunge mit einer Membran aus Silicongummi oder einem anderen geeigneten Material zur Übertragung einer ausreichenden Gasmenge in die perfusionsflüssigkeit bewirkt. Für diesen Zweck ist eine im Handel erhältliche Minilunge der Dow Corning Corporation benutzt worden. Zur Regulierung des Sauerstoff-Partialdruckes und des pH-Wertes können entweder Luft-COu- oder Sauerstoff-CCU-Gemische verwendet werden. Vor dem Pumpen durch die Kapillaren 12 der Zellkultureinheiten 11 muß die Perfusionsflüssigkeit einem geeigneten Gemisch- von COp in Luft oder Sauerstoff ausgesetzt werden. Verwendet worden ist ein Gemisch von 5$ CO₂ in Luft. Das Gas muß vor dem Eintritt in den Begaser befeuchtet werden, um übermäßige Wasserverluste des Perfusats zu vermeiden.

In die zu den Zellkultureinheiten 11 führende Leitung ist ein pH-Meßgerät.19 eingeschaltet, das kontinuierlich die pH-Werte der Lösung anzeigt. Eine Pumpe 20 sorgt für einen geeigneten Perfusatdurchsatz. Wenn die' Zellkultureinheiten 11 in paralleler Anordnung zusammengeschaltet sind, hat es sich als zweckmäßig erwiesen, daß für jede Zelleinheit ein eigener Pumpenkopf zur Verfügung steht, damit bei allen Zellkultureinheiten identische Durchflußmengen gewährleistet sind.

Die Kapillaren 12 können aus einer Vielzahl halbdurchlässiger Stoffe.gefertigt sein. Diese ermöglichen das Zellwachstum in drei Dimensionen und gestatten zugleich, eine Diffusion der

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Nährstoffe durch die Kapillarwände 12 zur Ernährung der Zellen sowie eine Diffusion der Zellstoffwechselprodukte aus den Zellen durch die Kapillarwände 12 in das Perfusat. Geeignete Werkstoffe umfassen verschiedene Cellulose-oder andere polymere Materialien. Zu besonders geeigneten Materialien gehören halbdurchlässige Celluloseacetat-Membrane, die zu hohlen, schlauchförmigen Fasern verarbeitet sind, wie beispielsweise die von der Dow Chemical Company hergestellten Hohlfasern oder die von der Amicon Corporation hergestellten Hohlfasern aus einem polymeren Material. Derartige Fasern werden vielfach bei der Ultrafiltration und Dialyse verwendet. Die von der Dow Chemical Company hergestellten Hohlfasern haben typischerweise einen Innendurchmesser von 180 bis 200 /un, einen Außendurchmesser von 230 bis 250jam und lassen Moleküle mit einem Molekulargewicht bis zu etwa 30000 durch die Wände hindurchtreten. Ein Material der, Amicon Corporation hat einen größeren Durchmesser und eine stärkere Wanddicke und gestattet die Diffusion von Substanzen mit einem Molekulargewicht bis zu etwa 50000. ■

Ein weiterer Typ von Kapillaren, der verwendet werden kann, ist aus einem Siliconpolycarbonat hergestellt. Dieses Material erlaubt die rasche Diffusion von Gasen. Es ist daher oft vorteilhaft, Kapillaren aus verschiedenen Materialien innerhalb ein und derselben Zellkultureinheit, z.B. einer Mischung vpn Celluloseacetat-Kapillaren und Silicönpolycarbonat-Kapillaren, zu verwenden, um den Übergang von Sauerstoff aus der Perfusionslösung in die Zellen zu verbessern. .

Kapillaren mit einem Überzug aus Kollagen scheinen entweder durch Konditionierung der Nährlösung oder durch Bildung einer zusätzlichen Matrix für die Zellenhalterung zwischen und auf den Kapillaren eine besonders rasche Zellenproliferation zu gestatten.

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Die Bündel von Kapillaren 12 in Jeder Zellkultureinheit bilden eine Matrix, an der die Zellen wachsen können. An der Kapillarstruktur oder -zusammensetzung können Änderungen vorgenommen werden, um die Größe der Moleküle: zu begrenzen, die durch die Kapillarwand diffundieren, und auf diese Weise eine Selektivität der Komponenten, die den Zellen -zur Verfügung gestellt werden, oder der Produkte, die entfernt werden, zu erzielen.

Die Nährlösung zur Versorgung der Zellen mit Nährstoffen kann jede geeignete Zusammensetzung haben, die den Zellen die Nährstoffe darbietet, die sie für ihr Wachstum und/oder ihre Funktion benötigen, im allgemeinen hängt die Wahl der Nährlösung von der Zellreihe ab, die zu einer bestimmten Zeit verwendet wird.

Bei der Benutzung werden Zellen, die in einer Nährlösung suspendiert sind, durch eine Öffnung 15 in die Mantelseite der Zellkultureinheit 11 eingeführt und sich auf den Kapillaren 12, die kontinuierlich von einer sauerstoffbeladenen Nährlösung durchflossen werden, ansiedeln gelassen.

Jede kapillare soll vorzugsweise einen Durchmesser haben, der so klein ist, daß eine zu einem Bündel vereinigte Gruppe eine · so große Oberfläche bietet, daß eine erhebliche Anzahl von Zellen auf kleinem Raum wachsen kann. Der Durchmesser der Kapillaren muß so klein sein, daß nach deren Bündeln eine Zelle, die an einer der Kapillaren wächst und die Grenzlänge für die Diffusion von Nährstoffen sowie den Abtransport von Stoffwechselprodukten durch diese Kapillare erreicht hat, dann in den Einflußbereich einer oder mehrerer benachbarter Kapillaren~ gelangt. Die Tiefe, bis zu der Zellen wachsen, wird durch die Entfernung begrenzt, bis zu der Nährstoffe oder toxische Pro-

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dukte zu oder von den Zellen wandern können. Dadurch, daß mehrere Kapillaren in der Nähe einer Zelle vorgesehen sind, werden das Angebot an Nährstoffen und die Entfernung von Stoffwechselprodukten erhöht und die Chancen für das Überleben, das Wachstum und die Funktion der Zelle verbessert.

Vor der Inbetriebnahme wird die gesamte Einrichtung 10 sterilisiert, z.B. durch 6-stündiges Durchleiten von Äthylenoxid, danach 1 bis 2 Tage der Luft ausgesetzt und dann 1 bis 2 Tage mit steriler Nährlösung gespült, um restliche Spuren von Äthylenoxid zu entfernen. Die Einrichtung 10 kann in einem Brutschrank bei etwa 37 ⁰C und nahezu 100$ Luftfeuchtigkeit betrieben werden.

Anhand"folgender Beispiele wird das Verfahren zum Züchten von Zellen gemäß vorliegender Erfindung veranschaulicht,

Beispiel 1

Drei im Handel erhältliche T-Rohre, die etwa 110 Celluloseacetat-Hohlfasern mit einem Innendurchmesser von 200 «m und einer Wanddicke von 25^m (Dow-c/HFU-l/^Q-T-Rohr-ültrafilter-CA-C-Hohlfasern) wurden, wie in Fig. 1 dargestellt, parallel angeordnet. Die gesamte Einrichtung mit Ausnahme der pH-Elektrode wurde 6 Stunden mit Äthylenoxid'-Gas sterilisiert und dann 48 Stunden gelüftet. Die mit der Perfusionslösung in Berührung kommende Spitze der pH-Elektrode wurde 2 Stunden mit 7Q#igem Äthanol behandelt, Die Einrichtung wurde dann in einem Brutschrank untergebracht, der auf 37 ⁰C und nahezu 100$ Luftfeuchte gehalten wurde. In den Vorratsbehälter wurde sterile basale Spinner-Lösung gefüllt, die 1Q# fetales Kalbserum, 30 mg-# Glutamin, 5,0 mg-# Streptomycin und 2,08 mg-$ Penicillin enthielt, 48 Stunden durch die Zellkultureinheiten

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zirkuliert und dann verworfen. Die Mantelseite der Zellkultureinheiten wurde ebenfalls während einer gleich langen Zeitspanne mit der gleichen Lösung gefüllt.

Eine Gesamtmenge von 220000 Mäuse-L-Zellen (eine Abart von Clone 929) wurde in 2 ml der gleichen Lösung suspendiert und ", nach 48 Stunden in die entleerte Mantelseite der Zellkultureinheiten eingefüllt. Die öffnung wurde dann verschlossen. Gleichzeitig wurde die Perfusionslösung aus dem Vorratsbehälter entfernt und durch 80 cm- einer frischen, warmen Lösung ersetzt, Die Lösung wurde dann mit' einer Durchf!^geschwindigkeit von 0,3 ml/min durch jede Einheit gepumpt. Dem Begaser wurden etwa 1,5 l/min Luft mit 5$ CQg zugeführtV und der pH-Wert wurde auf etwa 7,0 gehalten. In den ersten 8 Tagen wurde die Lösung ein über den anderen Tag und danach.taglich ausgetauscht, β Tage nach dem Angetüen der Kulturen zeigte eine.mikroskopische Betrachtung der zeiikultweinheiten zahlreiche zellklumpen von etwa 200 /w Durchmesser, während an dem Glasmantel nur eine dünne Zellgehicht haftete, line Beobachtung am Ik, Tag zeigte noch viel mehr Zellklumpen bis zu 600^m Durchmesser, line der Zellkultureinheiten ergab naqh 2 Wochen Wachstum, bei der Bestimmung nach der Methode von Burton (Burton, Kv, BiQchem.J,, 62, Seite 315 (I95§))§ine DNS-Menge entsprechend 17,3 * 1©^ Zellen, Die zjeliennestei' wuehitn weiter und erpeichteß am ^ 28, Tag einen Durchmesser von etwa 800ßm. Beim Manipulieren der Zellkultureinheiten lösten sieh mehrere Ze!lmas.sen von dem Bündel und'fielen auf den Glasmantel, Es bildeten sieh jedobh keine Nester an dem Glasmantel,

Nach 29 Tagen wurde der versuch beendet, Die manteiseitige Lösung wurde entfernt und dwoh warme 4^ige Aiaroselgisiung ersetzt. Nach dem Abkühlen wurden beide Enden der Einheit aufgebrochen und der das Bündel und die Zellen enthaltende

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Agarosestopfen herausgenommen. Schnitte des. Bündels wurden fixiert und mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Zellen wüchsen sowohl zwischen als auch auf den Kapillaren.

Gleichzeitig entnommene Proben von Mantel- und Perfusatlösungen zeigten nahezu gleiche pH-Werte sowie gleiche Glucose- und Lactatkonzentrationen.

Beispiel 2

Zwei Dow-c/HFU-l^Q-T-Rohr-Ultramter-CA-C-Hohlfasereinheiten wurden, wie in Fig. 1 dargestellt, parallel angeordnet und 6 Stunden mit Ä'thylenoxid sterilisiert. Spuren des Äthylenoxids wurden anschließend durch 2-tägige Belüftung und 2-tägiges Spülen des Systems mit steriler Hamacher Kulturlösung F 10, die 13,5$ Pferdeserum, 3,2^ fetales Kalbserum, 2,08 mg-% Penicillin und 5,0 mg-# Streptomycin enthielt, entfernt. Nach dem Spülen wurde die Lösung verworfen. Dem Begaser wurde Luft mit einem Gehalt von 5$ CO₂ zugeführt. In den Vorratsbehälter wurde dann frische Lösung eingefüllt,, und in die Mantelseite einer jeden Zellkultureinheit wurden 2 cnr der Lösung eingefüllt, die insgesamt 2 χ 10 frisch mit Trypsin behandelte . menschliche Chorioncarcinomzellen (Typ JEG-I) enthielten (Kohler, P.O., und W.E. Bridson, J.Clin.Endocr.Metab., 32, 5 Seite 683 (1971))· Die öffnungen wurden dann verschlossen.

Die mikroskopische Beobachtung der Zellkultureinheit zeigte eine graduelle Zunahme der Anzahl der an den Kapillaren haftenden Zellen.

Während der folgenden 40 Tage wurden periodisch von den Perfusatproben entnommen bzw. wurde dieses periodisch ersetzt und auf den Gehalt an Glucose, Lactat und HCG (menschliches

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Choriongonadotropin) analysiert. Das Diagramm der Fig. 3 zeigt den Verlauf der Glucose-, Lactat- und HCG-Konzentration des Perfusats während des Versuchs, Die Glucosekonzentration wurde mit Hilfe des "Glucostat"-Reagenzes 7451 und der Methode der Worthington Biochemical Corporation bestimmt. Die Lactatkonzentration wurde nach dem Verfahren TC-B 15972 TLAA der Firma Boehringer, Mannheim., bestimmt.

Radioimmunanalysen (Odell, W.D., P.L. Rayford, G.T. Ross, J.Lab.Clin.Med.\, 70 (1967), Seite 973)zeigten, daß die HCG-Konzentration in der mantelseitigen Lösung erheblich höher als in dem Perfusat war. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß der verwendete Celluloseacetat-Typ für das HCG, nur mäßig durchlässig war (Ein Bündel aus Kapillaren, das den Durchgang größerer Moleküle gestattet, dürfte eine leichtere Entfernung von HCG und anderen hochmolekularen Produkten aus der mantelseitigen iösung ermöglichen. Ein solches Material ist die von der Amicon Corporation hergestellte polymere Hohlfaser XM-50, die für Moleküle mit einem Molekulargewicht bis etwa 50000 durchlässig ist.).

Der ständige Anstieg des HCG-Titers der Perfusatlösung in den ersten 3 Wochen zeigt die Leichtigkeit der Entfernung eines Zellproduktes aus der Zellkultur ohne Störung ihrer Lebensfähigkeit oder Zuhilfenahme aufwendiger Manipuliermethoden.

Beispiel 3

In ein Glasrohr von β mm Innendurchmesser und 8 mm Außendurchmesser mit zwei öffnungen, wie in Fig..2 dargestellt, wurde eine Kombination von 30 XM-50-Kapillaren und 30 Siliconpolycarbonat-Kapillaren eingesetzt.

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Das Dichtungsmittel zur Befestigung der Bündelenden in der Ummantelung war eine Mischung von 12 g flüssigem Siliconkautschuk RTV-Il der General Electric und 8 g Medical Fluid 5βθ der Dow Corning, katalysiert durch einen Tropfen Nuocure 28-NuDdex von Tenneco bei Raumtemperatur.

Beide Enden des Kapillar bunde Is wurden fest zusammengeschnürt, um ein Eindringen des Dichtungsmittels in die Kapillaren zu verhindern. Ein Ende der Einheit wurde dann 12 bis 24 Stunden in das katalysierte Dichtungsmittel eingetaucht. Nach Ablauf dieser Zeitspanne wurde das ausgehärtete Dichtungsmittel von der Außenseite des Mantels entfernt, und das Bündel wurde auf bündigen Abschluß mit dem Mantelende geschnitten. Das Verfahren wurde dann zur Abdichtung des anderen Endes des Kapillarbündels in der Ummantelung wiederholt.

Zur Behandlung der Bündel wurde eine Modifikation des Verfahrens von Leighton und Mitarbeitern (Lelghton, et al., Supra.) angewendet:

Eine Lösung von einem Teil Kollagendispersion (Ethicon,Inc., Cl4N-C15OK,T.D. Nr. 29) in deionisiertem Wasser wurde in die Mantelseite einer jeden Zellkultureinheit eingespritzt und über Nacht stehengelassen» Danach wurden sie 12 Stunden getrocknet, 12 Stunden mit einer Lösung von 50% Methanol und 0,5% Ammionak in deionisiertem Wasser gespült und dann 2 Stunden mit deionisiertem Wasser gewaschen.

In dieser Weise wurden 4 Zellkultureinheiten behandelt und mit Ausnahme der Abwesenheit einer pH-Elektrode parallelgeschaltet, wie in Fig. 1 dargestellt.

Die Einrichtung wurde 6 Stunden mit Äthylenoxid sterilisiert,

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einen Tag belüftet und dann einen Tag mit einer Lösung MS 109 gespült, die 10$ fetales Kalbserum, 5 mg-$ Insulin, 6,2 mg-# Cortisonacetat, 2,08 mg-$ Penicillin und'5,0 mg-# Streptomycin enthielt. Danach wurde die Lösung verworfen.

Die als Perfusat und zur Zellsuspension verwendete Lösung war die in Beispiel 2 beschriebene Hajftnische Lösung P-IO, der noch 5 mg-# Insulin, 6,2 mg-$ Cortisonacetat und etwa 500 mg-# Glucose zugesetzt wurden. 19 Tage nach dem Ansetzen der Zellkultur wurde die Glucosekonzentration auf etwa 100 mg-# herabgesetzt.

Der Vorratsbehälter wurde mit etwa 100 cnr der frischen Lösung gefüllt, die mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,7 cm /min durch jede Zellkultureinheit gepumpt wurde. Die Mantelseite wurde dann mit einer Suspension von etwa 1,5 χ 10 frisch mit Trypsin behandelten menschlichen Chorioncarcinomzellen vom Typ JEG-7 (Kohler et al, Supra.) je Milliliter gefüllt, worauf die öffnungen verschlossen wurden. Der Begasungsvorrichtung wurde Luft mit einem Gehalt von etwa 5$ CO₀ zugeführt.

C.

Die Einrichtung wurde auf nahezu 37 ⁰C und 100$ Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Lösung in dem Vorratsbehälter wurde alle 2 bis h Tage ersetzt und untersucht, oder es wurden zur Untersuchung Proben entnommen.

Die Zellmasse wurde allmählich auch mit unbewaffnetem Auge sichtbar, während die Geschwindigkeit der HCG-Produktlon allmählich anstieg.

Beispiel 4

Zwei Zellkultureinheiten wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, aufgebaut, aber nicht mit Kollagen behandelt. Sie wurden

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dann parallelgeschaltet, wie in Fig. 1 dargestellt,.jedoch ohne Verwendung einer pH-Elektrode. Die Einrichtung wurde 6 Stunden mit Ethylenoxid sterilisiert, 2 Tage belüftet und 2 Tage mit einer Lösung MS 109 gespült, die 10$ fetales Kalbserum, 2,08 mg-$ Penicillin und 5,0 mg-$ Streptomycin enthielt. Danach wurde diese Lösung verworfen. Als Perfufeat und ZeIlsuspensionsmedium wurde die in Beispiel 2 beschriebene Harmsehe Lösung P-IO verwendet.

Der Perfusatvorratsbehälter wurde mit 100 cnr Ha^mscher Lösung P-10 gefüllt, das mit einer Geschwindigkeit von 5 cnr/min durch jede Einheit perfundiert wurde. Jeder Mantelraum war mit einer Suspension gefüllt, die 1,8 χ 10 menschliche Chorioncarcinomzellen vom Typ JEG-7 je Milliliter enthielt. Durch den Begaser strömte Luft mit einem Gehalt von etwa 2% COp. Die gesamte Einrichtung wurde wieder auf nahezu 37 ⁰C und 100$ Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Zellmassen an den Kapillarbündeln nahmen allmählich an Größe zu und wurden wie in Beispiel 5 auch mit dem. unbewaffneten Auge sichtbar, während die Geschwindigkeit der HCG-Produktion anstieg.

Wie aus vorstehenden Beispielen ersichtlich, bietet die Erfindung zahlreiche Vorteile beim Züchten von Zellen in vitro und der Gewinnung von Zellprodukten. Beispielsweise ist es unnötig, die Zellen zu manipulieren, um die Nährlösung auszutauschen, da frische Nährstoffe durch Auswechslung der Lösung in dem Vorratsbehälter zur Verfügung gestellt werden können. Die vorgeschlagene .Einrichtung ermöglicht das Arbeiten unter kontrollierten Betriebsbedingungen und die Optimierung von Zellwachstum und Zellfunktion.

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Claims

; Υ4 13.4.1973 -

Ansprüche 2313120

m.Verfahren zum Züchten von Zellkulturen in vitro, dadurch ' gekennzeichnet, daß durch eine in einer Kammer angeordnete,, für zum Wachstum der Zellen benötigte Nährstoffe durchlässige Kapillare eine Nährstofflösung geleitet und in die Kammer eine lebende Zelle enthaltende Nährstofflösung so eingeführt wird, daß die Zellen sich auf der Kapillare ansiedeln.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mehrzahl von Kapillaren im wesentlichen parallel zueinander so angeordnet wird, daß das Zellwachstum an mindestens einer Kapillare von den durch die Wand mindestens einer anderen Kapillare diffundierenden Nährstoffen beeinflußt wird.
3. Verfahren nach Anspruch·! oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung vor dem Durchgang durch die Kapillare mit Sauerstoff beladen und auf einen bestimmten pH-Wert eingestellt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß eine Kapillare aus einem Material verwendet wird, das auch für Zellprodukte durchlässig ist, so daß die Zellprodukte aus der Zelle durch die Kapillarwand in die Nährlösung in der Kapillare diffundieren und aus dieser Nährlösung gewonnen werden können.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die den Enden der Kapillaren benachbarten Teile der Kammer so abgedichtet werden, daß eine in den die Kapillare umgebenden Kammerraum eingefüllte Nährlösung im wesentlichen stationär bleibt, während ein separater Strom von Nährlösung durch die Kapillare fließt.

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U/Be

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6. Einrichtung zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Kammer (13) mit einer Öffnung an jedem Ende,, einem in der Kammer (IJ) angeordneten Kapillarelement (12), dessen Endteile (14) sich an den Enden der Kammer befinden und dessen Wände für zum Zellwachstum benötigte Nährstoffe durchlässig sind, und Vorrichtungen (l6, 20) zur Forderung einer Nährlösung, durch das Kapillarelement (12).
7. Einrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Kapillarelement (12). aus einer Mehrzahl einzelner Kapillaren besteht, die im wesentlichen parallel zueinander angeordnet sind.
8. Einrichtung nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillaren so nahe beieinander angeordnet sind, daß das Zellwachstum an mindestens einer Kapillare von der durch mindestens eine andere Kapillare fließende Nährlösung beeinflußt wird.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die den Enden des Kapillarelements (12) benachbarten Teile der Kammer (13) abgedichtet sind, so daß eine in den das Kapillarelement (12) umgebenden Raum der Kammer (IJ) eingefüllte Nährlösung im wesentlichen stationär bleibt, während ein separater Strom von Nährlösung durch das Kapillarelement (12) fließt.
10. Einrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Wände des Kapillarelements (12) auch für Zellprodukte durchlässig sind.
11. Einrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch ge-

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kennzeichnet, daß mehrere aus einer Kammer (13) und einem Kapillarelement (12) bestehende Zellkultureinheiten (11) . zusammengeschaltet sind. .
12. Einrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,, daß die Zellkultureinheiten (11) parallelgeschaltet sind.
13.Einrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkultureinheiten (11) in Reihe geschaltet sind.
14. Einrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Vorrichtung '(1.Q) zur Begasung
der Nährlösung mit wünschenswerten Konzentrationen von
Sauerstoff und Kohlendioxid enthält.

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