JPH11502716A - コンパートメント付き組織培養バッグ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 下側の気体透過性フィルム（１２０）および選ばれたサイズの化合物に対して透過性である上側の膜（２０）により画定された、細胞培養コンパートメント（４０）を含む、コンパートメント付き細胞培養バッグ（１０）。培地（５０）は上側の膜（２０）と下側の気体透過性フィルム（１２０）との間にある。基本培地コンパートメント（３０）は、上側の膜（２０）の上方にあり、そして、基本培地（６０）が上側の膜（２０）の上にあることができる。各コンパートメントはアクセスポート（７０、９０）を含む。気体透過性フィルム（１２０）の下方にあり、そしてそれと部分的に接触している気体フィルム支持体（１３０）は気体透過性フィルム（１２０）を実質的に水平な位置に保持し、それにより、浮遊細胞および付着細胞が気体透過性フィルム（１２０）の表面にわたって分布していることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 コンパートメント付き組織培養バッグ 発明の分野 本発明は細胞または組織のインビトロでの成育のための装置および方法に関す る。 従来技術の背景説明 哺乳類の細胞のインビトロでの成育は、Lifecell（商標）バッグ(Baxter Trav enol)、SteriCell（商標）(DuPont)のような静置培養容器中で行われることがで きる。これらの培養装置は、使用するのが容易で、且つ、細胞の代謝要求値を扶 養するために受動拡散(paasive diffusion)によるので、人気がある。このタイ プの培養において、細胞は養分を消費しそして排産物を生じるので、細胞の培地 の一部分はバッグから周期的に取り出され、そして取り替えられなければならな い。このプロトコールは制限された細胞密度、制限された細胞分泌物濃度、およ び、養分濃度の周期的シフトといった欠点をもたらす。 これらの欠点を克服するためには、養分が補充されるときに、細胞および細胞 の分泌物は培養容器内に保持される必要がある。Marbrookは基本培地から細胞お よび細胞の分泌物を分離するために透析膜を使用し、受動拡散が細胞の代謝要求 値を満たす(Marbrook，J.，“Primary Immune Response in Cultures of Spleen Cells”，the Lancet，2，1279 〜1281[1967])。この装置において、内側同心 円チャンバーは外側同心円チャンバー中にある。内側同心円チャンバーの底は透 析膜を含み、そして、それは、外側同心円チャンバー中 に含まれる基本培地中に埋まっている。細胞は膜の上にあり、養分を受取り、そ して排産物を送りだす。連続透析は、細胞物質が膜上にあるために基質輸送能力 を失ったときに制限されることになる。この為、長期間の培養を行う能力は妥協 される。 Verma(1981年10月20日に付与された米国特許第4,296,205 号)は細胞が透析膜 に直接接触しそして閉塞することがないように、細胞培養コンパートメント内に 配置された組織培養棚の使用を教示している。組織培養棚は細胞への養分の移動 ができるようにパーホレーションを有している。浮遊細胞培養の際に、細胞およ び細胞断片はパーホレーションを通して移動し、そして透析膜上に来ることがで き、長期間の培養において連続培養を制限する。また、棚の建築的構造は、濃度 勾配がプレートの表面にわたって不均一に分布されるような微細環境を生じるこ とができる。 Vogler(1988 年5 月31日に付与された米国特許第4,748,124 号)は、下側の気 体透過性で液体不透性のシートおよび上側の透析膜により画定された細胞培養コ ンパートメントを記載している。この形態は、細胞が透析膜上にあることがない ので、透析膜が閉塞しないが、透析は他の手段により制限される。従来の細胞培 養バッグでは、Voglerの形態はMarbrookおよびVerma のものと比較して、酸素圧 を変化させる能力が制限される。更に、気体の透過を可能にするために使用され る材料の表面化学的性質は制限され、そして、ある場合には、タンパク質または 細胞の接触には望ましくないことがある。結局、この教示は従来の静置培養法と 比較して高密度の細胞培養ができない。 Voglerの構造は、細胞コンパートメントの透析が制限されることになることが できる。成育チャンバーから液体が蒸発するときに問題が起こることができる。 気体透過性の表面を横切る蒸気の透過は かなりのものであることができ、そして、液体の損失によって、透析膜と接触し ている液体がなくなると透析が止まってしまうであろう。 Voglerのバッグと同様の従来のバッグ形態においては、細胞培養コンパートメ ントの気体透過性で液体不透性のシートは細胞近傍pHおよびＰ_O2を制御するため の選択肢が制限される。MarbrookおよびVerma の従来の形態においては、細胞培 養コンパートメントの液体レベルを調節することにより酸素圧が変化できた。Vo glerにより教示された構造および方法は装置を取り巻く雰囲気の周囲条件を変え ることにより酸素圧を変える必要がある。 酸素圧は、細胞の生存およびタンパク質分泌にとって非常に重要である(Rueve nyらの“Factors Affecting Cell Growth and Monoclonal Antibody Production in Stirred Reactors”，Journal of Immunological Methods，86，53 〜59[1 986])。市販の液体不透性シートの気体透過性並びに細胞近傍（pericellular）p HおよびＰ_O2に与える影響はJensonらにより詳細に記載されている(Jenson M.D. ，Wallach D.F.H.およびSherwood P.，“Diffusion in Tissue Cultures on Gas -permeable and Impermeable Supports”，J．Theor，Biol.（1976）56，443〜4 58)。様々な気体透過性で液不透性のシートの気体透過率との組み合わせでの様 々なタイプの細胞の酸素要求値は、各々の組み合わせのために特異的な安定状態 での細胞近傍pHおよびＰ_O2を要求するであろう。このことは細胞ラインが非常に 制限された細胞近傍条件を受けることを意味する。異なる細胞近傍条件を作るこ とは、装置をインキュベータ中に入れ、インキュベータの周囲条件を変えること により達成される。実際上は、幅広い同時使用のために標準条件でインキュベー タを維持している研究者にとって困難である。 気体透過性で液体不透性のシートは、また、細胞およびタンパク質の構造を支 持するために表面化学的性質を制限する。多くの細胞のタイプの増殖および機能 はそれらが接している表面の化学的性質によって強く影響を受ける。液体不透性 で気体透過性のシートの表面の化学的性質は、多くの細胞のタイプおよびタンパ ク質構造に適さないものである。また、しばしば気体透過性で液体不透性のフィ ルムの基礎となる疎水性材料は、また、非特異的なタンパク質の結合をもたらす ことができる。これは、また、可溶性の成長因子の枯渇をもたらすことができる 。この為、細胞環境の最適化のために材料の更なる変性が要求されうる。 Volgerの構造は、また、制限された細胞密度をもたらすことができる。成育チ ャンバーはその上にある液体の重量および流体膨張の圧力により形状が変形し、 たるんだ気体透過性シートとするであろう。これにより、浮遊細胞はシートの最 下点に沈降することができる。シートの最下点に高度に局在化した細胞密度は、 養分の流れを過度に抑制し、そして細胞の生存性を局所的に減少させる。更に、 細胞は気体透過性シートの他の領域に広がることができない。 従って、本発明の目的は、高密度での足場依存性細胞および浮遊細胞の長期間 培養のためのコンパートメント付き細胞培養バッグ構成体中で、同時に、可変的 な酸素圧、培養コンパートメントの底にわたっての細胞の均一分布、阻害されな い透析、および、幅広い表面化学的性質の選択肢を可能とする方法および装置を 提供することである。 発明の要旨 従来技術の多くの問題点は、細胞が高密度で長期間にわたって培養されうる、 本発明によるコンパートメント付き細胞培養バッグに よって解決される。 基本培地アクセスポートおよび開口部を具備した容器、 選ばれたサイズの化合物に対して選択的に透過性であり且つ前記開口部にわた って横切って配置された上側の膜、ここで、前記容器および前記上側の膜は一緒 に基本培地コンパートメントを画定している、 前記上側の膜の下に配置された気体透過性フィルム、ここで、それは前記上側 の膜とともに細胞培養コンパートメントを画定している、 前記細胞培養コンパートメントの内側およびその外側の間のアクセス手段、こ こで、培養細胞（cell culture）は前記細胞培養コンパートメント中に導入され 、そしてそこから取り出されることができる、および、 前記気体透過性フィルムの下でそしてそれと部分的に接触している気体フィル ム支持体、ここで、前記気体透過性フィルムの少なくとも一部分は実質的に水平 の位置に保持され、それにより、細胞は前記気体透過性フィルムの水平部分にわ たって分布することができ、そして気体が前記気体透過性フィルムの下側と接触 することができる、 を含む細胞培養装置が提供される。 高密度の細胞培養のためには、前記上側の膜の表面積は前記気体透過性フィル ムの表面積の少なくとも1/4 であり、そして、前記気体透過性フィルムの実質的 に水平の部分と前記上側の膜の間の平均距離は約５ミリメートル未満である。周 囲環境と気体連絡し開放されている前記気体フィルム支持体の最も小さい断面積 は、気体と接触している前記気体透過性フィルムの下側の合計表面積よりも小さ い。 本発明の更なる特徴によれば、前記気体透過性フィルムは前記細胞培養コンパ ートメント中に突き出しているセクションを含む。 本発明の更なる特徴によれば、前記基本培地コンパートメントは可撓性である 壁を含む。 本発明の更なる特徴によれば、前記気体透過性フィルムの下方の空間と前記基 本培地コンパートメントの内部の上方の空間を連結する気体交換コンパートメン トは前記細胞培養コンパートメントからの蒸発損失を制限する。気体交換コンパ ートメントは、基本培地がそこに入るのを防止するような構造となっていること ができ、そして、前記気体交換コンパートメントのためのアクセスポートを含む ことができ、ここで、凝縮物が除去されることができ、そして前記基本培地コン パートメントの気体以外の気体が前記気体透過性フィルムの下側と連絡すること ができる。 本発明の更なる特徴によると、前記細胞培養コンパートメント内の酸素圧（ox ygen tension）は、第一の前記気体透過性フィルムの下方に水平位置に配置され た第二の気体透過性フィルムを含み、第一の前記透過性フィルムを第二の気体透 過性フィルムから分離して、流体を閉じ込めるように調節された可変酸素制御コ ンパートメントを形成するための手段、および、前記酸素制御コンパートメント へのアクセスポートを提供することにより変えることができ、ここで、気体輸送 速度を制御するために液体が加えられまたは除去されてもよい。 これらの構造で、高密度で細胞を培養するための方法が提供されうる。また、 細胞の周囲の酸素圧を制御するための方法は酸素流束に対する液体バリアを使用 することにより提供されうる。 このように、記載された特徴の装置内において、細胞を培養するための方法が 提供され、この方法は、 ａ）前記基本培地コンパートメント中に基本培地を導入すること、 ｂ）前記細胞培養コンパートメント中に細胞および細胞培地を導入すること、 および、 ｃ）前記細胞培養コンパートメントを予め決められた温度に保持すること、こ こで、細胞は、前記気体透過性フィルムの上側表面上で増殖し、そして前記細胞 培養コンパートメント内に発生した気体は前記気体透過性フィルムを通過する、 を含む。 このように記載した本発明では、従来技術に関連する問題は解決される。長期 間の高密度の浮遊細胞および付着細胞の両方のインビトロでの培養は可能であり 、可変の酸素圧、制御された蒸発、小さい細胞コンパートメント液体体積の長期 間の保全、および、阻害されない透析を同時に備えるものである。 図面の簡単な説明 図１は本発明によるコンパートメント付き細胞培養バッグの垂直断面図であり 、 図２は細胞培養コンパートメント中への突起部を有する気体透過性膜を使用し た態様を示す、コンパートメント付き細胞培養バッグの断面図であり、 図３は図１または２の気体フィルム支持体の斜視図であり、 図４は図３の気体フィルム支持体の垂直断面図であり、 図５は細胞培地の蒸発を制御する態様の垂直断面図であり、 図６は可変酸素圧を可能にする態様の垂直断面図であり、そして、 図７は細胞培養コンパートメントの体積を制限する態様の垂直断 面図である。 図中の参照番号は、以下の通りである。 １０ コンパートメント付き細胞培養バッグ ２０ 膜 ３０ 基本培地コンパートメント ４０ 細胞培養コンパートメント ５０ 培地 ６０ 基本培地 ７０ 細胞培養コンパートメントアクセスポート ８０ 細胞培養コンパートメントアクセスポートキャップ ９０ 基本培地アクセスポート 100 基本培地アクセスポートキャップ 120 気体透過性フィルム 130 気体フィルム支持体 140 気体アクセス開口部 150 脚 160 気体アクセスチャンネル 170 気体アクセスチャンネルカバー 180 ドレンポート 190 可変酸素制御コンパートメント 200 下側気体透過性フィルム 210 酸素制御コンパートメントの底 220 酸素制御コンパートメントのアクセスポート 230 液体レジスター 240 上側膜支持体 250 支持体ポスト 詳細な説明 次に、図１を詳細に参照して、図１はコンパートメント付き細胞培養バッグ１ ０の断面図を示す。膜２０はコンパートメント付き細胞培養バッグ１０を、基本 培地コンパートメント３０と細胞培養コンパートメント４０とに分離する。細胞 または組織を含む培地５０は細胞培養コンパートメント４０中にある。基本培地 ６０は基本培地コンパートメント３０中にある。細胞培養コンパートメント４０ へのアクセスは、細胞培養コンパートメントアクセスポート７０により提供され る。基本培地コンパートメント３０へのアクセスは、基本培地アクセスポート９ ０により提供される。気体透過性フィルム１２０は気体フィルム支持体１３０の 上にあり、それは、気体アクセス開口部１４０により気体透過性フィルム１２０ の表面の大半と、気体、例えば、周囲雰囲気が接触できるように調節されている 。脚１５０は、コンパートメント付き細胞培養バッグ１０が載っている表面より 上に気体フィルム支持体１３０の上部を配置する。 運転において、基本培地６０は基本培地コンパートメントアクセスポート９０ より基本培地コンパートメント３０に送られる。基本培地アクセスポートキャッ プ１００は基本培地アクセスポート９０の上に配置されている。膜２０は基本培 地の重量により気体透過性フィルム１２０の表面上に圧迫される。基本培地６０ の導入の前にこの位置に膜を配置することは、また、細胞培養コンパートメント アクセスポート７０により細胞培養コンパートメント４０に真空を生じさせるこ とによっても行える。所望の培養体を含む、予め決められた体積の培地５０は、 細胞培養コンパートメント４０中に細胞培養コンパートメントアクセスポート７ ０により導入される。細胞培養コンパートメントアクセスポートキャップ８０は 細胞培養コンパートメントアクセスポート７０の上に配置されている。 膜２０は、養分を基本培地６０から細胞培地５０に自由に通過させ、そして、 排産物を細胞培地５０から基本培地６０に自由に通過させることができる。膜２ ０は、細胞培養コンパートメント４０中に細胞および選ばれた化合物を保持する 。 膜２０は、ある種の分子を選択的に透過させることができる材料である。幾つ かのタイプの材料は許容され、セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリスルホ ン、ポリカーボネートおよびポリアクリルアミドを含む。例えば、１５，０００ を越える分子量を有する分子および化合物を保持する透析膜は、ネズミのハイブ リドーマ細胞を培養するために一般に使用される。この特性を有する膜を使用す ることにより、細胞、成長因子および分泌された抗体は細胞培養コンパートメン ト４０中に保持される。他の用途において、より大きな分子および化合物を基本 培地６０および培地５０の間に自由に通過させることができることは有利である ことができる。例えば、リンパ球の高密度培養は多量の成長刺激因子が存在する ことを要求する。これらの因子、例えば、インターロイキン２は基本培地６０お よび培地５０中に導入されうる。膜２０の孔径を適切に選択することにより、こ れらの因子の多くの源がリンパ球に供給されうる。 膜２０は殆どの用途で１５０，０００ダルトンの分子量カットを越えないであ ろう。それでも、更により大きな孔径が望まれるであろう用途がある。例えば、 もし、多数の細胞を培養することのみが目的であるならば、細胞培養コンパート メント中４０中に細胞を保持するいずれの孔径でも使用できる。この場合、Pore tics Corporation（Livermore，California）から市販されているような０．２ μＭまたは０．４５μＭの微細孔ポリカーボネート膜は使用できる。気体透過性 フィルム１２０は気体を細胞培養コンパートメント４０中にまたはそこから外に 輸送することができる生体適合性の材料 である。気体透過性フィルム１２０は、液体透過性または不透性のいずれかの疎 水性または親水性の多孔性または無孔性のものであってよい。厚さは０．２５ｍ ｍを越えるかまたはそれを下回る範囲であることができる。最も良好な選択は特 定の用途による。一般的なガイドラインとして、与えられる膜の気体透過性は、 細胞またはタンパク質構造のいずれかと膜との相互作用に加えて、考慮されるべ きである。同一の厚さの液体不透性のフィルムは、細胞／気体透過性フィルム界 面で様々な安定した状態の酸素圧を形成するであろう。ＦＥＰテフロン、シリコ ーンおよびシリコーンポリカーボネートコポリマーは、同一の厚さのポリエチレ ン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスルホンまたはポリプロピレンフ ィルムよりも高い酸素圧を形成するであろう。タンパク質の変性、非特異的タン パク質結合、細胞膜破壊または細胞結合がフィルムの表面の化学的性質に影響を 受ける用途では、親水性表面がより好ましい。細胞膜全体を水と接触させておく ことが望ましい用途では、水和したゲルが最も適切であろう。 気体交換を通常に伴わない特定の材料の使用は、細胞／気体透過性フィルム界 面での酸素圧を制御するための選択肢を広げることができる。例えば、無孔性の セルロースアセテートは、約７．３ｘ１０^-9ｃｍ³・ｃｍ／（秒・ｃｍ²・ａｔｍ ）の比較的に低い酸素気体透過率を有する。セルロースアセテートが多孔性で作 られるときには、それは培地５０を吸収するので酸素透過率が増加し、１．４ｘ １０^-6ｃｍ³・ｃｍ／（秒・ｃｍ²・ａｔｍ）の酸素透過率となる。このように、 細胞培養コンパートメント４０の細胞／気体透過性フィルム界面での酸素圧を変 更することは、気体透過性フィルム１２０内に存在する培地５０の量を制御する ことにより達成できる。このように、酸素圧の変更は気体透過性フィルム１２０ の孔 径、多孔度またはくねり性（tortyosity）を変えることにより起こるであろう。 図２の態様は、気体輸送のための追加の領域を提供するために気体透過性フィ ルム１２０の一部分が細胞培養コンパートメント中に突き出している形態を示す 。シリコーンは、適切な形状に成形することが容易であるので、材料として良好 な選択であろう。壁の厚さは最小にすることができ、それにより、細胞培養コン パートメント４０中への追加の気体輸送が可能になる。シリコーンの場合には、 平均の壁の厚さは約０．０１５インチ未満にすべきであり、好ましくは約０．０ ０４〜０．０１２インチの間である。 気体フィルム支持体１３０は気体透過性フィルム１２０を実質的に水平の位置 に保持し、そしてたるみを防止するように気体透過性フィルム１２０を安定化さ せる。細胞が低い位置に転がっていき、または集まってくることのないように、 気体透過性フィルムの平坦性を確保するように注意が払われるべきである。この ことは、細胞の集積は拡散の制約をもたらし、そして細胞を死に導くであろうか ら望ましくないことがある。他方、気体フィルム支持体１３０の気体透過性フィ ルム１２０との接触量は、気体透過性フィルム１２０の剛性および気体透過性、 並びに、特定の細胞培養用途の代謝要求量および気体交換によるであろう。殆ど の細胞ラインは約１０〜１５個の細胞の層で拡散的に制限されるであろうことが 期待されるはずである。 気体フィルム支持体１３０は、また、気体透過性フィルム１２０が汚染または パンクすることから保護されるようにも作用する。気体透過性フィルム１２０と の接触が最小であると、気体輸送のための表面積が最大の可能な面積となること ができる。気体アクセス開口部１４０は、蒸発を最小限としながら、細胞培養コ ンパートメン ト４０の十分な気体交換を可能とするようなサイズとされる。好ましい態様にお いて、気体フィルム支持体１３０は、コンパートメント付きバッグ１０が最小の 体積の容器中に梱包されうるように、ロール巻されうる可撓性のメッシュである 。コンパートメント付きバッグ１０が運転のために取り出されるときに、気体フ ィルム支持体１３０は構造的に安定な表面を提供し、それにより、基本培地６０ および細胞培地５０の重量下で気体透過性フィルム１２０がたるむことを防止す る。 図３および図４は、このことがどのように達成されうるかの例を示す。図３は 、気体フィルム支持体の小さいセクションの斜視図である。図４は図３の断面図 である。脚１５０は気体フィルム支持体１３０を立て、気体アクセス開口部１４ ０への通過を可能にする。スパイク２５０は、基本培地６０の重量を脚１５０に 移しながら、実質的に水平の位置に気体透過性フィルム１２０を保持する。ポリ プロピレンのような可撓性材料から気体フィルム支持体を製造することにより、 運転しないときに気体フィルム支持体１３０はロールされることができる。 気体透過性フィルム１２０の材料選択に関する別の考慮点は湿分蒸気透過速度 である。培地５０は、気体透過性フィルム１２０の材料によって様々な速度で蒸 発させるであろう。気体アクセス開口部１４０の断面積を制限することにより、 蒸発の速度が低下することができるが、液体の損失速度は周囲湿度にも関係し、 それは制御することがより困難である。図５の態様はこの問題に挑むものである 。 基本培地６０と基本培地コンパートメント３０の上部との間にある気体は基本 培地６０により湿潤化される。この気体は、気体アクセスチャンネル１６０によ り気体透過性フィルム１２０の下側と連 絡されている。気体アクセスチャンネルカバー１７０はあってもなくてもよい。 それは基本培地が気体アクセスチャンネル１６０に入り、そして気体輸送を制限 することを防止するであろう。気体アクセスチャンネルカバー１７０は多孔性の 気体透過性で液体不透性の通気膜である。気体アクセスチャンネルカバー１７０ 上に凝縮物が蓄積し、そして気体輸送を減じることを防止するために、それは水 平位置にはない。このようにして、凝縮物は重力により基本培地６０へと戻るこ とができる。気体アクセスチャンネル１６０は凝集物をドレンポート１８０中に 回収することができる。 この態様において、基本培アクセスポートキャップ１００は通気されて、Ｏ₂ およびＣＯ₂が基本培地コンパートメント３０へ移動し、そしてそこから移動す ることができる。もし、基本培地コンパートメント３０の壁が非常に気体透過性 であるならば、通気は必要ないであろう。 基本培地上部空間１７０を気体透過性フィルム１２０と連絡させる多くの他の 方法がありうる。気体アクセスチャンネルカバー１７０が使用されるときには凝 縮物または基本培地６０が気体輸送を減じることを防止するように注意が払われ るべきである。 気体透過性フィルム１２０のために使用される材料のタイプが所望の酸素圧を 提供しないならば、図６に示す形態を使用することができる。可変酸素制御コン パートメント１９０は酸素制御コンパートメントの底２１０で水平位置に支持さ れている下側気体透過性フィルム２００を含む。酸素制御コンパートメントアク セスポート２５０は液体レジスター２３０を可変酸素制御コンパートメント１９ ０中に導入することを可能にする。気体透過性フィルム１２０の底での酸素圧は 、Ｆｉｃｋの法則により、下側気体透過性フィルム２００上にある液体の高さを 変化させることにより注意深く制御され うる。下側透過性フィルム２００は、非常に気体透過性のフィルムまたはシート であることができる。好ましい態様において、それは液体不透性である。酸素制 御コンパートメントの底２１０は、下側気体透過性フィルム２００の大半が周囲 環境と連絡できるようになっている。下側気体透過性フィルム２００と酸素制御 コンパートメントの底２１０との間は気密シールが存在する。このシールは溶接 、接着剤または他のいずれかの適切な方法により作られることができる。下側気 体透過性フィルム２００の上部と気体透過性フィル１２０の下部との間の距離は 好ましくは約５〜２０ｍｍであろう。 好ましい態様において、細胞培養コンパートメントアクセスポート７０中にあ る培地５０の体積は、膜２０と気体透過性フィルム１２０との間にある培地５０ の体積よりも少量であろう。もし膜２０を横切って十分な浸透勾配ができれば、 培地５０からの水が細胞培養コンパーメント４０へと移動することが可能である 。これは、図７に示すような上側膜支持体２４０により補償されうる。上側膜支 持体２４０は膜２０の上側への移動を制限する。 膜２０が、濡れたときに膨潤しまたは膨らむセルロースのような材料である場 合に、それは上側膜支持体２４０で膜２０を拘束することも望ましいであろう。 上側膜支持体２４０は、培地５０が細胞培養コンパートメント４０に入るときに 、膜２０が上へ移動するのを止めるものである。培地５０は上側膜支持体２４０ に対して膜２０を押圧し、しわを滑らかにする。 膜２０中のしわは接種の際の細胞の不均一分布をもたらしうるものである。膜 ２０がひどくしわになっているならば、培地５０はしわの中に入るであろう。そ の後、気体透過性フィルム１２０の上の特定の領域は他よりも多量の培地５０を 有するであろう。接種体は培地５０の全体にわたって均等に分布される。最終的 に、これらの 細胞は気体透過性フィルム１２０上に沈降する。より多量の培地５０がある気体 透過性フィルム１２０の領域はより多量の細胞を受けることになるであろう。そ れ故、膜２０のしわは最小にされるべきである。 上側膜支持体２４０は、いずれの生体適合性材料であってもよい。好ましい態 様において、それはコンパートメント付き細胞培養バッグが運転されていないと きにロールされうるように可撓性であろう。ポリプロピレンはこのことを可能に するものである。それが透析を制限しないことを確保するように注意されるべき である。好ましい態様において、それは約７０％〜９０％開放されているべきで ある。 培地５０の細胞培養コンパートメント４０への導入は、基本培地６０の流体静 圧を打ち消すために十分な圧力を要求するであろう。これは、細胞培養アクセス ポート７０をピペット、シリンジ、または、バック若しくはボトルのような特定 の他の培地容器と気密シールを形成するような形態にすることにより達成できる 。 全ての態様は、培地５０の蒸発が膜２０を培地５０との接触を失わせることを 防止する。膜２０は培地５０の上に本質的に浮いており、そして、培地５０が気 体透過性フィルム１２０を通して蒸発するときに、膜２０は気体透過性フィルム １２０に単純に近づく。膜２０は常に培地５０と接触しているので透析の制限は 起こらない。培地５０が蒸発損失により減少するならば、それは周期的に補充さ れることができる。 細胞培養コンパートメント４０の形状またはサイズに対する制約はないが、気 体透過性フィルム１２０と膜２０との有利な距離は、高濃度の細胞および細胞分 泌物を得るために約１〜約５ミリメートルである。気体透過性フィルム１２０は 実質的に平坦であり、そし て水平であるときに、約３０ｘ１０⁶細胞／ｃｍ²までの表面積は生存可能である と期待できる。これらの細胞は約３００マイクロメートルの高さまで積み上げら れる。この為、膜２０は、膜２０が気体透過性フィルム１２０から少なくとも約 １ｍｍ離れているときには、細胞を接触させ、そして閉塞させる危険性がない。 基本培地６０の交換の頻度を最少にするために、基本培地３０の体積は、気体 透過性フィルム１２０の表面積に対してサイズ決定される。約１，０００，００ ０個の細胞／ミリリットルの静置培養の浮遊細胞のためには、１ｃｍ²の気体透 過性フィルム１２０当たりに約５〜１０ｍｌの基本培地６０が必要である。単層 で成育させる足場依存性細胞を培養するときには、有利には、基本培地６０の体 積（ミリリットル）が気体透過性フィルム１２０の表面積（平方センチメートル ）の少なくとも約２倍を越える。 細胞培養コンパートメント４０の中およびそこから外への溶質の物質移動に影 響を及ぼす要因は膜２０の表面積を含む。一般的なガイドラインとして、膜２０ の表面積は気体透過性フィルム１２０の表面積と略等しいべきである。１〜２百 万個の中程度の代謝活性の細胞が気体透過性フィルム１２０の１ｃｍ²当たりに 支持されようとするような用途では、膜２０の表面積を気体透過性フィルム１２ ０の表面積の約１／４〜１／２に減じることができる。 基本培地コンパートメント３０のハウジングは、どんな可撓性の液体不透性の 生体適合性の材料であってもよい。梱包に関する考慮に加えて、基本培地ハウジ ングの可撓性は、基本培地コンパートメント３０中の液体または気体の温度が上 昇するときに、この流体の膨張を補償する。培地のｐＨを決定し、または、可能 な微生物汚染を検知するために培地が視覚的にモニターされうるように、ハウジ ングは光学的に透明であることが好ましい。その材料は、基本培地 ６０のｐＨを調節するためにＣＯ₂が移動できるように気体透過性であることも 好ましい。推奨できるものはポリプロピレンおよびポリエチレンを含む。細胞培 養コンパートメント４０の製造は超音波溶接、機械ファスナー、溶剤接着、また は漏れ防止一体性を提供する他のいずれかの方法により行われることができる。 気体透過性フィルム１２０および膜２０はＯ−リング、ガスケット、溶接、接着 剤、または漏れ防止一体性を提供する他のいずれかの方法によりシールされうる 。好ましい態様において、コンパートメント付き細胞培養バッグ１０中に使用さ れる全ての材料はガンマ−滅菌できるものである。 当業者は、本発明の精神を逸脱することなく多くの変更がなされると評価する であろう。それ故、本発明の範囲を例示しそして記載した態様に制限することは 意図されない。むしろ、本発明の範囲は添付の請求の範囲およびその等価物によ り決められるべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）基本培地アクセスポート（９０）および開口部を有する容器、 ｂ）選ばれたサイズの化合物に対して選択的に透過性であり且つ前記開口部に わたって横切って配置されている上側の膜（２０）、ここで、前記容器および前 記上側の膜（２０）は一緒に基本培地コンパートメント（３０）を画定している 、 ｃ）前記上側の膜（２０）の下方に配置された気体透過性フィルム（１２０） 、ここで、前記上側の膜（２０）とともに、細胞培養コンパートメント（４０） を画定している、 ｄ）前記細胞培養コンパートメント（４０）の内側とその外側の間のアクセス 手段、ここで、培養細胞が細胞培養コンパートメント（４０）中に導入され、そ してそこから取り出されることができる、および、 ｅ）前記気体透過性フィルム（１２０）の下方にあり、且つ、それと部分的に 接触している気体フィルム支持体（１３０）、ここで、前記気体透過性フィルム （１２０）の少なくとも一部分は実質的に平行の位置に保持されており、それに より、前記気体透過性フィルム（１２０）の水平部分にわたって細胞が分布し、 そして気体が前記気体透過性フィルム（１２０）の下側に接触することができる 、 を含む、自給式の細胞培養装置。 ２．前記上側の膜（２０）の表面積が前記気体透過性フィルム（１２０）の表 面積の少なくとも１／４である、請求項１記載の装置。 ３．前記気体透過性フィルムの実質的に水平な部分と前記上側の シートとの間の平均距離が約５ミリメートル未満である、請求項１記載の装置。 ４．周囲環境に気体連絡して開いている前記気体フィルム支持体（１３０）の 最小の断面積が気体と接触している前記気体透過性フィルム（１２０）の下側の 合計の表面積より小さい、請求項１記載の装置。 ５．前記気体透過性フィルムが前記細胞培養コンパートメント（４０）中に突 き出しているセクションを含む、請求項１記載の装置。 ６．前記基本培地コンパートメント（３０）が気体透過性である壁を含む、請 求項１記載の装置。 ７．前記基本培地コンパートメント（３０）が可撓性である壁を含む、請求項 １記載の装置。 ８．（ｅ）前記気体透過性フィルム（１２０）の下方の空間と前記基本培地コ ンパートメント（３０）の内部の上方の空間とを連絡する気体交換コンパートメ ントを含む、請求項１記載の装置。 ９．前記気体透過性フィルム（１２０）が前記細胞培養コンパートメント（４ ０）の中に突き出しているセクションを含む、請求項８記載の装置。 １０．前記気体交換コンパートメントが基本培地がそこに入ることを防止して いる、請求項８記載の装置。 １１．前記気体交換コンパートメントのためのアクセスポートを含み、ここで 、凝縮物が除去されることができ、そして前記基本培地コンパートメント（３０ ）の気体以外の気体が前記気体透過性フィルム（１２０）の下側と連絡すること ができる、請求項８記載の装置。 １２．前記基本培地コンパートメント（３０）が気体透過性であ る壁を含む、請求項８記載の装置。 １３．前記基本培地コンパートメント（３０）が可撓性である壁を含む、請求 項８記載の装置。 １４．ｉ）第一の前記気体透過性フィルム（１２０）の下方に水平位置に配置 された第二の気体透過性フィルム（２００）、 ｉｉ）前記第二の気体透過性フィルム（２００）から第一の前記気体透過性フ ィルム（１２０）を分離し、流体を閉じ込めるように調節された可変酸素制御コ ンパートメント（１９０）を形成するための手段、および、 ｉｉｉ）気体輸送速度を制御するために液体が加えられ、または除去されるこ とができる、前記可変酸素制御コンパートメントへのアクセスポート、 を含む、請求項１記載の自給式の細胞培養装置。 １５．第一の前記気体透過性フィルム（１２０）が前記細胞培養コンパートメ ント（４０）中に突き出しているセクションを含む、請求項１４記載の装置。 １６．前記基本培地コンパートメント（３０）が気体透過性である壁を含む、 請求項１４記載の装置。 １７．前記基本培地コンパートメント（３０）が可撓性である壁を含む、請求 項１４記載の装置。 １８．請求項１記載の装置中において細胞を培養するための方法であって、 ａ）基本培地コンパートメント中に基本培地（６０）を導入すること、 ｂ）前記細胞培養コンパートメント（４０）中に細胞および細胞培地（３０） を導入すること、および、 ｃ）前記細胞培養コンパートメント（４０）を予め決められた温 度に維持すること、ここで、細胞は前記気体透過性フィルム（１２０）の上側の 表面上で繁殖し、そして前記細胞培養コンパートメント（４０）中で発生した気 体が前記気体透過性フィルム（１２０）を通って通過する、 を含む方法。 １９．前記装置ための支持体から前記気体透過性フィルム（１２０）を確実に 離して空間を開け、それにより、前記気体透過性フィルム（１２０）の下方に気 体の空間を提供することを含む、請求項１８記載の方法。 ２０．請求項１４記載の装置中で細胞を培養するための方法であって、 ａ）基本培地（６０）を前記基本培地コンパートメント（３０）中に導入する こと、 ｂ）前記細胞培養コンパートメント（４０）中に細胞および細胞培地（５０） を導入すること、 ｃ）前記可変酸素制御コンパートメント（１９０）中に液体を導入すること、 および、 ｄ）前記細胞培養コンパートメント（４０）を予め決められた温度に維持する こと、 を含む方法。 ２１．前記可変酸素制御コンパートメント（１９０）が前記基本培地コンパー トメント（３０）と連絡されている、請求項２０記載の方法であって、 基本培地を前記酸素制御コンパートメント（１９０）中に導入することの更な る工程を含む、方法。