DE68907153T2

DE68907153T2 - Zellkultur-Gerät.

Info

Publication number: DE68907153T2
Application number: DE89114831T
Authority: DE
Inventors: Bruce P Amiot
Original assignee: Endotronics Inc
Current assignee: Endotronics Inc
Priority date: 1988-08-10
Filing date: 1989-08-10
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 2009-08-11
Also published as: EP0356785B1; JPH02107183A; AU3924089A; KR970008216B1; DE68907153D1; CA1315232C; AU622921B2; KR900003359A; US5079168A; ATE90723T1; EP0356785A1

Description

Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen in vitro. Inbesondere betrifft sie eine kompakte, leicht zusammenbaubare Zellkultur-Vorrichtung, die mindestens eine Hülle aufweist, deren Inneres einen Zellkulturraum definiert, wobei die Hülle spiralförmig um einen länglichen Kern aufgewickelt ist. Die Erfindung betrifft in noch höherem Maße eine Zellkultur-Vorrichtung, die einfach im Aufbau ist, aber doch eine wirkungsvolle Gaszufuhr und Abfuhr in und aus dem Zellkulturraum ermöglicht, um unabhängig von der Nährstoffmediumversorgung und -Entsorgung zu sein, wodurch größere Mengen an Sauerstoff für die Zellen bei einem höheren Umsatz bereitgestellt werden, um Zellen und/oder Zellprodukte wirtschaftlicher und mit höherer Ausbeute zu erzeugen.
Die Kultivierung lebender Zellen in vitro wird für eine Vielzahl von Zwecken ausgeführt, einschließlich der Herstellung von Virusimpfstoffen, der Rückgewinnung wertvoller Nebenprodukte des Zellstoffwechsels und der Herstellung gewebeähnlicher Derivate zur Erzeugung künstlicher Organe.
Es gibt beim Züchten lebender Zellen in vitro einige Probleme, um dichte Zellmassen zu erzeugen. Erstens müssen individuelle Komponenten des Nährstoffmediums durch die Zellschichten diffundieren, um alle Zellen zu erreichen. Dieses wird mit zunehmender Dicke der Zellschicht zunehmend schwieriger.
Zweitens ist die Aufrechterhaltung einer geeigneten Umgebung für das Zellwachstum schwierig, da sich die in unmittelbarer Nachbarschaft einer wachsenden Zelle befindliche Flüssigkeit fortlaufend mit dem Zellstoffwechsel ändert, und zu ihrem Ausgangszustand nur in stufenartiger Form zurückkehrt, wenn der Nährstoff gewechselt oder in Massen aufgebracht wird.
Drittens wird ein Gitter oder ein geeignetes Material benötigt, um darauf einige Zellarten wachsen zu lassen.
Verschiedene Vorrichtungsarten und Verfahren wurden auf diese Anforderungen hin entwickelt. Ein Verfahren beinhaltet das Aufbringen und Wachsenlassen von Zellen auf der Innenoberfäche von Kunststoff- oder Glaswalzröhren oder Flaschen, wie es in dem U.S Patent Nr. 3,450,598 offenbart ist. Ein anderes Verfahren beinhaltet das Aufbringen von Zellen auf die ebene Fläche eines stationären Behälters wie z.B. auf Petrischalen oder rechteckig geformte Kulturplatten. Die ebenen Flächen können eine auf der Oberseite der anderen in einer Abstand haltenden Anordnung, wie in U.S. 3,843,454 offenbart, gestapelt werden.
Die Verwendung von Hohlfasern oder synthetischen Kapillaren wurde erst in letzterer Zeit als eine Unterstützungsmatrix für die Vermehrung von Zellen offenbart. Beispielsweise offenbaren die U.S. Patente Nr. 3,821,087; 3,883,393; 4,184,922; 4,200,689; 4,206,015 und 4,220,725, alle für Knazek und Andere, verschiedene Vorrichtungen und Verfahren für das in vitro- Wachstum von Zellen auf halbdurchlässigen röhrenförmigen Membranen oder Kapillaren, wobei den Zellen zuerst erlaubt wird, sich an den äußeren Oberflächen der Kapillarwände in einem Nährstoffmedium festzusetzen. Die Nährstoffe diffundieren aus dem Spülmedium durch die Kapillarwände und werden von den Zellen aufgebraucht. Die Zellprodukte diffundieren aus den Zellen aus, durch die Kapillarwände hindurch und in das Spülmedium (Perfusat) hinein, aus dem die Zellprodukte dann gewonnen werden können.
Die U.S. Patente Nr. 4,184,922 und 4,200,689 offenbaren Zellkultur-Vorrichtungen, die ein einzelnes Faserbündel aufweisen, wobei einige der Fasern zu einem Spülkreislauf verbunden sind und die verbleibenden Fasern zu einem zweiten Spülkreislauf verbunden sind. Die Druckdifferenz zwischen den zwei Kreisläufen erzeugt eine Konvektionströmung des Perfusats innerhalb des extrakapillaren Raums und verbessert dabei die Nährstoffverteilung für die wachsenden Zellen.
In dem U.S. Patent Nr. 4,220,725 ist ein Kapillarbündel, auf dem Zellen wachsen dürfen, in eine pöröse Hülle oder in ein Hülsenmaterial eingewickelt, das einne zusätzlichen Hüllenraum erzeugt, in den die Zellen wandern können, um periodisch ohne Störung der Hauptzellkultur entnommen zu werden. Die Schaffung des zusätzlichen Hüllenraums vergrößert den Oberflächenbereich der Nährstoff- und Abfallproduktdiffusion zu und von den Zellen, die unter der äußeren Oberfläche der Kapillaren angeordnet sind.
In dem U.S. Patent Nr. 3,997,396 sind Zellen auf einer Seite oder einer Oberfläche einer einzelnen Hohlfasermembran aufgebracht und aufgewachsen, wobei die Zellen durch Durchleiten von Sauerstoff durch die Membran von der Seite aus, die der Seite gegenüberliegt, auf der die Zellen aufgebracht sind und mit der sie in Kontakt stehen, vermehrt und erhalten werden, während gleichzeitig die Zellen in einem Nährmedium inkubiert werden. Durch das kontinuierliche Durchströmen von Sauerstoff durch die Membrane von der entgegengesetzten Seite der Zellaufbringung aus, erreicht und ernährt ein kontinuierliche und gleichmäßige Sauerstoffversorgung die Zellen und erleichtert damit das aerobe Wachstum der Zellen in den erwünschten Gewebedichten.
In den U.S. Patenten Nr. 4,087,327 und 4,201,845 für Feder und Andere ist ein in vitro-Zellkultur-Reaktionssystem offenbart, das längliche hohle oder feste Fasern in einer flachen Schichtanordnung als eine Matrix für eine Zellaufbringung auf der Außenflächen der Fasern verwendet. Der Nährmediumfluß wird im wesentlichen gleichmäßig durch die Faserschicht und im wesentlichen quer zur Ebene der Faserlängsachsen geleitet. Die Zellen werden durch das Durchleiten von Sauerstoff durch das Innere der Fasern, der dann durch die Faserwände dringt, mit Sauerstoff versorgt.
Die Verwendung eines Flachbetts aus Fasern in einem relativ kurzem Medienflußpfad ergibt eine wesentliche Verringerung der Nährstoff- und Stoffwechselproduktgradienten, die normalerweise sowohl durch das Faserbündel erzeugt werden, als auch eine extensivere Nutzung der Faseroberfläche für den Zellauftrag.
Das U.S. Patent 4,391,912 offenbart ein Vorrichtung zur Kultivierung schwebender Tierzellen, die eine gasdurchläßige Schale und mehrere innerhalb der Schale eingeschlossene Hohlfasern aufweist, wobei die Hohlfasern an beiden Enden außerhalb der Schale offen sind und einen Porendurchmesser in der Größenordnung von ungefähr 10² bis 5 10&sup4; Angström aufweisen. Das Nährmedium strömt durch das Innere der Hohlfasern und der Sauerstoff durch die Schale und die Tierzellen werden in dem Raum zwischen der Schale und den Hohlfasern kultiviert.
Es ist offenbart, daß diese Porendurchmesser der Hohlfasern den effizienten Austausch von Nährstoffen und von den Zellen erzeugten Stoffwechselprodukten optimieren, was eine hohe Zellwachstumsdichte ergibt.
Ungeachtet der Nützlichkeit der Hohlfaser-Zellkultur- Vorrichtungen hat man herausgefunden, daß der Nährmediumfluß durch die Hohlkapillaren die vollständige Durchdringung des Kapillarbündels durch die Zellen verhindert und einen unerwünschten Gradienten im Medienfluß aufbaut. Demzufolge ergibt sich eine unvollständige Ausnutzung der zur Verfügung stehenden Kapillaroberfläche für die Zellaufbringung und die Zellen werden ungleichmäßig über der Oberfläche verteilt. Desweiteren sind bei dem Fluß des Nährmediums durch den Reaktor die Nährstoffe für die Zellen in der Nähe des Einlaßes leichter verfügbar, und sobald das Medium zum Auslaß fließt, sammeln sich Stoffwechselprodukte wie Milchsäure in dem Medium an und beeinflussen unerwünscht den pH-Wert und erzeugen andere toxische Effekte auf die Zellen.
Ein andere erhebliche Schwierigkeit im Zusammenhang mit diesen Hohlfasertyp-Zellkulturvorrichtungen betrifft die notwendigen hohen Mediumzirkulationsdurchsätze, um ausreichend Sauerstoff zu den Zellen zu transportieren. Speziell wässrige Nährmedien im Gleichgewichtszustand mit Luft können nur 4,5 ml Sauerstoff pro Liter (bei 37ºC, 760 mm Hg) transportieren. Diese relative Unfähigkeit wässriger Lösungen, Sauerstoff zu transportieren, bewirkt, daß der Durchsatz, mit dem Sauerstoff zu den Zellen transportiert wird, der begrenzende Schritt bei den in vitro-Zellwachstumsvorgängen ist. Um hohe Zellausbeuten und/oder Abscheideprodukte zu erhalten, müssen die Medienzirkulationsdurchsätze erhöht werden, um mehr Sauerstoff für die Zellen bereitzustellen. Hohe Zirkulationsdurchsätze bewirken wiederum einen hohen internen Druck und Turbulenz, was Probleme bezüglich der Konstruktion der Vorrichtung in einem industriellen Maßstab bereitet hat und auch bei der Vermehrung von Säugetierzellen, deren Empfindlichkeit und Zerbrechlichkeit den Einsatz zu intensiver Belüftung und/oder Umschichtung verbieten. Die intensive Belüftung bewirkt weiterhin die Denaturierung vieler biologisch und medizinisch wertvoller Proteine, die durch die Zellkulturen erzeugt werden.
Außerdem leiden die vorstehend beschriebenen Hohlfasertyp-Vorrichtungen, die eine getrennte Sauerstoff- und Nährmediumzufuhr zu den Zellen vorsehen, unter den zusätzlichen Nachteilen, mechanisch kompliziert, schwierig aufzubauen und unzeitgemäß groß zu sein. Ferner sind die Dimensionen dieser Vorrichtungen nicht notwendigerweise erforderlich, um die wachsenden Zellen in enger Nachbarschaft zur Nährmediumversorgungsquelle zu halten, wodurch sie unerwünschte Nährgradienten erzeugen.
Deshalb war es wünschenswert neue Zellkultur-Vorrichtungen zum Vermehren von Zellen in vitro, speziell von Säugetierzellen zu schaffen, die die diversen Schwierigkeiten, die mit den Vorrichtungen auf dem Stand der Technik verbunden sind, überwinden und Zellen und/oder Zellsekretionsprodukte wirtschaftlicher in höheren Ausbeuten erzeugen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist demzufolge eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Zellkultur-Vorrichtung zu schaffen, die die vorstehend erwähnten mit dem Stand der Technik verbundenen Schwierigkeiten überwindet.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Zellkultur-Vorrichtung für die in vitro-Zellvermehrung bereitzustellen, die einen optimal effizienten Gasaustausch zwischen den Zellen und der äußeren Umgebung gewährleistet, der durch das Einbringen und Entsorgen von Gas getrennt von dem Nährstoffmedium erreicht wird.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Zellkultur-Vorrichtung bereitzustellen, die einen erheblich reduzierten Nährmedium-Zirkulationsumsatz erlaubt und dabei eine leichtere Vergrößerung in einen industriellen Maßstab zuläßt.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Zellkultur-Vorrichtung bereitzustellen, die einfach im Aufbau, leicht zu montieren, kompakt in der Größe ist und eine günstige innere Umgebung aufweist, in der Zellen wachsen und Zellen und/oder wertvolle Zellprodukte in hohen Ausbeuten gewonnen werden sollen.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind in einer Zellkultur-Vorrichtung realisiert, mit:
(a) mindestens einer Hülle mit ersten und zweiten äußeren Oberflächen, wobei die Hülle eine erste Membranschicht aufweist, die mit einer zweiten Membranschicht entlang ihrer jeweiligen ersten und zweiten Seiten- und Längsränder dicht verschlossen ist, um dazwischen einen Zellkulturraum zu definieren;
(b) einer ersten Versorgungsvorrichtung, zum Einbringen von Nährstoffen in den Zellkulturraum;
(c) einer zweiten Versorgungsvorrichtung, zum Einbringen von Zellen in den Zellkulturraum;
(d) einer dritten Versorgungsvorrichtung, zum Einbringen eines Gases in den Zellkulturraum;
(e) einem länglichen Kern mit einer Längsachse, auf den ein erster Seitenrand der Hülle parallel zur Achse aufgebracht ist, und um den die Hülle spiralförmig aufgewickelt ist, so daß die Längsränder in zwei Ebenen senkrecht zur Längsachse des Kerns angeordnet sind;
(f) einem Klebemittel, das entlang der gesamten Länge beider Längsränder der ersten äußeren Oberfläche der mindestens einen Hülle in der Weise aufgebracht ist, daß dann, wenn die Hülle spiralförmig um den Kern aufgewickelt ist, die Längsränder der ersten äußeren Oberfläche fest mit dem Kern verklebt sind und dann mit der zweiten äußeren Oberfläche einer zuvor aufgewickelten Schicht der Hülle verklebt sind, wodurch ein sich spiralförmig erstreckender Zwischenhüllen-Gasraum dazwischen ausgebildet wird;
(g) einer ersten Entsorgungsvorrichtung, zur Entsorgung der Stoffwechselabfallprodukte aus dem Zellkulturraum;
(h) einer zweiten Entsorgungsvorrichtung, zur Entsorgung der Zellen und/oder Zellprodukte aus dem Zellkulturraum;
(i) einer dritten Entsorgungsvorrichtung, zur Entsorgung der gasförmigen Abfallprodukte aus dem Zellkulturraum;
(j) einer ersten Endabschlußvorrichtung, die neben einem ersten Ende des Kerns angebracht ist und Einlaßvorrichtungen aufweist, die mit den Versorgungsvorrichtungen in Verbindung stehen; und
(k) einer zweiten Endabschlußvorrichtung, die neben einem zweiten Ende des Kerns angebracht ist und Auslaßvorrichtungen aufweist, die mit mindestens einer der Entsorgungsvorrichtungen in Verbindung stehen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden vollständiger aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen verstanden, wobei:
Fig. 1 eine perspektivische Ansicht der Zellkultur- Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in zusammengebauten Zustand gemäß einer ersten Ausführungsform ist;
Fig. 2 eine Querschnittsansicht entlang der Linie 2-2' in Fig. 1 ist;
Fig. 3 eine perspektivische Explosionsansicht einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in ihrem nicht zusammengebauten Zustand ist;
Fig. 4 eine Längsschnittansicht einer zusammengebauten Vorrichtung entsprechend einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist;
Fig. 5 eine perspektivische Explosionsansicht einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in ihrem nicht zusammengebauten Zustand ist;
Fig. 6 eine Längsschnittansicht einer zusammengebauten Vorrichtung entsprechend einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist;
Fig. 7 eine Querschnittsansicht ähnlich der Querschnittsansicht von Fig. 2 ist, die aber die Anordnung für die zweite Ausführungsform darstellt;
Fig. 8 eine detaillierte perspektivische Ansicht einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist;
Fig. 9 eine perspektivische Explosionsansicht einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in ihrem nicht zusammengebauten Zustand ist;
Fig. 10 eine Querschnittsansicht ähnlich der von Fig. 2 ist, die aber die Anordnung für die dritte Ausführungsform darstellt; und
Fig. 11 eine Längsschnittansicht einer zusammengebauten Vorrichtung entsprechend einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

In den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung, wie sie in den Zeichnungen dargestellt sind, werden gleiche Strukturen durch gleiche Bezugszeichen gekennzeichnet.
In der Ausführungsform der Erfindung, wie sie in Fig. 1 dargestellt ist, ist eine zusammengebaute Zellkultur- Vorrichtung bereitgestellt, wie sie im allgemeinen bei 12 dargestellt ist. In dieser Ausführungsform enthält die Zellkultur-Vorrichtung 12 eine Außenschale oder Hülse 14, die vorzugsweise aus einer elastomeren Schlauchhülse aus Silikon oder aus einer durch Hitze schrumpfbaren thermoplastischen Schlauchhülse besteht, deren Oberfläche Perforationen 15 aufweist. Die Schale 14 und die Endabschlußkappen 60 und 70 bilden einen äußeren Einschluß der Zellkultur-Vorrichtung 12.
Fig. 2 ist eine Querschnittsansicht der ersten Ausführungsform der Erfindung, wie sie in Fig. 1 dargestellt ist. Die speziellen Eigenschaften dieser Fig. werden unter Bezugnahme auf Fig. 3 nachstehend im Detail beschrieben.
In Fig. 3, die eine erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in ihrem unmontiertem Zustand darstellt, weist eine Zellkulturhülle 20 erste und zweite äußere Oberflächen auf, die durch jeweils erste und zweite Membranschichten 22 und 24 mit im wesentlichen gleicher Größe definiert sind, und die jeweils an ihren ersten und zweiten Längsrändern und ersten und zweiten Seitenrändern mit einem geeigneten Klebemittel 21 fest verklebt sind, um einen Zellkulturraum 26 dazwischen zu definieren. Silikon-Kleber werden bevorzugt. Die Schichten 22 und 24 bestehen vorzugsweise aus porösem wasserabstoßendem Material, wie z.B. medizinischem Standard entsprechendem Silikon, mikroporösem Polyethylen, Polysulfon, Polykarbonat oder Polyethylenen, die für Gase, wie z.B. Luft, Sauerstoff und Kohlendioxid durchlässig sind, aber undurchlässig für Zellen und Flüssigkeiten sind. Die durchlässigen Membranschichten weisen im allgemeinen eine Porengröße im Bereich von 0,02 bis 0,4 um auf. Ein bevorzugtes Material ist medizinischem Standard entsprechendes Silikon, da es keine zusätzliche chemikalischen oder physikalischen Änderungen an seiner Oberfläche erfordert, um das effektive Aufbringen von Zellen darauf zu ermöglichen und es einen optimal günstigem Gasaustausch zwischen den Zellkulturraum 26 und der äußeren Umgebung bietet. Ein insbesondere bevorzugtes Material ist ein gewebeverstärktes Polymethylsiloxan, hergestellt von SciMed Life Systems in Minneapolis, MN und von Dow Corning in Midland, MI unter dem Namen "SILASTIC" . Die Membranschichten 22 und 24 sollten auch so dünn wie möglich beschaffen sein, um ihren Widerstand gegen Gasdiffusion zu minimieren. Beispielsweise liegt bei Verwendung von Silikon als Membranmaterial eine geeignete Dicke bei ungefähr 0,125 mm. Eine bevorzugte Dicke der Materialschicht liegt in dem Bereich von ungefähr 0,1 mm bis 0,250 mm. Die vorstehend genannten wasserabstoßenden Materialien sind auch dadurch vorteilhaft, da sie es nicht zulassen, daß sich ein Wasserfilm auf ihrer Oberfläche bildet, der den Widerstand gegen Gasdiffusion erhöht. Die längsseitige Länge der Hülle sollte es relativ zu einem Außenumfang des Kerns 50 zulassen, daß mehrere Schichten der Hülle spiralförmig um den Kern gewickelt werden können. In der Praxis kann die längsseitige Länge der Hülle von 1 m bis 90 m, vorzugsweise ungefähr 2 m bis 40 m lang sein und ihre seitliche Länge oder Breite liegt im allgemeinen in der Größenordnung von ungefähr 0,1 m bis 0,3 m und vorzugsweise bei 0,15 m bis 0,25 m.
In dieser Ausführungsform werden das Nährmedium durch mehrere Hohlfasern oder Kapillaren 28 mit halbdurchlässigen Wandungen, die in der Hülle angeordnet sind, und deren offenen Enden sich zwischen den dicht verschlossenen Längsrändern der Hülle nach außen erstrecken, so daß die Kapillaren nur über die Kapillarwände mit dem Zellkulturraum in Verbindung stehen, in den Zellkulturraum gebracht und die wasserlöslichen Abbauprodukte daraus entfernt. Die Kapillaren können in der Hülle im wesentlichen im gleichen Abstand und parallel zueinander angeordnet sein. Der Abstand zwischen den Kapillaren liegt im allgemeinen zwischen ungefähr 100 um bis ungefähr 1000 um; wobei der bevorzugte Abstand ungefähr 200 um bis 500 um beträgt. Ein Abstand von weniger als 100 um wirft Schwierigkeiten in der Herstellung auf und stellt nicht genügend Raum für das Zellwachstum zur Verfügung. Abstände von mehr als 1000 um tendieren dazu die Entwicklung von Nährstoffgradienten in dem Zellkulturraum zu verursachen, der, wie vorstehend diskutiert, zu einem geringeren Zellwachstum und/oder einer nicht optimalen Zellproduktion führt. Die Kapillaren können aus jedem geeigneten Material gefertigt werden, das ungiftig für Zellen ist und aus dem Fasern gesponnen werden können, die eine halbdurchlässige, Wasseranziehende und selektiv durchlässige Membran bilden. Beispiele sind Zelluloseazetat, anisotropes Polysulfon, Polyäthylensulfon, verseifter Zelluloseester, Nylon, Polyacrylonitrid und acrylische Copolymere. Ein bevorzugtes Material ist das "CUPROPHAN ", ein regeneriertes Zelluloseazetat, daß von Enka Ltd., Del Ray, CA. hergestellt wird. Die Kapillaren 28 transportieren frisches Nährmedium, das Glukose, Aminosäuren, Vitamine und andere wichtige Nährstoffe enthält, welche für die spezifischen Zellstoffwechselanforderungen erforderlich, sind zu den Zellen. Die Medien diffundieren durch die Kapillarwände in den Zellkulturraum 26. Zellenartige Abfallprodukte diffundieren aus dem Zellkulturraum 26 in die Kapillaren 28 und werden von dem dort durchfließenden Medium weggetragen. Der Außendurchmesser der Kapillaren 28 liegt im allgemeinen in dem Bereich von ungefähr 60 bis 400 um, vorzugsweise bei ungefähr 200 um bis 300 um; der Innendurchmesser liegt im allgemeinen ungefähr bei 100 bis 300 um, vorzugsweise bei ungefähr 200 um bis ungefähr 250 um.
Der Zugang zu dem Zellkulturraum 26 sowohl für das Einbringen von Zellen als auch für die Entnahme von Zellen und/oder Zellprodukten erfolgt jeweils über die Ein- und Ausgangsschläuche 30 und 32. Der Schlauch 30 ist zwischen den ersten Längsrändern der Lagen 22 und 24 der Hülle angeordnet und ragt in den Zellkulturraum in der Weise vor, daß ein erster Endabschnitt des Schlauchs mit dem Zellkulturraum und ein zweiter Endabschnitt des Schlauchs mit dem extrakapillaren Einlaßanschluß 68 auf der ersten Endabschlußkappe 60 in Verbindung steht, wie es in der nachstehend diskutierten Fig. 4 dargestellt ist. Der Schlauch 32 ist zwischen den zweiten Längsrändern der Schichten 22 und 24 der Hülle gegenüber den Rändern, an denen der Schlauch 30 angeordnet ist, in der Weise angeordnet, daß der Schlauch 32 in den Zellkulturraum vorragt, wodurch ein erster Endabschnitt der Röhre mit dem Zellkulturraum und ein zweiter Endabschnitt des Schlauchs mit dem extrakapillaren Auslaßanschluß 78 auf der zweiten Endabschlußkappe 70 in Verbindung steht, wie es in Fig. 4. dargestellt ist. Die Eingangs- und Ausgangsschläuche können aus einem flexiblen biologisch verträglichem Material hergestellt werden, wie z.B. aus Silikongummi, Polyethylen oder Polyurethan. Ein bevorzugtes Material ist Silikongummi. Der Innendurchmesser der Schläuche sollte groß genug sein, um eine ausreichende Zellimpfung im Zellkulturraum und das Entnehmen der Zellen und/oder Zellprodukte hiervon zuzulassen. Ein geeigneter Innendurchmesser liegt im allgemeinen im Bereich von ungefähr 1,5 mm bis ungefähr 9,5 mm. Der Außendurchmesser des Schlauchs wird so gewählt, daß das Verbinden oder dichte Einfügen der Schläuche 30 und 32 zwischen den Längsrändern der Membranschichten 22 und 24, welche die Hülle 20 bilden, vereinfacht wird. Ein bevorzugter Außendurchmesser ist ungefähr 3 mm bis ungefähr 13 mm. Die Schläuche 30 und 32 erstrecken sich gerade weit genug in den Zellkulturraum 26, um jeweils eine ausreichende Zellimpfung und eine Zellen- und/oder Zellprodukternte zu ermöglichen. Obwohl es in Fig. 3 nicht dargestellt ist, können sowohl von den Schläuchen 30 als auch 32 jeweils mehr als eine in entsprechender Weise in der Hülle angeordnet sein.
Nach dem Zusammenbau der Hülle 20, die eine Vielzahl von Kapillaren 28 aufweist und mindestens jeweils einen Schlauch 30 und 32 darin angeordnet hat, wird ein Kleber 21 über die gesamte Länge der beiden Längsränder und über einen ersten Seitenrand 27 einer ersten äußeren Oberfläche der Hülle aufgebracht. Dann wird ein Unterstützungsgitter 23 mit der Form eines Blatts mit solchen Abmessungen, daß deren Längs- und Seitenränder im wesentlichen an den Klebstoff 21 heranreichen ihn aber nicht berühren, über die erste äußere Oberfläche der Hülle gelegt. Das Gitter besteht vorzugsweise aus einem nicht gewebten Kunststoffsieb, das eine Dicke von ungefähr 0,5 mm bis ungefähr 1,0 mm hat. Als nächstes wird, wie es in Fig. 3 dargestellt ist, der erste Seitenrand 27 klebend mit einem länglichen Kern 50 parallel zur Längsachse des Kerns verbunden. Die Hülle 20 wird dann spiralförmig in der Weise um den Kern gewickelt, daß die Längsränder der Hülle in zwei Ebenen rechtwinklig zu den Längsachsen des Kerns angeordnet sind und daß die Längsränder der ersten äußeren Oberfläche der Hülle fest mit dem Kern verklebt sind und daß sie, sobald der Außenumfang des Kerns mit einer Wicklung vollständig abgedeckt ist, fest mit den Längsrändern einer zweiten äußeren Oberfläche der zuvor gewickelten Lage der Hülle, verklebt sind. Die Hülle bildet, wenn sie spiralförmig in dieser Art um den Kern gewickelt ist, einen sich spiralförmig erstreckenden Zwischenhüllenraum 29, der das Gitter 23 darin enthält, wie es in der nachstehend im Detail beschriebenen Fig. 2 dargestellt ist. Der Zwischenhüllenraum 29 gestattet den ungehinderten und spiralförmigen Ausfluß der gasförmigen Abfallprodukte, die dahinein von dem Zellkulturraum durch die Membranschichten 22 und 24 diffundiert waren. Das Gitter dient der Aufrechterhaltung des Zwischenhüllenraums, indem es das Berühren der nebeneinander gewickelten Schichten untereinander verhindert, wenn der Zellkulturraum 26 mit Nährstoffen gefüllt wird und die Zelldichte sich erhöht. Der Zwischenhüllenraum kann mit alternativen Möglichkeiten als durch den Einsatz des Gitters aufrechterhalten werden, wie es für einen Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich ist.
Der verlängerte Kern 50 dient in dieser Ausführungsform der Erfindung einem doppelten Zweck. Erstens dient der Kern als Unterstützung für die spiralförmig aufgewickelte Hülle. Zweitens dient der Kern als gasdurchläßige Leitung, durch die das Gas entlang der gesamten Längsseite des Kerns fließen kann und daraus radial nach außen diffundieren kann. Deshalb wird der Kern vorzugsweise aus Material hergestellt, das sowohl genügend steif ist, um als Unterstützung für die Hülle zu dienen, als auch genügend porös ist, um das Durchströmen von Gas zu gestatten, wie z.B. aus Kunststoff, Metall oder einer Legierung. Wie in Fig. 3 dargestellt, kann der Kern aus hohlem, starrem Material, dessen Oberfläche mit Öffnungen oder Poren 52 perforiert ist, hergestellt werden, um die Gasdiffusion daraus zu ermöglichen. Die Porengröße liegt im allgemeinen in dem Bereich von 0,5 mm bis 5mm und vorzugsweise bei ungefähr 1,25 mm bis 2,50 mm. Obwohl es in den Zeichnungen nicht dargestellt ist, kann der Kern alternativ aus einem porösen festen Material hergestellt werden, wie z.B. aus mikroporösem Polyethylen, Keramik oder einem anderen gesinterten Material.
Nachdem die Hülle vollkommen um den Kern gewickelt ist, kann die gewickelte Untereinheit wahlweise mit einer Schale oder einer Hülse 14 zusammenmontiert werden, wie z.B. mit einer durch Hitze schrumpfbaren thermoplastische Schlauchhülse, wie sie in Fig. 1 und 2 dargestellt ist. Geeignete Beispiele für verwendbare Materialien sind PVC (Polyvinylchlorid), Polyolefin, TEFLON , MYLAR , Polyethylen und KYNAR (Polyvinylide Fluoride). Natürlich muß in dieser Ausführungsform, wenn eine schützende Schale wie gezeigt vorhanden ist, diese entweder gasdurchlässig und/oder perforiert sein (wie in Fig. 1 und 2 gezeigt), um das Austreten von Gas aus der Vorrichtung zu ermöglichen. Eine zweite Funktion der Schale oder der Hülse ist es, die spiralförmig gewickelte Hülle zusammenzuhalten, so daß die sich zwischen den Lagen 22 und 24 befindende Zellkulturkammer, sobald sie mit Nährstoffen gefüllt ist, eine Gesamtdicke von nicht größer als ungefähr 200 bis ungefähr 500 um, vorzugsweise nicht größer als ungefähr 200 bis 350 um aufweist.
Sobald die Hülle um den Kern gewickelt und in einer Schale der vorstehend beschriebenen Art eingeschlossen ist, wird eine erste Endabschlußkappe 60 neben einem ersten Ende des Kerns, wie in Fig. 4 dargestellt, angeordnet. Eine ringförmige Schulter oder ein Flansch 62 der Abschlußkappe 60 wird fest mit dem äußeren Umfangsrand der Schale 14 verbunden, um eine hydraulische Abdichtung damit zu bilden. Ein extrakapillarer Einlaßanschluß 68 ist angepaßt, eine Zellimpfungsschlauch 30 aufzunehmen, um damit in einer Flüssigkeitsverbindung zu stehen. Ein Gaseinlaßanschluß 66 ist an eine Pumpe oder ein Gaskompressionsgerät außerhalb der Vorrichtung für die Versorgung der Vorrichtung mit Luft angeschlossen und ist in deren Inneren angepaßt, in ein erstes Ende des Kerns einzugreifen, um damit in einer Gasverbindung zu stehen und den ungehinderten Zufluß eines Gases wie z.B von Luft in den Kern zu gewährleisten. In dieser Ausführungsform ist eine Hilfsabschlußkappe 67 an den Gaseinlaßanschluß 66 angepaßt und dessen ringförmige Schulter 65 greift in das offene Ende des Kerns 50 in der Weise ein, daß eine Gasverbindung damit besteht. Wie hierin angewendet, bedeutet der Ausdruck "Luft" nicht nur atmosphärische Luft, sondern auch Gase und Mischungen davon, die nicht giftig und physiologisch für Zellen verträglich sind und die förderlich für ihr Wachstum in vitro sind. Alternativ kann die Hilfsabschlußkappe 67 durch einen Kunststoffschlauch ersetzt werden, der angepaßt ist, mit seinen ersten und zweiten Enden jeweils in Verbindung mit dem Gaseinlaßanschluß und dem offenen Ende des Kerns zu stehen. Ein innerkapillarer Einlaßanschluß 64 ist an eine äußere Nährstoffversorgungsquelle angeschlossen und im Inneren der Vorrichtung angepaßt, mit der Sammelkammer 63 in Verbindung zu stehen, die durch die Endabschlußkappe 60, die Hilfsabschlußkappe 67 und durch diejenige Ebene definiert ist, die durch die rechtwinklig zu dessen Längsachse stehende Oberfläche des Kerns 50 und die ersten Längsränder jeder aufeinandergewickelten Lage der Hülle, die miteinander dicht verschlossen sind, definiert ist. Die Sammelkammer 63 steht mit den ersten offenen Enden der Kapillaren 28 in Verbindung, die sich von den dicht verschlossenen Längsrändern der Hülle nach außen und in die Kammer erstrecken. Bevorzugt werden die Kapillaren bündig mit der vorstehend beschriebenen Ebene abgeschnitten.
Eine zweite Endabschlußkappe 70 ist neben einem zweiten Ende des Kerns angeordnet, so daß eine ringförmige Schulter oder ein Flansch 72 der Abschlußkappe 70 fest mit dem äußeren Umfangsrand der Schale 14 verbunden ist, um ein hydraulische Abdichtung zu bilden. Natürlich würden in dem Fall, daß keine Schale vorgesehen wäre, die ringförmigen Schultern oder Flansche 62 und 72 fest mit den äußeren Umfangsrand der äußersten spiralförmig gewickelten Schicht der Hülle verbunden werden. Ein extrakapillarer Ausgangsauslaß 78 ist im Inneren der Vorrichtung angepaßt, einen Produkternteschlauch 32 für die Entnahme der Zellen und/oder Zellprodukte vom Zellkulturraum aufzunehmen. Der auf der Abschlußkappe 70 angebrachte Stopfen 77 greift in die innere Umfangsoberfläche des Kerns 50 ein, um das Entweichen von Gas daraus zu verhindern. Natürlich muß der Stopfen 77 nicht an der Kappe 70 angebracht sein, sondern kann auch getrennt angeordnet sein. Alternativ kann eine geeignete Kappe auf das Ende des Kerns 50 in einer flüssigkeitsdichten Art montiert werden oder der Kern kann so ausgeführt werden, daß er ein dicht verschlossenes zweites Ende hat. Ein innerkapillarer Auslaßanschluß 74 ist im Inneren der Vorrichtung angepaßt, eine Verbindung mit der Sammelkammer 79 herzustellen, die durch die Abschlußkappe 70, den Stopfen 77 und diejenige Ebene definiert ist, die durch die Oberfläche des Kerns 50 rechtwinklig zu seiner Längsachse und durch die zweiten Längsränder jeder der aufeinandergewickelten Lagen der Hülle, die miteinander dicht verschlossen sind, definiert ist, und in die sich die zweiten offenen Enden der Kapillaren 28 erstrecken.
Frische Nährmedien werden veranlaßt durch den innerkapillaren Einlaßanschluß 64 in die Vorrichtung und in die Sammelkammer 63 zu fließen, die dann die Kapillaren über deren ersten offenen Enden durchströmen. Die Medien und Nährstoffe diffundieren durch die Kapillarwände in den Zellkulturraum 26 und werden von den Zellen aufgenommen. Die verbrauchten Medien und wasserlösliche Zellstoffwechselabfallprodukte diffundieren dann von dem Zellkulturraum 26 durch die Kapillarwände und werden durch von den durchströmenden Medien von den Kapillaren 28 in die Sammelkammer 79 und aus der Vorrichtung durch den innerkapillaren Auslaßanschluß 74 ausgetragen.
Gase werden auf folgende Art der Vorrichtung zugeführt und davon abgeführt. Wie in Fig. 4 dargestellt, wird Luft dazu veranlaßt, durch den Gaseinlaßanschluß 66 in die Vorrichtung und über die Hilfsabschlußkappe 67 in den Kern 50 zu fließen. Gemäß Fig. 2 fließt Luft durch die Poren 52 in den Zwischenhüllenraum 29 und fließt spiralförmig dadurch und diffundiert durch die Membranschichten 22 und 24 in den Zellkulturraum 26 und wird von den Zellen aufgenommen. Gasförmige Abfallprodukte diffundieren durch die Membranschichten 22 und 24 in den Zwischenhüllenraum 29 und werden veranlaßt, dadurch spiralförmig und aus dem Kern 50 über einen Raum herauszuströmen, der durch den zweiten Seitenrand 25 der Hülle und der vorher gewickelten Schicht, die nicht dicht miteinander verschlossen sind, definiert ist. Das Gas verläßt die Vorrichtung, indem es durch die Öffnungen 15 auf der Schale oder der Hülse 14 austritt.
Eine zweite Ausführungsform der Erfindung ist in den Fig. 5 bis 7 dargestellt. Diese Ausführungsform unterscheidet sich von der ersten Ausführungsform in mehreren Punkten, die sich alle auf die Art beziehen, wie Gase den wachsenden Zellen im Zellkulturraum zugeführt und davon abgeführt werden.
In Fig. 5 wird die Hülle 20 mit den darin angeordneten Kapillaren 28 und Schläuchen 30 und 32 wie vorstehend beschrieben zusammengesetzt. Als nächstes wird der Klebstoff 21 entlang der gesamten Länge der ersten und zweiten Längs- und Seitenränder der ersten äußeren Oberfläche der Hülle 20 aufgebracht. Dann wird mindestens ein Gaseinlaßschlauch 40 an der ersten äußeren Oberfläche der Hülle 20 angeordnet und befestigt, der sich mindestens entlang eines Teils der Oberfläche davon erstreckt, so daß er parallel zu der Längsachse des Kerns 54 liegt, und sich auch außerhalb der Hülle in der Weise erstreckt, daß dann, wenn die Hülle spiralförmig um den Kern gewickelt und die Vorrichtung vollständig montiert wird, ein offenes Ende der Röhre 40 einfach anzuschließen ist, um mit dem Gaseinlaßanschluß 66' der Endabschlußkappe 60' in Verbindung zu stehen, und dessen anderes offenes Ende mit dem Zwischenhüllen-Gasraum 29 in Verbindung steht, wie es in der nachstehend diskutierten Fig. 7 dargestellt ist. An dem gegenüberliegenden Längsrand der ersten äußeren Oberfläche der Hülle 20 ist mindestens ein Gasauslaßschlauch 42 angebracht und befestigt, der sich auch mindestens entlang eines Teilbereichs von deren Oberfläche erstreckt, und der sich auch von der Hülle in der Weise nach außen erstreckt, daß dann, wenn die Hülle spiralförmig um den Kern gewickelt und die Vorrichtung vollständig montiert wird, ein offenes Ende des Schlauchs 42 angepaßt ist, einfach mit dem Gasauslaßanschluß 76' auf der Kappe 70' in Verbindung zu stehen und das andere offene Ende mit dem Zwischenhüllen- Gasraum 29 in Verbindung steht. Dann wird das Gitter 23 auf die erste äußere Oberfläche der Hülle 20 in derselben Art, wie vorstehend beschrieben, gelegt. Der erste Seitenrand 27 der Hülle wird über eine Klebeverbindung mit dem Kern 54 verbunden. Der Kern ist in dieser Ausführungsform undurchlässig für Gase und kann aus jedem Material bestehen, das diesem Zweck erfüllt und das die Unterstützung für die spiralförmig umwickelte Hülle gewährleistet. Die Hülle 20 ist dann in der selben Art spiralförmig, wie vorstehend beschrieben, aufgewickelt außer daß nach dem Abschluß des Wickelns, der zweite Seitenrand 25 der Hülle 20, auf den Kleber 21 aufgebracht ist, auf der zweiten äußeren Oberfläche der vorher aufgewickelten Schicht der Hülle klebt. Dieser gewickelte Aufbau kann dann wahlweise mit einer Schale 16, wie in den unten beschriebenen Fig. 6 und 7 versehen werden. In dieser Ausführungsform kann die Schale eine durch Hitze schrumpfbare thermoplastische Schlauchhülse wie in der ersten Ausführungsform sein, die sich aber dahingehend unterscheidet, daß sie für Gase nicht durchlässig und/oder perforiert sein muß. In dieser Ausführungsform gewährleistet die Schale, daß die Zellen im Zellkulturraum 26 nicht weiter als ungefähr 100 um bis ungefähr 250 um von einer Sauerstoffquelle entfernt sind, welche in dieser Ausführungsform der Zwischenhüllenraum 29 ist, der mit Sauerstoff durch den Schlauch 40 versorgt wird.
Sobald die Hülle in der vorstehend beschriebenen Art um den Kern gewickelt und in der Schale 16 eingeschlossen ist, wird eine erste Endabschlußkappe 60 neben einem ersten Ende des Kerns 54, wie in Fig. 6 dargestellt, angeordnet. Eine ringförmige Schulter oder ein Flansch 62' der Abschlußkkappe 60' ist fest mit den äußeren Umfangsrand der Schale 16 verbunden, um damit eine hydraulische Abdichtung zu bilden. Ein extrakapillarer Einlaßanschluß 68' ist angepaßt, eine Zellimpfungsschlauch 30 aufzunehmen, um damit eine Flüssigkeitsverbindung zu bilden. Ein Gaseinlaßanschluß 66' ist an eine Pumpe oder an eine Gaskompressionsseinrichtung außerhalb der Vorrichtung angeschlossen, um die Vorrichtung mit Luft zu versorgen und ist im Inneren der Vorrichtung angepaßt, einen Gaseinlaßschlauch 40 zu umfassen, um damit in einer Gasverbindung zu stehen und einen ungehinderten Durchfluß eines Gases, wie z.B von Luft zu gewährleisten. Der innerkapillare Einlaßanschluß 64' ist an eine Nährmedienversorgungsquelle oder ein Reservoir außerhalb der Vorrichtung angeschlossen und ist im Inneren davon angepaßt, mit der Sammelkammer 63' in Verbindung zu stehen, die durch die Abschlußkappe 60' und diejenige Ebene definiert ist, die durch die Oberfläche des Kerns 54 rechtwinklig zu seiner Längsachse und durch die ersten Längsränder jeder aufeinandergewickelten Schicht der Hülle, die miteinander dicht verschlossen sind, definiert ist. Die Sammelkammer 63' steht mit den ersten offenen Enden der Kapillaren 28 in Verbindung, die sich von den dicht verschlossenen Längsrändern der Hülle nach außen und in die Kammer erstrecken. Ein zweiter Endkappenabschluß 70' ist neben einem zweiten Ende des Kerns in der Weise angeordnet, daß eine ringförmige Schulter oder ein Flansch 72' der Abschlußkappe 70' fest mit dem äußeren Umfangsrand der Schale 16 verbunden ist, um damit eine hydraulische Abdichtung zu bilden. Natürlich würden, wie in der ersten Ausführungsform, die ringförmigen Schultern oder Flansche 62' und 72' fest an den äußeren Umfangsrändern der äußersten spiralförmig aufgewickelten Schicht der Hülle befestigt werden, wenn keine Schale vorhanden wäre. Der extrakapillare Auslaßanschluß 78' ist im Inneren der Vorrichtung angepaßt, mit einem Produkternteschlauch 32 für die Entnahme der Zellen und/oder Produkte vom Zellkulturraum 26 in Verbindung zu stehen. Der innerkapillare Auslaßanschluß 74' ist im Inneren der Vorrichtung angepaßt, mit der Sammelkammer 79' in Verbindung zu stehen, die durch die Abschlußkappe 70 und diejenige Ebene definiert ist, die durch die Oberfläche des Kerns 54 rechtwinklig zu seiner Längsachse und durch die zweiten Längsränder jeder aufeinandergewickelten Schicht der Hülle, die miteinander dicht verschlossen sind, definiert ist, und in die sich die zweiten offenen Enden der Kapillaren 28 erstrecken. Der Gasauslaßanschluß 76' ist im Inneren der Vorrichtung angepaßt, mit dem Gasauslaßschlauch 42 für die Entsorgung der gasförmigen Abfallprodukte aus der Vorrichtung in einer Gasverbindung zu stehen.
Nährstoffmedien werden dazu veranlaßt, im wesentlichen in der Art in die Vorrichtung hinein- und aus ihr herauszuströmen, wie es vorstehend für die erste Ausführungsform beschrieben wurde.
Die Gase werden dazu veranlaßt in die Vorrichtung in folgender Art ein- und auszutreten. Wie in Fig. 6 dargestellt wird Luft dazu veranlaßt, von einer nicht gezeigten Luftversorgungsquelle außerhalb der Vorrichtung in die Vorrichtung durch einen Gaseinlaßanschluß 66' und dann in den Gaseinlaßschlauch 40 zu fließen. Gemäß Fig. 7 fließt das Gas von dem Schlauch 40 in den Zwischenhüllen-Gasraum 29 und diffundiert durch die Membranschichten 22 und 24 in den Zellkulturraum 26, in dem der Sauerstoff von den Zellen aufgenommen wird. Die gasförmigen Abfallprodukte diffundieren durch die Membranschichten 22 und 24 in den Zwischenhüllen- Gasraum 29. Gemäß Fig. 6 fließen die Gase dann durch den Gasauslaßschlauch 42 und verlassen die Vorrichtung durch den Gasauslaßanschluß 76' auf der Abschlußkappe 70', der in einer Gasverbindung mit dem Gasauslaßschlauch 42 steht.
Obwohl nur einer der jeweiligen Schläuche 40 und 42 dargestellt ist, ist in dieser Ausführungsform die Anzahl der Gaseinlaßschläuche 40 vorzugsweise um eins größer als die Anzahl der Gasauslaßschläuche 42. Man zieht es ebenfalls vor, daß sie entlang der gegenüberliegenden Längsränder der ersten äußeren Oberfläche der Hülle in abwechselnder Reihenfolge angebracht werden. Natürlich würden ein Gaseinlaßanschluß 66' und ein Gasauslaßanschluß 76' im Inneren der Vorrichtung angepaßt werden, eine Vielzahl der jeweiligen Schläuche 40 und 42 in einer Art zu erfassen, wie sie Fachleuten bekannt ist.
Diese Ausführungsform ist dahingehend vorteilhaft, daß kein Sauerstoffgradient im Zellkulturraum 26 erzeugt wird, so daß den Zellen, die in dem Bereich des Zellkulturraums wachsen, der am weitesten von der äußeren Oberfläche des Kerns angeordnet ist, nicht der nötige Sauerstoff für das Wachstum vorenthalten wird.
In den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen dieser Erfindung können Zellen dadurch, daß man ihnen erlaubt sich zuerst auf den Wänden der Hohlfasern und den inneren Oberflächen der Hülle abzusetzen, oder daß man ihnen erlaubt zwischen den Hohlfasern zu schweben, wie es in der U.S. 4,391,912 offenbart ist, gezüchtet werden.
Eine dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in den Fig. 8 bis 11 dargestellt. Diese Ausführungsform ist ähnlich der zweiten Ausführungsform; sie unterscheidet sich jedoch von der zweiten Ausführungsform in mehreren wichtigen Punkten. Zuerst sind, wie in Fig. 8 gezeigt, zwei Hüllen 80 und 90 vorhanden. Jede Hülle wird durch Darüberlegen und Verbinden einer gasdurchlässigen wasserabstoßenden Membranschicht 22 und 24 auf eine jeweils halbporöse wasseranziehende Membranschicht 82 und 92 mit einem geeigneten Kleber 21, der entlang aller vier Ränder der mindestens einen Membranschicht aufgebracht ist, hergestellt, wodurch jeweils ein Zellkulturraum 85 und 95 dazwischen gebildet wird. Geeignete Materialien für die gasdurchlässigen wasserabstoßenden Schichten schließen die vorstehend bei der Beschreibung der ersten Ausführungsform erwähnten mit ein. Geeignete Materialien für die halbporösen wasseranziehenden Schichten schließen die mit ein, die wie vorstehend erwähnt, zum Herstellen der Kapillaren verwendet wurden. Der Zellimpfungsschlauch 30 und der Produkternteschlauch 32 sind innerhalb der Hüllen 80 und 90, wie vorstehend für die zwei ersten Ausführungsformen beschrieben, angeordnet. Es ist anzumerken, daß bei dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung keine Kapillaren benutzt werden. Ein Gitter 23, wie vorstehend beschrieben, wird dann obenauf auf die Membranschichten 22, 82, 92 und 92 gelegt. Dann wird die Hülle 80 in der Weise über die Hülle 90 gelegt, daß sich die Membranschichten 82 und 92 gegenüber liegen und dann entlang ihrer beiden Seitenränder mit einem geeigneten Kleber verbunden werden. Ihre Längsränder bleiben unverschlossen.
Gemäß Fig. 9 wird ein geeigneter Kleber auf die ersten und zweiten Längs- und Seitenränder der äußeren Oberfläche der Schicht 22 aufgebracht. Dann werden die Gaseinlaßschläuche 40 und die Gasauslaßschläuche 42 an der äußeren Oberfläche der Schicht 22, wie vorstehend für die zweite Ausführungsform beschrieben, angeordnet und befestigt. Ein erster Seitenrand der Schicht 22 wird an dem Kern 54 entlang seiner längsseitigen Oberfläche befestigt. Der Kern ist in dieser Ausführungsform im wesentlichen der gleiche, wie er für die zweite Ausführungsform beschrieben wurde.
Die Hüllen 80 und 90, die wie beschrieben zusammengefügt und miteinander verklebt sind, werden spiralförmig um den Kern 54 gewickelt, auf dem nach Fertigstellung der Wicklung, der zweite Seitenrand 25 der Schicht 22 mit der äußeren Oberfläche der Schicht 24 der zuvor aufgewickelten Schicht der Hülle verklebt ist. Dieses ist in Fig. 10 dargestellt. Obwohl ein spiralförmig sich erstreckender Zwischenhüllenraum 89 und ein spiralförmig sich erstreckender Zwischenhüllenkanal 99 erzeugt werden, weisen beide ein darin enthaltenes Gitter für den Zweck auf, jeweils einen angemessenen Raum für den Gas und Mediendurchfluß aufrechtzuerhalten. Der Zwischenhüllenraum 89 wird durch die nebeneinander spiralförmig aufgewickelten Schichten 22 und 24 definiert, deren Seiten- und Längsränder miteinander dicht verschlossen sind. Der Kanal 99 wird durch die nebeneinanderliegenden spiralförmig aufgewickelten Schichten 82 und 92 definiert, deren Längsränder miteinander nicht verschlossen und deren Seitenränder miteinander dicht verschlossen sind.
Die aufgewickelte Untereinheit kann dann wahlweise mit einer Hülse oder Schale 16 zusammengebaut werden und dann erste und zweite Endabschlußkappen 60" und 70" aufweisen, die jeweils mit ersten und zweiten Enden des Gehäuses 16 verbunden sind, wie es vorstehend für die zweite Ausführungsform beschrieben wurde und in Fig. 11 dargestellt ist.
Frische Nährmedien werden veranlaßt von einer äußeren Medienversorgungsquelle durch einen Einlaßanschluß 64" in die Vorrichtung und in die Sammelkammer 63" zu stromen, die durch die Endabschlußkappe 60" und diejenige Ebene definiert ist, die durch die Oberfläche des Kerns 54 rechtwinklig zu seiner Längsoberfläche und durch die ersten Längsränder jeder der aufeinandergewickelten Schichten der Hüllen 80 und 90 definiert ist. Die Nährstoffmedien strömen dann in den Kanal 99 (dargestellt in Fig. 10), der zwischen den nicht verschlossenen sich nebeneinander spiralförmig erstreckenden Längsrändern der Schichten 82 und 92 in einer Flüssigkeitsverbindung mit der Kammer 63" steht und diffundieren in die Zellkulturräume 85 bzw. 95 wo sie von den Zellen aufgenommen wird. Verbrauchte Medien und wasserlösliche Stoffwechselabfallprodukte diffundieren von den Zellkulturräumen 85 und 95 jeweils durch die Membranschichten 82 und 92 in Kanal den 99 und werden über durchströmende Medien in eine zweite Sammelkammer 79" transportiert, die durch die Endabschlußkappe 70" und diejenige Ebene definiert ist, die durch die Oberfläche des Kerns 54 rechtwinklig zu seiner Längsachse und durch die zweiten Längsränder jeder aufeinandergewickelten Schicht der Hülle 80 und 90 definiert ist, und die in einer Flüssigkeitsverbindung mit dem Kanal 99 steht. Die Nährstoffmedien verlassen die Vorrichtung, indem sie durch den Auslaßanschluß 74" strömen, der in einer Flüssigkeitsverbindung mit der Kammer 79" steht.
Die Gase werden im wesentlichen so, wie es für die zweite Ausführungsform beschrieben wurde und in Fig. 10 und 11 dargestellt ist, in die Vorrichtung eingebracht und abgeführt. Wie in Fig. 11 dargestellt, strömt die Luft durch den Gaseinlaßanschluß 66" in die Vorrichtung, der im Inneren der Vorrichtung angepaßt ist, mit den Gaseinlaßschläuchen 40 in einer Gasverbindung zu stehen. Gemäß Fig. 10, strömt das Gas durch die Schläuche 40 in den Zwischenhüllenraum 89 und diffundiert jweils durch die Membranschichten 22 und 24 in die Zellkulturräume 85 und 95 und wird von den Zellen aufgenommen. Die gasförmigen Abfallprodukte verlassen die Zellkulturräume 85 und 95, indem sie jeweils durch die Membranschichten 22 und 24 und in den inneren Hüllenraum 89 diffundieren. Gemäß Fig. 11 strömen die Gase dann durch die Schläuche 42, die angepaßt sind in einer Gasverbindung mit dem Gasauslaßanschluß 76" auf der Endabschlußkappe der 70" zu stehen, und verlassen dadurch die Vorrichtung. In Fig 11 ist jeweils nur einer von den Schläuchen 40 und 42 dargestellt, da sie zueinander koplanar sind.
Folglich gewährleistet diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die getrennte Zufuhr und Abfuhr der Nährmedien und Gase zu und von den Zellen auch ohne den Einsatz von Kapillaren.
Jede der drei vorstehend beschriebenen Ausführungsformen kann auf die folgende Art modifiziert werden.
Um die Größe des Oberflächenbereichs im Zellkulturraum für das Aufbringen der Zellen zu erhöhen, können beliebige positiv geladene ungiftige Teilchen, mit einem Durchmesser von ungefähr 200 bis 400 um Durchmesser, wie z.B. Mikroträger, retikulierter Polyurethanschaum oder Silikatpartikel dem Zellkulturraum zugegeben und darin beim Zusammenfügen der Hülle mit eingeschlossen werden.
Eine große Vielfalt verschiedener Tierzellarten können in der Vorrichtung dieser Erfindung kultiviert werden, einschließlich z.B. Amphibien-, Säugetier-, und Vogelzellen, insbesondere aber Säugetierzellen. Beispiele hiervon schließen menschliche Lungenfibroplastenzellen, Rhesus-Affen- Nierenzellen, Vero-Zellen, MDCK-Zellen, Eizellen chinesischer Hamster, Hühner-Fibroblastenzellen, Mausembryo-Fibroblastenzellen und Nierenzellen von Baby-Hamstern ein. Bakterienzellen, Insektenzellen und Pflanzenzellen können ebenfalls darin kultiviert werden, aber diese Erfindung ist insbesondere für die Kultivierung von Tierzellen - wie oben aufgelistet - einsetzbar.
Die Vorrichtung ist auch für die Verwendung beliebiger konventioneller Nährstoffmedien, wie z.B. Eagle's Basalmedium, Dulbecco's modified minimum essential medium (MEM) und Earls oder Hanks ausgeglichener Salzlösung, die mit geeigneten Nährstoffen angereichert ist, fötaler Kalbsseren und anderer Materialien angepaßt.
Durch die Versorgung der Zellen mit Gas, wie z.B. mit Sauerstoff, in der erfindungsgemäßen Art, können Zellen ökonomischer herangezogen werden und Zellen und/oder Zellprodukte können mit größerer Ausbeute hergestellt werden, da der Durchsatz, mit der Sauerstoff zu den Zellen gebracht wird, um ein Vielfaches über das gesteigert wurde, was in Vorrichtungen nach dem Stand der Technik üblich ist. Zum Beispiel können wässrige Nährmedien, die im Gleichgewichtszustand mit Luft stehen, nur 4,5 ml Sauerstoff pro Liter bei 37ºC und 760 mm Hg Druck transportieren, während Luft unter denselben Bedingungen 209 ml Sauerstoff pro Liter transportieren kann. Demzufolge steht mindestens 46 (209/4,5) mal mehr Sauerstoff aus einem Liter Luft zur Verfügung als aus einem Liter Wasser. Da ferner ein Gas wie Luft bei jedem gegebenen Druck weniger viskos als Wasser ist, kann ein größere Menge Luft pro Zeiteinheit in die Zellkultur- Vorrichtung eingebracht werden, und auf diese Weise ein hoher Sauerstoffgradient erhalten werden. Daher kann in der vorliegenden Erfindung die Erhöhung der Zellenanzahl und/oder der Zellprodukten mindestens 10 bis 46 mal größer sein als die Ausbeute, die von konventionellen Vorrichtungen erhalten wird. Außerdem kann der Flüssigkeitsströmungsdurchsatz der nicht belüfteten Medien auf die Größenordnung von 100 bis 1000 ml Medium pro Stunde pro Quadratmeter der Zellkulturvorrichtung verringert werden. Es ist anzumerken, daß existierende Zellkultur-Vorrichtungen mit der Größenordnung von 500 ml Medium pro Minute pro Quadratmeter der Vorrichtung arbeiten, um die für das Zellwachstum erforderliche Sauerstoffmenge zu liefern. Die Verminderung des Strömungsdurchsatzes und die entsprechende Verminderung des inneren Drucks vereinfacht eine Vergrößerung in einen industriellen Maßstab.

Claims

1. Zellkultur-Vorrichtung mit:

(a) mindestens einer Hülle mit ersten und zweiten äußeren Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, daß die Hülle eine erste Membranschicht aufweist, die mit einer zweiten Membranschicht entlang ihrer jeweiligen ersten und zweiten Seiten- und Längsränder dicht verschlossen ist, um dazwischen einen Zellkulturraum zu definieren;

(b) einer ersten Versorgungsvorrichtung, zum Einbringen von Nährstoffen in den Zellkulturraum;

(c) einer zweiten Versorgungsvorrichtung, zum Einbringen von Zellen in den Zellkulturraum;

(d) einer dritten Versorgungsvorrichtung, zum Einbringen eines Gases in den Zellkulturraum;

(e) einem länglichen Kern mit einer Längsachse, auf den ein erster Seitenrand der Hülle parallel zur Achse aufgebracht ist, und um den die Hülle spiralförmig aufgewickelt ist, so daß die Längsränder in zwei Ebenen senkrecht zur Längsachse des Kerns angeordnet sind;

(f) einem Klebemittel, das entlang der gesamten Länge beider Längsränder der ersten äußeren Oberfläche der mindestens einen Hülle in der Weise aufgebracht ist, daß dann, wenn die Hülle spiralförmig um den Kern aufgewickelt ist, die Längsränder der ersten äußeren Oberfläche fest mit dem Kern verklebt sind und dann mit der zweiten äußeren Oberfläche einer zuvor aufgewickelten Schicht der Hülle verklebt sind, wodurch ein sich spiralförmig erstreckender Zwischenhüllen-Gasraum dazwischen ausgebildet wird;

(g) einer ersten Entsorgungsvorrichtung, zur Entsorgung der flüssigen Stoffwechselabfallprodukte aus dem Zellkulturraum;

(h) einer zweiten Entsorgungsvorrichtung, zur Entsorgung der Zellen und/oder Zellprodukte aus dem Zellkulturraum;

(i) einer dritten Entsorgungsvorrichtung, zur Entsorgung der gasförmigen Abfallprodukte aus dem Zellkulturraum;

(j) einer ersten Endabschlußvorrichtung, die neben einem ersten Ende des Kerns angebracht ist und Einlaßvorrichtungen aufweist, die mit den Versorgungsvorrichtungen in Verbindung stehen; und

(k) einer zweiten Endabschlußvorrichtung, die neben einem zweiten Ende des Kerns angebracht ist und Auslaßvorrichtungen aufweist, die mit mindestens einer der Entsorgungsvorrichtungen in Verbindung stehen.

2. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten und zweiten Membranschichten, die die Hülle bilden, porös und im wesentlichen gasdurchlässig sind, aber im wesentlich für Zellen und Flüssigkeiten undurchlässig sind.

3. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Membranschichten eine Porengröße von circa 0,02 bis 0,4 Mikrometer aufweisen.

4. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß jede von den Membranschichten medizinisches Silikon aufweist.

5. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Membranschichten eine Dicke von circa 0,125 mm bis 0,250 mm aufweisen.

6. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Hülle eine Länge in Längsrichtung relativ zu einem äußeren Umfang des Kerns aufweist, die es erlaubt, daß mehrere Hüllenschichten spiralförmig um den Kern gewickelt werden.

7. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Versorgungsvorrichtung und die erste Entsorgungsvorrichtung mehrere Kapillaren mit flüssigkeitsdurchlässigen Wandungen, die innerhalb der Hülle angeordnet sind, und offenen Enden aufweisen, die sich vom Zwischenraum der dicht verschlossenen Längsränder der Hülle nach außen erstrecken, so daß die Kapillaren mit dem Zellkulturraum nur über die Wandungen der Kapillaren in Verbindung stehen.

8. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillaren im wesentlichen im gleichen Abstand und im wesentlichen parallel zueinander angeordnet sind.

9. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillaren in einem gegenseitigen Abstand von circa 100 bis 1000 Mikrometern angeordnet sind.

10. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Versorgungsvorrichtung mindestens eine zwischen den ersten Längsrändern der Hülle angeordnete Schlauchvorrichtung aufweist, die in den Zellkulturraum hineinragt, so daß ein erster Endbereich der Schlauchvorrichtung mit dem Zellkulturraum in Verbindung steht und ein zweiter Endbereich der Schlauchvorrichtung mit einer Einlaßvorrichtung an der ersten Endabschlußvorrichtung in Verbindung steht.

11. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Kern gasdurchlässig ist.

12. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Kern ein Hohlmaterial aufweist, dessen Umfangsoberfläche perforiert ist.

13. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Versorgungsvorrichtung in den Kern an einem ersten Ende davon eingreift, um so eine flüssigkeitsdichte Verbindung mit ihm zu bilden, wodurch Gas in den Kern eintreten kann und dadurch, daß sie auch mit der Einlaßvorrichtung an der ersten Endabschlußvorrichtung in Verbindung steht.

14. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein dem ersten Ende gegenüberliegendes zweites Ende des Kerns mit einer Verschlußvorrichtung verschlossen ist, um daraus das Entweichen von Gas zu verhindern.

15. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Entsorgungsvorrichtung eine Öffnung aufweist, die durch den zweiten Seitenrand der Hülle und die zweite äußere Oberfläche einer zuvor aufgewickelten Schicht der Hülle definiert ist, durch die gasförmige Abfallprodukte die Vorrichtung verlassen können.

16. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Entsorgungsvorrichtung mindestens eine zwischen den zweiten Längsrändern der Hülle angeordnete schlauchförmige Vorrichtung aufweist, die in den Zellkulturraum hineinragt, so daß ein erster Endbereich der Schlauchvorrichtung mit dem Zellkulturraum in Verbindung steht und ein zweiter Endbereich der Schlauchvorrichtung mit der Ausläßvorrichtung an der zweiten Endabschlußvorrichtung in Verbindung steht.

17. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Klebemittel zusätzlich entlang der gesamten Länge des zweiten Seitenrandes der ersten äußeren Oberfläche der Hülle aufgebracht ist, so daß der Rand fest mit der zweiten äußeren Oberfläche der zuvor aufgewickelten Schicht der Hülle verklebt ist.

18. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Kern gasundurchlässig ist.

19. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Versorgungsvorrichtung mindestens eine schlauchförmige Vorrichtung aufweist, die an der ersten äußeren Oberfläche der mindestens einen Hülle angeordnet und befestigt ist, und die sich zumindest entlang eines Teilbereichs der Oberfläche erstreckt, um so parallel mit der Längsachse des Kerns zu verlaufen, und die sich auch von der Hülle nach außen erstreckt, um mit der Einlaßvorrichtung an der ersten Endabschlußvorrichtung in Verbindung zu stehen.

20. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Entsorgungsvorrichtung mindestens eine schlauchförmige Vorrichtung aufweist, die an der ersten äußeren Oberfläche der mindestens einen Hülle angeordnet und befestigt ist, und die sich zumindest entlang eines Teilbereichs der Oberfläche erstreckt und die sich ebenfalls von der Hülle nach außen erstreckt, um so mit der Auslaßvorrichtung an der zweiten Endabschlußvorrichtung in Verbindung zu stehen.

21. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Versorgungseinrichtung und die erste Entsorgungseinrichtung mehrere innerhalb der Hülle angeordnete Kapillaren aufweisen, und daß sich deren offene Enden aus dem Zwischenraum der dicht verschlossenen Längsränder der Hülle nach außen erstrecken, so daß die Kapillaren mit dem Zellkulturraum nur über die Wandungen der Kapillaren in Verbindung stehen.

22. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine Ebene, definiert durch eine Oberfläche des Kerns, die senkrecht zu seiner Längsachse steht und durch die ersten Längsränder der spiralförmig aufgewickelten Hülle, zusammen mit der ersten Endabschlußvorrichtung eine erste Sammelkammer definiert, die mit einem offenen Ende der Kapillaren in Verbindung steht.

23. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine Ebene, definiert durch eine Oberfläche des Kerns, die senkrecht zu seiner Längsachse steht und durch die zweiten Längsränder der spiralförmig aufgewickelten Hülle, zusammen mit der zweiten Endabschlußvorrichtung eine zweite Sammelkammer definiert, die mit einem offenen Ende der Kapillaren in Verbindung steht.

24. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zwei Hüllen mit im wesentlichen gleichen Abmessungen aufweist, wobei jede der beiden Hüllen durch Übereinanderlegen und Verbinden einer gasdurchlässigen wasserabstoßenden Membranschicht auf eine halbporöse wasseranziehende Membranschicht entlang ihrer jeweiligen ersten und zweiten Seiten- und Längsränder gebildet wird, um einen Zellkulturraum dazwischen zu definieren, unter der weiteren Vorraussetzung, daß eine erste Hülle über eine zweite Hülle gelegt ist, so daß die wasseranziehende Membranschicht der ersten Hülle der wasseranziehenden Membranschicht der zweiten Hülle gegenüberliegt und mit ihr entlang ihrer ersten und zweiten Seitenränder verbunden ist.

25. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die wasseranziehende Membranschicht regeneriertes Zelluloseazetat aufweist.

26. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Versorgungsvorrichtung und die erste Entsorgungsvorrichtung einen spiralförmig sich erstreckenden Kanal aufweisen, der zwischen den beiden Hüllen in der Art definiert ist, daß Nährstoffe durch ihn zwischen den ersten und zweiten nicht verschlossenen Längsrändern hindurchfließen können.

27. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Versorgungsvorrichtung und die dritte Entsorgungsvorrichtung an einer äußeren Oberfläche der gasdurchlässigen wasserabstoßenden Membranschicht von einer der beiden Hüllen angeordnet und befestigt sind.

28. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gitter auf mindestens einer Membranschicht von mindestens einer Hülle angeordnet ist.

29. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Gitter ein nicht gewebtes Kunststoffsieb aufweist.

30. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß eine äußerste Schicht einer spiralförmig aufgewickelten Hülle innerhalb einer Schalenvorrichtung angeordnet ist.

31. Zellkultur-Vorrichtung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Schalenvorrichtung eine durch Hitze schrumpfbare thermoplastische Umhüllung aufweist.

32. Zellkultur-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung innerhalb einer Schalenvorrichtung angeordnet ist, die im wesentlichen gasdurchlässig und/oder perforiert ist.