DE69633779T2

DE69633779T2 - Zellkulturbehälter mit mehreren kammern

Info

Publication number: DE69633779T2
Application number: DE69633779T
Authority: DE
Inventors: Martin Wolf; John R. Wilson
Original assignee: WILSON WOLF CORP; WILSON WOLF CORP NEW BRIGHTON
Current assignee: Wheaton Industries Inc
Priority date: 1995-03-30
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2016-03-29
Also published as: ATE281515T1; JPH11502716A; JP3693180B2; EP0817834A1; US5714384A; DE69633779D1; EP0817834A4; EP0817834B1; WO1996030497A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Züchten von Zellen oder Gewebe in vitro.
BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
Die Züchtung von Säugetierzellen in vitro kann in statischen Kulturbehältern, wie etwa Lifecell^TM Beuteln (Baxter Travenol) SteriCell^TM Beuteln (DuPont) durchgeführt werden. Diese Kulturvorrichtungen sind beliebt, da sie leicht anzuwenden sind und auf der passiven Diffusion zur Unterstützung der Stoffwechselbedürfnisse der Zellen basieren. Bei dieser Art der Kultur wird ein Teil des Zellkulturmediums periodisch aus dem Beutel entfernt und ersetzt, wenn die Zellen Nährstoffe verbrauchen und Abfallprodukte erzeugen. Dieses Protokoll führt zu den Nachteilen der eingeschränkten Zelldichte, der beschränkten Konzentration eines sekretierten Zellprodukts und der periodischen Verschiebungen der Nährstoffkonzentration.
Um diese Nachteile zu überwinden, müssen Zellen und sekretierte Zellprodukte in den Kulturbehältern zurückgehalten werden, wenn die Nährstoffe ergänzt werden. Marbrook verwendete eine Dialysemembran, um Zellen und sekretierte Zellprodukte von dem Basalmedium zu trennen, welche passive Diffusion zuließ, um die Stoffwechselbedürfnisse der Zellen zu erfüllen (Marbrook, J., "Primary Immune Response in Cultures of Spleen Cells", the Lancet, 2, 1279–1281 [1967]). In dieser Vorrichtung sitzt eine innere konzentrische Kammer innerhalb einer äußeren konzentrischen Kammer. Der Boden der inneren Kammer enthält eine Dialysemembran, die in dem in der äußeren Kammer enthaltenen Basalmedium eingetaucht ist. Zellen sitzen auf der Membran und erhalten Nährstoffe und scheiden Abfallprodukte aus. Die kontinuierliche Dialyse wird eingeschränkt, wenn die Membran aufgrund der darauf sitzenden Zellmasse Substrattransportkapazität verliert. Somit wird die Fähigkeit zur Durchführung einer Langzeitkultur beeinträchtigt.
Verma (US-Patent Nr. 4,296,205, erteilt am 20. Oktober 1981) lehrt die Verwendung einer Gewebekulturplatte, die in dem Zellkulturfach platziert wird, um Zellen von dem direkten Kontakt und dem Blockieren der Dialysemembran abzuhalten. Die Gewebekulturplatte hat Perforationen, um die Bewegung von Nährstoffen zu den Zellen zu erlauben. Während der Kultivierung von Suspensionszellen können die Zellen und Zellteile sich durch die Perforation bewegen und kommen auf der Dialysemembran zur Ruhe, wodurch die kontinuierliche Dialyse in einer Langzeitkultur eingeschränkt wird. Ferner kann der konstruktive Aufbau der Platte zu Microumgebungen führen, da die Konzentrationsgradienten über die Oberfläche der Platte ungleichmäßig verteilt sind.
Vogler (US-Patent Nr. 4,748,124, erteilt am 31. Mai 1988) beschreibt eine Zellkulturkammer, die durch eine untere, gaspermeable, flüssigkeitsimpermeable Folie und eine obere Dialysemembran begrenzt ist. Diese Konfiguration hält die Dialysemembran frei von Blockierungen, da sich die Zellen nicht darauf ansiedeln, aber die Dialyse kann durch andere Einflüsse beschränkt werden. Wie bei herkömmlichen Zellkulturbeuteln beschränkt die Konfiguration von Vogler gegenüber Marbrook und Verma die Fähigkeit, die Sauerstoffspannung zu variieren. Ferner ist die Oberflächenchemie der zum Ermöglichen der Gasübertragung verwendeten Materialien beschränkt und in einigen Fällen kann sie für den Protein- oder Zellkontakt unerwünscht sein. Schließlich führt die Lehre nicht zu einer Zellkultur mit hoher Dichte gegenüber den herkömmlichen statischen Kultivierungsverfahren.
Die Architektur von Vogler kann es zulassen, dass die Dialyse der Zellkammer beschränkt wird. Ein Problem kann entstehen, wenn Flüssigkeit aus der Wachstumskammer verdunstet. Die Dampfübertragung über gaspermeable Oberflächen kann beträchtlich sein und der Flüssigkeitsverlust führt zur Beendigung der Dialyse, da der Flüssigkeitskontakt mit der Dialysemembran unterbrochen wird.
Die EP-A-0 155 237 A beschreibt einen Prozess zum Kultivieren von Zellen oder Mikroorganismen, welcher Prozess in einem Reaktor mit mindestens 3 benachbarten Kammern durchgeführt wird, von welchen mindestens eine eine Zellwachstumskammer ist, die zweite einem Mediumkammer ist und die dritte eine Produktkammer ist. Die einzelnen Kammern sind durch Membranen getrennt. Eine Nährstofflösung fließt in Längsrichtung durch die Mediumkammer.
In den herkömmlichen Beutelkonfigurationen wie auch in der von Vogler beschränkt die gaspermeable, flüssigkeitsimpermeable Folie der Zellkulturkammer die zur Steuerung von perizellulärem pH und P_O2 verfügbaren Optionen. In den früheren Konfigurationen von Marbrook und Verma könnte die Sauerstoffspannung durch Einstellen des Flüssigkeitspegels der Zellkulturkammer variiert werden. Das von Vogler gelehrte Verfahren und der Aufbau machen es erforderlich, die Sauerstoffspannung durch Änderung der Umgebungsbedingungen der die Vorrichtung umgebenden Atmosphäre zu variieren.
Die Sauerstoffspannung ist für die Lebensfähigkeit von Zellen und die Proteinsekretion sehr wichtig (Reuveny et al., "Factors Affecting Cell Growth and Monoclonal Antibody Production in Stirred Reactors", Journal of Immunological Methods, 86, 53–59 [1986)). Die Gaspermeabilität von handelsüblichen flüssigkeitsimpermeablen Folien und die Auswirkung auf den perizellulären pH und P_O2 wird im Detail von Jenson et al. beschrieben (Jenson M. D., Wallach D. F. H. und Sherwood P., "Diffusion in Tissue Cultures on Gas-permeable and Impermeable Supports", J. Theor. Biol. (1976) 56, 443–458). Der Sauerstoffbedarf von verschiedenen Zelltypen in Kombination mit der Gaspermeabilität von verschiedenen gaspermeablen, flüssigkeitsimpermeablen Folien schreibt einen bestimmten Dauerzustand des perizellulären pH und P_O2 für jede Kombination vor. Dies bedeutet, dass Zelllinien sehr eingeschränkten perizellulären Bedingungen unterliegen. Die Schaffung von unterschiedlichen perizellulären Bedingungen wird erzielt, indem die Umgebungsbedingungen des Brutschranks geändert werden, in dem die Vorrichtung untergebracht ist. In der Praxis ist dies für Forscher schwierig, die Brutschränke unter Standardbedingungen für eine große Vielzahl von gleichzeitigen Anwendungen unterhalten.
Gaspermeable, flüssigkeitsimpermeable Folien schränken auch die Oberflächenchemie ein, die zum Tragen von Zellen und Proteinstrukturen verfügbar ist. Die Proliferation und Funktion vieler Zelltypen wird durch die chemische Art der Oberflächen, auf denen sie liegen, stark beeinflusst. Die Oberflächenchemie von flüssigkeitsimpermeablem, gaspermeablem Material ist mit vielen Zelltypen und Proteinstrukturen inkompatibel. Ferner kann hydrophobes Material, das oftmals als die Basis für gaspermeable, flüssigkeitsimpermeable Folien verwendet wird, eine unspezifische Proteinbindung verursachen. Dies kann wiederum zur Erschöpfung von löslichen Wachstumsfaktoren führen. Somit kann eine weitere Modifikation der Materialien erforderlich sein, um die Zellumgebung zu optimieren.
Die Architektur von Vogler führt ferner zu einer beschränkten Zelldichte. Die Wachstumskammer verformt sich aufgrund des Gewichts der darauf lastenden Flüssigkeit und des Drucks der Flüssigkeitsausdehnung, was zu einem Durchsacken der gaspermeablen Folie führt. Damit können sich Suspensionszellen an dem Tiefpunkt der Folie ansiedeln. Hohe lokalisierte Zelldichten an dem Tiefpunkt der Folie führen zu einem übermäßigen Widerstand gegen den Nährstofffluss und eine lokalisierte Verminderung der Lebensfähigkeit der Zellen. Ferner sind die Zellen nicht in der Lage, sich auf andere Bereiche der gaspermeablen Folie auszudehnen.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung in einem in Kammern unterteilten Zellkulturbeutelformat für die Langzeitkultivierung von von einer Verankerung abhängigen Zellen und Suspensionszellen mit hoher Dichte zu schaffen, die gleichzeitig eine variable Sauerstoffspannung, eine gleichmäßige Verteilung der Zellen über den Boden der Kulturkammer, eine ununterbrochene Dialyse und eine breite Vielzahl von Optionen der Oberflächenchemie ermöglichen. Vorteilhafterweise nutzen sowohl das Verfahren als auch die Vorrichtung passive Diffusion, um die Stoffwechselbedürfnisse der Zellen zu erfüllen. Weitere Aufgaben und Vorteile werden aus der Betrachtung der nachfolgenden Beschreibung und der Zeichnungen deutlich.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Viele Probleme nach dem Stand der Technik werden durch einen in Kammern unterteilten Zellkulturbeutel gelöst, der gemäß dieser Erfindung aufgebaut ist, um die Kultivierung von Zellen mit hoher Dichte über einen langen Zeitraum zu ermöglichen.
Es wird eine Zellkulturvorrichtung geschaffen, enthaltend einen Behälter, versehen mit einer Basalmedium-Zugangsöffnung und einer Öffnung, einer flexiblen Wand, einer oberen Membran, die für Verbindungen mit ausgewählten Grössen permeabel ist und für Zellen impermeabel ist und über der Öffnung positioniert ist, wobei der Behälter und die obere Membran zusammen eine Basalmediumkammer bilden, einer unter der oberen Membran angeordneten gaspermeablen Folie, die mit der oberen Membran eine Zellkulturkammer bildet, einer Zugangseinrichtung zwischen dem Inneren der Zellkulturkammer und ihrer Außenseite, wodurch eine Zellkultur in die Zellkulturkammer eingeführt und aus dieser entnommen werden kann, und einem Gasfolienträger unter der gaspermeablen Folie, wobei ein Abschnitt der gaspermeablen Folie in einem Abschnitt der Fläche unmittelbar unter der Zellkulturkammer in einer Weise in Kontakt mit dem Gasfolienträger steht, dass die gaspermeable Folie in einer im wesentlichen horizontalen Position ausgerichtet ist, so dass Zellen sich über den horizontalen Abschnitt der gaspermeablen Folie verteilen können, welcher Gasfolienträger so ausgelegt ist, dass er mindestens eine Gaszugangsöffnung hat, so dass Gas aus der umgebenden Atmosphäre in Kontakt mit der Unterseite der gaspermeablen Folie kommen kann.
Für eine Zellkultur mit hoher Dichte beträgt die Oberfläche der oberen Membran mindestens ein Viertel der Oberfläche der gaspermeablen Folie und der durchschnittliche Abstand zwischen dem im wesentlichen horizontalen Abschnitt der gaspermeablen Folie und der oberen Membran beträgt weniger als 5 mm. Die kleinste Querschnittsfläche des Gasfolienträgers, die offen für den Gasaustausch mit der umgebenden Atmosphäre ist, ist kleiner als die gesamte Oberfläche der Unterseite der gaspermeablen Folie, die in Kontakt mit Gas ist.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung enthält die gaspermeable Folie Abschnitte, die in die Zellkulturkammer vorspringen.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung enthält die Basalmediumkammer eine Wand, die flexibel ist.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung beschränkt eine Gasaustauschkammer, die den oberen Innenraum der Basalmediumkammer mit dem Raum unter der gaspermeablen Folie verbindet, den Verdunstungsverlust aus der Zellkulturkammer. Die Gasaustauschkammer kann so aufgebaut sein, dass sie das Eindringen von Basalmedium verhindert, und kann eine Zugangsöffnung für die Gasaustauschkammer enthalten, durch welche Kondensation entfernt werden kann und ein anderes Gas als dasjenige der Basalmediumkammer mit der Unterseite der gaspermeablen Folie kommunizieren kann.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung kann die Sauerstoffspannung innerhalb der Zellkulturkammer durch Einschließen einer zweiten gaspermeablen Folie geändert werden, die in einer horizontalen Position unter der ersten gaspermeablen Folie angeordnet ist, wobei eine Einrichtung vorgesehen wird, die die erste gaspermeable Folie von der zweiten gaspermeablen Folie trennt, um eine variable Sauerstoffkontrollkammer zu bilden, die so ausgelegt ist, dass sie Fluid enthält, sowie eine Zugangsöffnung zu der Sauerstoffkontrollkammer, wodurch Flüssigkeit zugegeben oder entfernt werden kann, um die Rate des Gastransports zu kontrollieren.
Mit diesen Strukturen wird ein Verfahren zum Kultivieren von Zellen mit hoher Dichte verfügbar. Ferner wird ein Verfahren zum Kontrollieren der die Zellen umgebenden Sauerstoffspannung durch Verwendung einer Flüssigkeitssperre den gegen den Sauerstofffluss verfügbar.
Es wird somit ein Verfahren zum Kultivieren von Zellen in einer Vorrichtung der beschriebenen Art geschaffen, enthaltend

a) Einführen eines Basalmediums in die Basalmediumkammer,
b) Einführen von Zellen und eines Zellkulturmediums in die Zellkulturkammer, und
c) Halten der Zellkulturkammer auf einer vorbestimmten Temperatur, wodurch Zellen auf der oberen Oberfläche der gaspermeablen Folie wachsen und innerhalb der Zellkulturkammer erzeugtes Gas durch die gaspermeable Folie tritt.

Mit der dergestalt dargelegten Erfindung werden mit dem Stand der Technik verbundene Probleme gelöst. Die Kultivierung sowohl von Suspensionszellen als auch von anhaftenden Zellen über einen langen Zeitraum mit hoher Dichte ist unter gleichzeitigen Vorkehrungen für eine variable Sauerstoffspannung, kontrollierte Verdunstung, die Langzeit-Unterhaltung von kleinen Zellkammer-Flüssigkeitsvolumina und ununterbrochene Dialyse möglich.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine vertikale Querschnittsansicht durch einen in Kammern eingeteilten Zellkulturbeutel gemäß vorliegender Erfindung;
2 ist eine Querschnittsansicht eines in Kammern eingeteilten Zellkulturbeutels, die eine Ausführungsform zeigt, die eine gaspermeable Membran verwendet, von der Abschnitte in die Zellkulturkammer vorspringen;
3 ist eine perspektivische Ansicht eines Gasfolienträgers aus 1 und 2;
4 ist eine Querschnittsansicht durch den Gasfolienträger aus 3;
5 ist eine vertikale Querschnittansicht durch eine Ausführungsform, die die Verdunstung des Zellkulturmediums kontrolliert;
6 ist eine vertikale Querschnittsansicht durch eine Ausführungsform, die eine variable Sauerstoffspannung ermöglicht; und
7 ist eine vertikale Querschnittsansicht durch eine Ausführungsform, die das Volumen der Zellkulturkammer begrenzt.
Detaillierte Beschreibung
Nachfolgend wird im Detail auf die Zeichnungen Bezug genommen. 1 zeigt eine Querschnittsansicht eines in Kammern unterteilten Zellkulturbeutels 10. Eine Membran 20 teilt den in Kammern unterteilten Zellkulturbeutel 10 in einer Basalmediumkammer 30 und eine Zellkulturkammer 40. Ein Kulturmedium 50, das Zellen oder Gewebe enthält, liegt in der Zellkulturkammer 40. Ein Basalmedium 60 ist in der Basalmediumkammer 30 untergebracht. Der Zugang zu der Zellkulturkammer 40 wird durch eine Zugangsöffnung 70 zur Zellkulturkammer ermöglicht. Der Zugang zu der Basalmediumkammer 30 wird durch eine Zugangsöffnung 90 zum Basalmedium ermöglicht. Eine gaspermeable Folie 120 liegt oben auf einem Gasfolienträger 130, der so ausgelegt ist, dass er Gas, beispielsweise der Umgebungsatmosphäre, den Kontakt mit dem überwiegenden Anteil der Oberfläche der gaspermeablen Folie 120 durch Gaszugangsöffnungen 140 gewährt. Füße 150 positionieren die Oberseite des Gasfolienträgers 130 über der Oberfläche, auf der der in Kammern unterteilte Zellkulturbeutel 10 liegt.
Während des Betriebes wird Basalmedium 60 durch die Zugangsöffnung 90 zur Basalmediumkammer in die Basalmediumkammer 30 gegeben. Die Kappe 100 der Zugangsöffnung zum Basalmedium wird auf die Zugangsöffnung 90 zum Basalmedium aufgesetzt. Die Membran 20 wird durch das Gewicht des Basalmediums 60 auf die Oberfläche der gaspermeablen Folie 120 gedrückt. Die Membran kann auch vor dem Einführen des Basalmediums 60 in diese Position gebracht werden, indem durch die Zugangsöffnung 70 zur Zellkulturkammer ein Vakuum in der Zellkulturkammer 40 erzeugt wird. Ein vorbestimmtes Volumenkulturmedium 50, das die gewünschte Kultur enthält, wird anschließend durch die Zugangsöffnung zur Zellkulturkammer in die Zellkulturkammer 40 eingeführt. Die Kappe 80 der Zugangsöffnung zur Zellkulturkammer wird anschließend auf die Zugangsöffnung 70 zur Zellkulturkammer aufgesetzt.
Die Membran 20 erlaubt den freien Durchtritt von Nährstoffen von dem Basalmedium 60 in das Zellkulturmedium 50 und den freien Durchtritt von Abfallprodukten von dem Zellkulturmedium 50 in das Basalmedium 60. Die Membran 20 hält Zellen und ausgewählte Verbindungen in der Zellkulturkammer 40 zurück.
Die Membran 20 ist ein Material, das für eine Klasse von Molekülen selektiv permeabel ist. Mehrere Materialarten sind akzeptabel, einschließlich Zellulose, Polyacrylnitril, Polysulfon, Polycarbonat und Polyacrylamid. Beispielsweise werden Dialysemembranen, die Moleküle und Verbindungen mit Molekulargewichten von mehr als 15.000 zurückhalten, allgemein zur Kultivierung von Maus-Hybridomazellen verwendet. Durch Verwendung einer Membran mit dieser Charakteristik werden Zellen, Wachstumsfaktoren und sekretierte Antikörper in der Zellkulturkammer 40 zurückgehalten. In anderen Anwendungen kann es vorteilhaft sein, größeren Molekülen und Verbindungen den freien Durchtritt zwischen dem Basalmedium 60 und dem Kulturmedium 50 zu erlauben. Beispielsweise kann eine Lymphozytenkultur mit hoher Dichte die Anwesenheit einer großen Menge von wachstumsstimulierenden Faktoren erfordern. Diese Faktoren, wie z. B. Interleukin 2, können in das Basalmedium 60 und das Kulturmedium 50 eingeführt werden. Durch geeignete Auswahl der Porengröße der Membran 20 kann den Lymphozyten eine größere Quelle dieser Faktoren verfügbar gemacht werden.
In den meisten Anwendungen überschreitet die Membran 20 eine Molekulargewichtsgrenze von 150.000 Dalton nicht. Es gibt jedoch Anwendungen, bei welchen auch größere Porengrößen wünschenswert sein können. Wenn der Zweck beispielsweise nur die Kultivierung einer großen Anzahl von Zellen ist, kann jede Porengröße verwendet werden, die die Zellen in der Zellkulturkammer 40 zurückhält. In diesem Fall könnte eine Microporen-Polycarbonatmembran mit 0,2 μM oder 0,45 μM verwendet werden, wie beispielsweise von Poretics Corporation (Livermore, Kalifornien) erhältlich.
Die gaspermeable Folie 120 ist ein biokompatibles Material, das in der Lage ist, die Übertragung von Gas in die und aus der Zellkulturkammer 40 zuzulassen. Die gaspermeable Folie 120 kann entweder flüssigkeitspermeabel oder -impermeabel, hydrophob oder hydrophil, porös oder nicht porös sein. Die Dicke kann in dem Bereich über oder unter 0,25 mm liegen. Die beste Auswahl ist von der spezifischen Anwendung abhängig. Als allgemeine Leitlinie sollte die Gaspermeabilität einer gegebenen Membran zusätzlich zu der Wechselwirkung der Membran entweder mit Zellen oder Proteinstrukturen berücksichtigt werden. Flüssigkeitsimpermeable Folien mit gleicher Dicke schaffen verschiedene Sauerstoffspannungen im Fließgleichgewicht an der Grenzfläche zwischen gaspermeabler Folie und Zelle. FEP Teflon, Silicon und Silicon-Polycarbonat-Copolymere schaffen höhere Sauerstoffspannungen als Polyethylen, Polycarbonat, Polypropylen, Polysulfon oder Polypropylenfolien mit gleicher Dicke. Bei Anwendungen, in denen die Proteindenaturierung, die unspezifische Proteinbindung, die Beschädigung der Zellmembran oder die Zellanhaftung durch die Oberflächenchemie der Folie beeinflusst wird, sind hydrophile Oberflächen besser geeignet. In Anwendungen, bei denen es wünschenswert ist, die gesamte Zellmembran in Kontakt mit Wasser zu halten, können hydratisierte Gele am besten geeignet sein.
Die Verwendung von bestimmten Materialien, die normalerweise nicht mit dem Gasaustausch in Verbindung gebracht werden, kann die verfügbaren Optionen zur Kontrolle der Sauerstoffspannung an der Grenzfläche zwischen Zelle und gaspermeabler Folie erweitern. Beispielsweise hat nicht poröses Zelluloseacetat eine relativ niedrige Sauerstoff-Gaspermeabilität in der Größenordnung von 7,3 × 10^–9 cm³·cm/(sec·cm²·atm). Wenn Zelluloseacetat porös gemacht wird, erhöht dies die Sauerstoffpermeabilität, da es Kulturmedium 50 mit einer Sauerstoffpermeabilität von 1,4 × 10^–6 cm³·cm/(sec·cm²·atm) absorbiert. Auf diese Weise kann eine variierende Sauerstoffspannung an der Grenzfläche zwischen gaspermeabler Folie und Zelle der Zellkulturkammer 40 erreicht werden, indem die Menge des in der gaspermeablen Folie 120 vorhandenen Kulturmediums 50 kontrolliert wird. Auf diese Weise werden Veränderungen der Sauerstoffspannung entweder durch variierende Porengröße, Porosität oder Krümmung der gaspermeablen Folie 120 erzielt.
Die Ausführungsform aus 2 zeigt eine Konfiguration, bei der Abschnitte der gaspermeablen Folie 120 in die Zellkulturkammer 40 vorspringen, um eine zusätzliche Fläche für die Gasübertragung bereitzustellen. Silicon ist eine gute Materialwahl, da es ohne weiteres in eine geeignete Form gebracht werden kann. Die Wandstärke kann minimiert werden, um eine zusätzliche Gasübertragung in die Zellkulturkammer 40 zu erlauben. Im Fall von Silicon sollte die durchschnittliche Wandstärke unter etwa 0,015 Zoll (0,0381 cm), vorzugsweise zwischen etwa 0,004 Zoll (0,01016 cm) und 0,012 Zoll (0,03048 cm) gehalten werden.
Der Gasfolienträger 130 hält die gaspermeable Folie 120 in einer im wesentlichen horizontalen Position und stabilisiert die gaspermeable Folie 120, um ein Durchhängen zu vermeiden. Es sollte sorgfältig sichergestellt werden, dass die Flachheit der gaspermeablen Folie so beschaffen ist, dass Zellen nicht zu niedrigen Punkten rollen oder sich anderweitig dort ansammeln. Dies kann unerwünscht sein, da das Aufhäufen von Zellen Beschränkungen der Diffusion erzeugt und zum Zelltod führt. Andererseits muss auch sorgfältig sichergestellt werden, dass ein adäquater Gasaustausch möglich ist. Somit ist das Ausmaß des Kontakts, den der Gasfolienträger 130 mit der gaspermeablen Folie 120 hat, von der Steifigkeit und der Gaspermeabilität der gaspermeablen Folie 120 sowie von den Erfordernissen hinsichtlich Gasaustausch und Stoffwechsel einer bestimmten Zellkulturanwendung abhängig. Es ist zu erwarten, dass die meisten Zelllinien bei etwa 10 bis 15 Zellschichten hinsichtlich der Diffusion eingeschränkt sind.
Der Gasfolienträger 130 wirkt auch so, dass er die gaspermeable Folie 120 gegen Verunreinigungen oder Löcher schützt. Ein möglichst geringer Kontakt mit der gaspermeablen Folie 120 wird hergestellt, um die größtmögliche Oberfläche für die Gasübertragung freizulassen. Die Gaszugangsöffnung 140 ist so dimensioniert, dass ein angemessener Gasaustausch der Zellkulturkammer 40 ermöglicht wird, während die Verdunstung minimiert wird. In der bevorzugten Ausführungsform ist der Gasfolienträger 130 ein flexibles Gitter, das gerollt werden kann, um das Verpacken des in Kammern unterteilten Beutels 10 in einen Behälter mit kleinstmöglichem Volumen zu erlauben. Wenn der in Kammern unterteilte Beutel 10 zur Benutzung ausgerollt wird, bietet der Gasfolienträger 130 eine strukturell stabile Oberfläche und verhindert, dass die gaspermeable Folie 120 unter dem Gewicht des Basalmediums 60 und des Zellkulturmediums 50 durchsackt.
3 und 4 zeigen ein Beispiel, wie dies erreicht werden kann. 3 ist eine perspektivische Ansicht eines kleinen Abschnitts des Gasfolienträgers 130. 4 ist eine Querschnittsansicht von 3. Füße 150 erhöhen den Gasfolienträger 130 und erlauben die Übertragung durch die Gaszugangsöffnungen 140. Stifte 250 halten die gaspermeable Folie 120 in einer im wesentlichen horizontalen Position, während sie das Gewicht des Basalmediums 60 auf die Füße 150 übertragen. Durch die Herstellung des Gasfolienträgers 130 aus einem flexiblen Material, wie z. B. Polypropylen, kann der Gasfolienträger 130 gerollt werden, wenn er nicht genutzt wird.
Ein weiterer zu berücksichtigender Punkt im Hinblick auf die Materialauswahl für die gaspermeable Folie 120 ist die Feuchtigkeitsdampfübertragungsrate. Aus dem Kulturmedium 50 tritt in Abhängigkeit von dem Material der gaspermeablen Folie 120 Verdunstung mit verschiedenen Raten auf. Die Begrenzung der Querschnittsfläche der Gaszugangsöffnung 140 kann die Verdunstungsrate vermindern, obgleich die Flüssigkeitsverlustrate auch eine Funktion der Umgebungsfeuchte ist, die schwieriger zu kontrollieren ist. Die Ausführungsform aus 5 befasst sich mit diesem Punkt.
Zwischen dem Basalmedium 60 und der Oberseite der Basalmediumkammer 30 vorhandenes Gas wird durch das Basalmedium 60 befeuchtet. Das Gas wird durch einen Gaszugangskanal 160 in Kommunikation mit der Unterseite der gaspermeablen Folie 120 gebracht. Eine Abdeckung 170 des Gaszugangskanals ist optional. Sie verhindert, dass Basalmedium 60 in den Gaszugangskanal 160 eindringt und die Gasübertragung beschränkt. Die Abdeckung 170 des Gaszugangskanals ist eine poröse, gaspermeable, flüssigkeitsimpermeable Belüftungsmembran. Um zu verhindern, dass sich Kondensation an der Abdeckung 170 des Gaszugangskanals ansammelt und die Gasübertragung vermindert, ist sie nicht in einer horizontalen Position. Auf diese Weise kann die Kondensation durch Schwerkraft zu dem Basalmedium 60 rückgeführt werden. Der Gaszugangskanal 160 kann Kondensation in einer Ablauföffnung 180 sammeln.
In dieser Ausführungsform ist die Kappe 100 der Basalmediumzugangsöffnung belüftet, um die Übertragung von O₂ und CO₂ in die und aus der Basalmediumkammer 30 zu ermöglichen. Wenn die Wände der Basalmediumkammer 30 hoch gaspermeabel sind, ist eine Belüftung nicht erforderlich.
Viele andere Verfahren, um den Raum über dem Basalmedium in Kommunikation mit der gaspermeablen Folie 120 zu bringen, sind möglich. Mit Sorgfalt sollte verhindert werden, dass Kondensation oder Basalmedium 60 die Gasübertragung reduzieren, wenn die Abdeckung 170 des Gaszugangskanals verwendet wird.
Wenn die für die gaspermeable Folie 120 verfügbaren Materialarten nicht die gewünschte Sauerstoffspannung bereitstellen, kann die in 6 gezeigte Konfiguration verwendet werden. Eine variable Sauerstoffkontrollkammer 190 ist aus einer unteren gaspermeablen Folie 200 aufgebaut, die in einer horizontalen Position von einem Boden 210 der Sauerstoffkontrollkammer getragen wird. Eine Zugangsöffnung 220 zur Sauerstoffkontrollkammer erlaubt das Einführen eines Flüssigkeitswiderstands 230 in die variable Sauerstoffkontrollkammer 190. Die Sauerstoffspannung an der Unterseite der gaspermeablen Folie 120 kann durch Variieren der Höhe der auf einer unteren gaspermeablen Folie 200 liegenden Flüssigkeit in Übereinstimmung mit dem Fick'schen Gesetz sorgfältig kontrolliert werden. Die untere gaspermeable Folie 200 kann jede hoch gaspermeable Folie oder Lage sein. In der bevorzugten Ausführungsform ist sie flüssigkeitsimpermeabel. Der Boden 210 der Sauerstoffkontrollkammer ermöglicht es, dass der Großteil der unteren gaspermeablen Folie 200 in Kommunikation mit der Umgebungsatmosphäre ist. Eine hermetische Abdichtung ist zwischen der unteren gaspermeablen Folie 200 und dem Boden 210 der Sauerstoffkontrollkammer vorhanden. Diese Abdichtung kann durch Verschweißen, Klebstoffe oder jedes andere geeignete Verfahren hergestellt werden. Der Abstand zwischen der Oberseite der unteren gaspermeablen Folie 200 und der Unterseite der gaspermeablen Folie 120 beträgt vorzugsweise zwischen etwa 5 und 20 mm.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das in der Zugangsöffnung 70 zu der Zellkulturkammer liegende Volumen des Kulturmediums 50 ein geringer Anteil des zwischen der Membran 20 und der gaspermeablen Folie 120 liegenden Volumens des Kulturmediums 50. Es ist möglich, dass Wasser aus dem Basalmedium 60 sich in die Zellkulturkammer 40 bewegt, wenn sich über die Membran 20 ein ausreichender osmotischer Gradient entwickelt. Dies kann durch einen oberen Membranträger 240 ausgeglichen werden, wie in 7 gezeigt. Der obere Membranträger 240 begrenzt die Aufwärtsverlagerung der Membran 20.
In den Fällen, in denen die Membran 20 aus einem Material, wie z. B. Zellulose aufgebaut ist, das anschwillt oder voluminös wird, wenn es nass ist, kann es ebenfalls erwünscht sein, die Membran 20 durch einen oberen Membranträger 42 einzuschränken. Der obere Membranträger 240 stoppt die Aufwärtsverlagerung der Membran 20, wenn Kulturmedium 50 in die Zellkulturkammer 40 eintritt. Das Kulturmedium 50 drückt die Membran 20 gegen den oberen Membranträger 240 und glättet Falten.
Falten in der Membran 20 können zu einer ungleichmäßigen Zellverteilung während der Beimpfung führen. Wenn die Membran 20 stark gefaltet wäre, würde das Kulturmedium 50 in den Falten verbleiben. Dann hätten einige Bereiche über der gaspermeablen Folie 120 mehr darauf liegendes Kulturmedium 50 als die übrigen. Zellen in der Impflösung sind gleichmäßig über das Kulturmedium 50 verteilt. Diese Zellen setzen sich schließlich auf der gaspermeablen Folie 120 ab. Bereiche der gaspermeablen Folie 120, über welchen ein größeres Volumen des Kulturmediums 50 liegt, erhalten mehr Zellen. Daher sollten die Falten in der Membran 20 möglichst gering gehalten werden.
Der obere Membranträger 240 kann aus jedem biokompatiblen Material sein. In der bevorzugten Ausführungsform ist er biegsam, so dass der in Kammern unterteilte Zellkulturbeutel aufgerollt werden kann, wenn er nicht genutzt wird. Polypropylen ermöglicht dies. Es sollte sorgfältig sichergestellt werden, dass es die Dialyse nicht einschränkt. In der bevorzugten Ausführungsform sollte er etwa 70% bis 90% offen sein.
Das Einführen des Zellkulturmediums 50 in die Zellkulturkammer 40 erfordert einen ausreichenden Druck, um den hydrostatischen Druck des Basalmediums 60 zu überwinden. Dies kann erreicht werden, indem die Zugangsöffnung 70 zu der Zellkulturkammer so konfiguriert wird, dass sie eine hermetische Abdichtung mit einer Pipette, Spritze oder einem anderen Kulturmediumbehälter, wie z. B. einem Beutel oder einer Flasche, bildet. Das Kulturmedium 50 kann in derselben Weise entfernt werden.
Alle Ausführungsformen verhindern es, dass die Membran 20 den Kontakt mit dem Kulturmedium 50 durch Verdunstung des Kulturmediums 50 verliert. Die Membran 20 schwimmt im wesentlichen auf dem Kulturmedium 50 und mit der Verdunstung von Kulturmedium 50 durch die gaspermeable Folie 120 kommt die Membran 20 einfach näher an die gaspermeable Folie 120. Es tritt keine Einschränkung der Dialyse auf, da die Membran 20 stets in Kontakt mit dem Kulturmedium 50 ist. Wenn das Kulturmedium 50 durch Verdunstungsverlust reduziert wird, kann es periodisch aufgefüllt werden.
Obgleich es keine Einschränkung hinsichtlich der Form oder Größe der Zellkulturkammer 40 gibt, ist der vorteilhafte Abstand zwischen der gaspermeablen Folie 120 und der Membran 20 etwa 1 bis 5 mm, um eine hohe Konzentration von Zellen und Zellsekretionsprodukten zu erhalten. Wenn die gaspermeable Folie 120 im wesentlichen flach und horizontal ist, kann erwartet werden, dass bis zu 30 × 10⁶ Zellen pro Quadratzentimeter Oberfläche lebensfähig verbleiben. Diese Zellen können sich bis zu einer Höhe von etwa 300 Mikrometer aufschichten. Somit ist die Membran 20 nicht in Gefahr, mit den Zellen in Berührung zu kommen und blockiert zu werden, wenn sie mindestens 1 mm von der gaspermeablen Folie 120 entfernt ist.
Um die Austauschhäufigkeit des Basalmediums 60 zu minimieren, ist das Volumen der Basalmediumkammer 30 in Relation zu der Oberfläche der gaspermeablen Folie 120 dimensioniert. Für Suspensionszellen, die in statischer Kultur mit etwa einer Million Zellen pro Milliliter untergebracht sind, sind etwa 5 bis 10 Milliliter Basalmedium 60 für jeweils 1 cm² gaspermeable Folie 120 erforderlich. Wenn in einer Monoschicht wachsende verankerungsabhängige Zellen kultiviert werden, übersteigt vorteilhafterweise das Volumen des Basalmediums 60 (Milliliter) die Oberfläche (Quadratzentimeter) der gaspermeablen Folie 120 um einen Faktor von mindestens etwa zwei.
Zu den Faktoren, die die Übertragungsmenge der gelösten Stoffmasse in die und aus der Zellkulturkammer 40 beeinflussen, zählt die Oberfläche der Membran 20. Als allgemeine Richtlinie sollte die Oberfläche der Membran 20 annähernd gleich der Oberfläche der gaspermeablen Folie 120 sein. Bei Anwendungen, in welchen nur 1 bis 2 Millionen mäßig stoffwechselaktive Zellen pro cm² gaspermeable Folie 120 unterzubringen sind, kann die Oberfläche der Membran 20 auf etwa 1/4 bis 1/2 der Oberfläche der gaspermeablen Folie 120 reduziert werden.
Das Gehäuse der Basalmediumkammer 30 kann ein beliebiges flexibles, flüssigkeitsimpermeables, biokompatibles Material sein. Neben den Gesichtspunkten der Verpackung gleicht die flexible Natur des Basalmediums die Ausdehnung von Flüssigkeit und Gas aus, wenn die Temperatur des Fluids in der Basalmediumkammer 30 ansteigt. Es ist bevorzugt, dass das Gehäuse optisch durchsichtig ist, so dass eine Sichtüberwachung des Mediums möglich ist, um den pH des Mediums zu bestimmen oder mögliche mikrobielle Verunreinigung zu entdecken. Ferner ist es bevorzugt, dass das Material gaspermeabel ist, um eine CO₂-Übertragung zum Einstellen des pH des Basalmediums 60 zu ermöglichen. Die Empfehlungen schließen Polypropylen und Polyethylen ein. Der Aufbau der Zellkulturkammer 40 kann durch Ultraschallschweißen, mechanische Befestigungseinrichtungen, Lösemittelverbindung oder ein beliebiges anderes Verfahren erfolgen, das eine dichte einstückige Verbindung schafft. Die gaspermeable Folie 120 und die Membran 20 können durch O-Ringe, Dichtungen, Verschweißen, Klebstoffe oder beliebige andere Verfahren abgedichtet werden, die eine dichte einstückige Verbindung schaffen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind alle in dem in Kammern unterteilten Kulturbeutel 10 verwendeten Materialien mit Gamma-Sterilisierung kompatibel.

10: in Kammern unterteilter Zellkulturbeutel
20: Membran
30: Basalmediumkammer
40: Zellkulturkammer
50: Kulturmedium
60: Basalmedium
70: Zugangsöffnung zur Zellkulturkammer
80: Kappe der Zugangsöffnung zur Zellkulturkammer
90: Zugangsöffnung zum Basalmedium
100: Kappe der Zugangsöffnung zum Basalmedium
120: gaspermeable Folie
130: Gasfolienträger
140: Gaszugangsöffnung
150: Fuß
160: Gaszugangskanal
170: Abdeckung des Gaszugangskanals
180: Ablauföffnung
190: variable Sauerstoffkontrollkammer
200: untere gaspermeable Folie
210: Boden der Sauerstoffkontrollkammer
220: Zugangsöffnung zur Sauerstoffkontrollkammer
230: Flüssigwiderstand
240: oberer Membranträger
250: Tragstützen

Claims

Statische Zellkulturvorrichtung, enthaltend: a) einen mit einer Basalmedium-Zugangsöffnung (90) und einer Öffnung versehenen Behälter, welcher Behälter (30) eine Wand enthält, die flexibel ist; b) eine obere Membran (20), die so ausgelegt ist, dass sie für Moleküle einer vorbestimmten Größe permeabel ist und für Zellen impermeabel ist und die über der Öffnung positioniert ist, wobei der Behälter und die obere Membran (20) zusammen eine Basalmediumkammer (30) bilden; c) eine gaspermeable Folie (120), die unter der oberen Membran (20) angeordnet ist und mit der oberen Membran (20) eine Zellkulturkammer (40) bildet; d) eine Zugangseinrichtung (70) zwischen dem Inneren der Zellkulturkammer (40) und ihrer Außenseite, wodurch eine Zellkultur in die Zellkulturkammer (40) eingeführt und aus dieser entnommen werden kann; und e) einen Gasfolienträger (130) unter der gaspermeablen Folie (120), wobei ein Abschnitt der gaspermeablen Folie (120) in einem Abschnitt der Fläche unmittelbar unter der Zellkulturkammer (40) in einer Weise in Kontakt mit dem Gasfolienträger (130) steht, dass die gaspermeable Folie (120) in einer im wesentlichen horizontalen Position ausgerichtet ist, so dass Zellen sich über den horizontalen Abschnitt der gaspermeablen Folie (120) verteilen können, welcher Gasfolienträger (130) so ausgelegt ist, dass er mindestens eine Gaszugangsöffnung (140) hat, so dass Gas aus der umgebenden Atmosphäre in Kontakt mit der Unterseite der gaspermeablen Folie (120) kommen kann.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher die Oberfläche der oberen Membran (20) mindestens ein Viertel der Oberfläche der gaspermeablen Folie (120) beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher der durchschnittliche Abstand zwischen dem im wesentlichen horizontalen Abschnitt der gaspermeablen Folie und der oberen Lage weniger als 5 Millimeter beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher die kleinste Querschnittsfläche des Gasfolienträgers (130), die offen für den Gasaustausch mit der umgebenden Atmosphäre ist, kleiner ist als die gesamte Oberfläche der Unterseite der gaspermeablen Folie (120), die in Kontakt mit Gas steht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher die gaspermeable Folie Abschnitte enthält, die in die Zellkulturkammer (40) vorragen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher die Basalmediumkammer (30) eine Wand enthält, die gaspermeabel ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, enthaltend (e) eine Gasaustauschkammer (160), die den oberen Innenraum der Basalmediumkammer (30) mit dem Raum unter der gaspermeablen Folie (120) verbindet.
Vorrichtung nach Anspruch 7, bei welcher die gaspermeable Folie (120) Abschnitte enthält, die in die Zellkulturkammer (40) vorragen.
Vorrichtung nach Anspruch 7, bei welcher die Gasaustauschkammer verhindert, dass Basalmedium in sie eindringt.
Vorrichtung nach Anspruch 7, enthaltend eine Zugangsöffnung für die Gasaustauschkammer, durch welche Kondensation entfernt werden kann und anderes Gas als das der Basalmediumkammer (30) mit der Unterseite der gaspermeablen Folie (120) kommunizieren kann.
Vorrichtung nach Anspruch 7, bei welcher die Basalmediumkammer (30) eine Wand enthält, die gaspermeabel ist.
Statische Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1, enthaltend i) eine zweite gaspermeable Folie (200), die in einer horizontalen Position unter der ersten gaspermeablen Folie (120) angeordnet ist; ii) eine Einrichtung, die die erste gaspermeable Folie (120) von der zweiten gaspermeablen Folie (200) trennt, um eine variable Sauerstoffkontrollkammer (190) zu bilden, die zum Enthalten von Fluid ausgelegt ist; und iii) eine Zugangsöffnung zu der variablen Sauerstoffkontrollkammer (190), durch welche Flüssigkeit zugegeben oder entfernt werden kann, um die Gastransportrate zu kontrollieren.
Vorrichtung nach Anspruch 12, bei welcher die erste gaspermeable Folie (120) Abschnitte enthält, die in die Zellkulturkammer (40) vorragen.
Vorrichtung nach Anspruch 12, bei welcher die Basalmediumkammer (30) eine Wand enthält, die gaspermeabel ist.
Vorrichtung nach Anspruch 12, bei welcher die Basalmediumkammer (30) eine Wand enthält, die flexibel ist.
Verfahren zum Kultivieren von Zellen in einer Vorrichtung nach Anspruch 1, enthaltend a) Einführen eines Basalmediums (60) in die Basalmediumkammer, b) Einführen von Zellen und eines Zellkulturmediums (30) in die Zellkulturkammer (40), und c) Halten der Zellkulturkammer (40) auf einer vorbestimmten Temperatur, wodurch Zellen auf der oberen Oberfläche der gaspermeablen Folie (120) wachsen und innerhalb der Zellkulturkammer (40) erzeugtes Gas durch die gaspermeable Folie (120) tritt.
Verfahren nach Anspruch 16, enthaltend das feste Beabstanden der gaspermeablen Folie (120) von einem Träger für die Einrichtung, wodurch ein Gasraum unter der gaspermeablen Folie (120) geschaffen wird.
Verfahren zum Kultivieren von Zellen in einer Vorrichtung nach Anspruch 12, enthaltend a) Einführen eines Basalmediums (60) in die Basalmediumkammer (30), b) Einführen von Zellen und eines Zellkulturmediums (50) in die Zellkulturkammer (40), c) Einführen einer Flüssigkeit in die variable Sauerstoffkontrollkammer (190), und d) Halten der Zellkulturkammer (40) auf einer vorbestimmten Temperatur.
Verfahren nach Anspruch 18, bei welchem die variable Sauerstoffkontrollkammer (190) in Verbindung mit der Basalmediumkammer (30) steht, welches Verfahren den zusätzlichen Schritt des Einführens von Basalmedium in die Sauerstoff kontrollkammer (190) enthält.