JP6832586B2 - 培養容器 - Google Patents
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Description
これは一端終末分化した細胞でも適切な環境下で培養することにより、人工的に未分化な細胞へと脱分化させることが可能であることを意味している。この成熟脂肪細胞に由来する多能性細胞を、脱分化脂肪細胞(dedifferentiated fat cell、以下「DFAT」ともいう)という。
またDFATは少量の脂肪組織から年齢を問わず調製が可能であることから、重症心不全や高齢者など、いままで自己幹細胞移植が困難と考えられてきた患者に対する新規再生医療用ドナー細胞として期待されている。臨床応用に関しては、骨、軟骨、血管、心筋、平滑筋といった中胚葉由来組織の再生医療に幅広く適応できると考えられている。
[1]培養容器本体と、培養容器本体の底面近傍に底面に対向して配置され底面との間に培養領域を形成する仕切板と、培養容器本体の一部に設けられた試料出入口と、を備え、仕切板の一端側に形成された開口部を介して培養領域と試料出入口が連通する、培養容器。
[2]仕切板は、開口部側の縁に沿って底面側に突出したふち板を備える、[1]に記載の培養容器。
[3]試料出入口は、培養容器の開口部側の側面もしくは天井面に設けられている、[1]又は[2]に記載の培養容器。
[4]仕切板と底面の離間距離が、3.5mm〜5mmである、[1]〜[3]のいずれかに記載の培養容器。
[5]仕切板は、底面側主面に接着層を備える、[1]〜[4]のいずれかに記載の培養容器。
[6]接着層が、ラミニン、フィブロネクチン、I型コラーゲン、ゼラチンからなる群から選ばれる、[5]に記載の培養容器。
[7]仕切板は、開口部の他端側の一部に、空気孔を有する、[1]〜[6]のいずれかに記載の培養容器。
[8]仕切板は、空気孔の縁に沿って底面側に突出したふち板を備える、[7]に記載の培養容器。
[9]開口部と空気孔は、仕切板の略対角線上に互いに対向するように設けられている、[3]〜[8]のいずれかに記載の培養容器。
[10]培養容器が、脂肪細胞の脱分化を行なう際の天井培養用容器である、[1]〜[9]のいずれかに記載の培養容器。
[11]培養容器の底面近傍に底面に対向して配置され底面との間に培養領域を形成する仕切板、培養領域の開口部を介して培養領域と連通する試料出入口を備える培養容器の培養領域に、成熟脂肪細胞と培養液を充填する工程と、浮遊した成熟脂肪細胞を仕切板に接着させる工程と、培養容器をわずかに傾斜させ、培養領域内の培養液の一部と脱分化しなかった成熟脂肪細胞を、開口部を介して試料出入口から培養容器の外に取り出す工程と、を備える、脂肪細胞の脱分化方法。
[12]接着工程において、接着層を介して、成熟脂肪細胞を仕切板に接着させる、[11]に記載の脂肪細胞の脱分化方法。
[13]傾斜角度は、90度以下である、[11]又は[12]に記載の脂肪細胞の脱分化方法。
[14]培養容器が、[1]〜[9]のいずれかに記載の培養容器である、[11]に記載の脂肪細胞の脱分化方法。
図1Aは第一の実施形態にかかる培養容器1の使用の状態を示す側面断面図である。図1Bは第一の実施形態にかかる培養容器1の天井面13を取り除いた状態での上面図である。
図1Aに示すように、培養容器1は、培養容器本体11と、培養容器本体11の底面11c近傍に底面11cに対向して配置され、底面11cとの間に培養領域A1を形成する仕切板15と、培養容器本体11の一部に設けられた試料出入口19と、培養容器本体11に着脱自在に配置された天井面(蓋)13と、を備える。仕切板15の一端側に形成された開口部を介して培養領域A1と試料出入口19が連通している。ここでは、培養容器本体11と仕切板15の一端により開口部が定義されているが、これに限定されることはない。例えば仕切板15を底面11c近傍に底面11cの全面に対向して配置し、仕切板15の一端側の一部に天井側主面から底面側主面に至る連通孔を設けてもよい。
また仕切板15を設けたことで、図3Eに示すように培養容器1を傾けても、成熟脂肪細胞Cが流出しづらい。そのため、培養容器1を少し傾けることで、成熟脂肪細胞Cの流出を防止しつつ、培地の交換と併せて分化が進まなかった成熟脂肪細胞Dを容易に取り除くことができる。つまり、従来のような培養容器を反転させる工程が不要となる。また仕切板15と培養容器本体11により閉じた培養領域A1が形成されることで、培地の流れが制御され、穏やかな環境が形成されるため、成熟脂肪細胞Cの分化が促進される。
図2Aは第二の実施形態にかかる培養容器1Aの使用の状態を示す側面断面図である。図2Bは第二の実施形態にかかる培養容器の天井面を取り除いた状態での上面図である。第一の実施形態に係る培養容器との相違点を中心に説明する。
図2Aに示すように、培養容器1Aは、第一の実施形態に係る培養容器の構成に加え、さらに仕切板15が底面11c側主面に接着層18を備える。
培養容器1Aの用途は特に限定されないが、上述の作用効果を考慮すると、成熟脂肪細胞の脱分化を行なう際の天井培養用容器に用いられることが好ましい。
図2Aの培養容器を用いた脂肪細胞の脱分化方法について説明する。
(イ)まず図2Aの培養容器1Aを用意する。ここではフィブロネクチンからなる接着層18を備える容積75〜150cm2の培養容器1Aを用意する。
上記のように、本発明は実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面はこの発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
例えば、図1A、図2Aの第一、第二の実施形態に係る培養容器1、1Aには、以下のような変更を加えることができる。
また図8Bに示すように、試料出入口11f天井面13の表面から凸設するように形成し、スクリュー式のキャップ30で開閉可能にすることが好ましい。アイソレター内で培養容器を使用する場合でもキャップ30の開閉が容易になるからである。
なお、説明の都合上、試料出入口11fを図面の右下に配置するとしたが、特に制限されることなく、試料出入口11fは天井面13の四角の内の1つであれば何処に配置されても構わない。
また図9A,図9Cに示すように、開口部11bと対向するように、仕切板15の対角線上に空気孔11gを形成してもよい。DFATの回収時に培地が流れ易くなり、DFATを回収し易くなるからである。
空気孔11gは、開口部11bと同様に、培養容器本体11Cと仕切板15の一端により定義される他に、仕切板15の一端側の一部に天井側主面から底面側主面に至る連通孔としてもよい。但し、空気孔としての機能を発揮できれば足りるため、仕切り板15の表面積を拡げる観点から、開口部11bよりも開口径を小さくすることが好ましい。
なお、成熟脂肪細胞Cの培養時に、培養領域A1から非培養領域A2側へ成熟脂肪細胞Cが流れ出ることを防止するため、仕切板の開口部11bの縁と空気孔11gの縁に沿って、それぞれふち板15a、15gを設けることが好ましい。
接着層が脂肪細胞の接着・培養にもたらす効果をみるために、上述の成熟脂肪細胞の脱分化方法の(ロ)工程に準じて成熟脂肪細胞を分離し、その後、脂肪細胞の播種を行った。実験方法および条件を以下に示す。
日本大学倫理委員会の規定に準じ同意を得た85才女性の臀部からヒト皮下脂肪を採取した。採取した成熟脂肪細胞を洗浄した後、成熟脂肪細胞にコラゲナーゼ処理を行ない、細切後37℃で35分間振盪を行なった。その後、フィルトレーションを行なった。次に、成熟脂肪細胞を含有する溶液を遠心分離(700rpm/1分)した後、上澄液を取り出し洗浄した。この遠心分離と洗浄工程をもう一度繰り返した。エッペンドルフチューブにDMEM+2%FBS 1mlをとり、分離した成熟脂肪細胞を浮遊させた。以上により、成熟脂肪細胞を含有する細胞懸濁液(成熟脂肪細胞浮遊液)を得た。
(イ)24wellプレートの底面に曲がり鑷子を用いて滅菌済みシリコンOリング(P-11.2(JASO-2011[SI50], Oリング創研)を配置した。
(ロ)次に、1wellあたりDMEM+10%FBS 350μlに対して脂肪細胞層2.5μlとなるよう成熟脂肪細胞浮遊液を作成し、各wellに浮遊液350μlずつOリング内径内に加えた(1wellあたり約1400個の成熟脂肪細胞が入ることとなる)。6種類のコーティングカバーグラスに対して、各群4wellずつ合計24well分作成した。
(ハ)カバーグラスをOリングの上に乗せて、更にカバーグラスが浮かないようにもう一つOリングをカバーグラス上に乗せた。その際、側面から漏れた培地は吸引除去した。
(ニ)DMEM+10%FBSを1ml加え,顕微鏡下で前後左右に振盪し成熟脂肪細胞は天井面に均一に分布させた。
(ホ)その後、37度、5%CO2雰囲気下で15日間培養した。
仕切板に見立てた、以下の6種類のカバーガラスを用意した。基材と接着層(コーティング)の組み合わせを以下に示す。
仕切板1:プラスチック/コーティングなし(セルデスク13.3mm丸型0.1mm LF1(MS-92132), 住友ベークライト)
仕切板2:ガラス/コーティングなし(micro cover glass No1 15mm 丸型, 0.12-0.17mm, Matsunami)
仕切板3:ガラス/コラーゲン(No1 14mm 丸型NEU GG-14-collagen, コスモバイオ)
仕切板4:ガラス/ゼラチン(No1 14mm 丸型 NEU GG-14-gelatin, コスモバイオ)
仕切板5:ガラス/ラミニン(No1 14mm 丸型 NEU GG-14-laminin, コスモバイオ)
仕切板6:ガラス/フィブロネクチン(No1 14mm 丸型 NEU GG-14-fibronectin, コスモバイオ)
4%パラホルムアルデヒドで固定後、DAPIによる核染色を行い蛍光顕微鏡BZ-X710(Keyence)でカバーグラス全体の位相差像と各染色像の連結画像を作成した。脂肪滴を持たない紡錘型の細胞をDFATと判断し、DFATの総数は各群4well分の合計として、6群間で比較した。播種した脂肪細胞は1400個x4well分=5600個であった。図4のグラフは脂肪細胞5600個からできたDFATの総数である。
11、11A―11E 培養容器本体
11a 支持部
11b 開口部
11c 底面
11g 空気孔
13 天井面
15 仕切板
15a、15g ふち板
18 接着層
19、19E、19F 試料出入口
A1 培養領域
A2 非培養領域
C 成熟脂肪細胞
Claims (13)
- 培養容器本体と、
前記培養容器本体の底面近傍に底面に対向して配置され前記底面との間に培養領域を形成する仕切板と、
前記培養容器本体の一部に設けられた試料出入口と、を備え、
前記仕切板の一端側に形成された開口部を介して前記培養領域と前記試料出入口が連通し、
前記仕切板が前記開口部の縁に沿って前記底面側に突出したふち板を備えることを特徴とする、培養容器。 - 前記試料出入口は、前記培養容器の前記開口部側の側面もしくは天井面に設けられていることを特徴とする、請求項1に記載の培養容器。
- 前記仕切板と前記底面の離間距離は、3.5mm〜5mmであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の培養容器。
- 前記仕切板は、前記底面側主面に接着層を備えることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の培養容器。
- 前記接着層は、ラミニン、フィブロネクチン、I型コラーゲン、ゼラチンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項4に記載の培養容器。
- 前記仕切板は、前記開口部の他端側の一部に、空気孔を有することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の培養容器。
- 前記仕切板は、前記空気孔の縁に沿って前記底面側に突出したふち板を備えることを特徴とする、請求項6に記載の培養容器。
- 前記開口部と前記空気孔は、前記仕切板の略対角線上に互いに対向するように設けられていることを特徴とする、請求項6又は7に記載の培養容器。
- 前記培養容器は、脂肪細胞の脱分化を行なう際の天井培養用容器であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の培養容器。
- 培養容器の底面近傍に底面に対向して配置され前記底面との間に培養領域を形成する仕切板、前記培養領域の開口部を介して前記培養領域と連通する試料出入口を備える培養容器の前記培養領域に、成熟脂肪細胞と培養液を充填する工程と、
浮遊した前記成熟脂肪細胞を前記仕切板に接着させる工程と、
前記培養容器をわずかに傾斜させ、前記培養領域内の培養液の一部と脱分化しなかった成熟脂肪細胞を、前記開口部を介して前記試料出入口から培養容器の外に取り出す工程と、を備え、
前記仕切板が前記開口部の縁に沿って前記底面側に突出したふち板を備えることを特徴とする、脂肪細胞の脱分化方法。 - 前記接着工程において、接着層を介して、前記成熟脂肪細胞を前記仕切板に接着させることを特徴とする、請求項10に記載の脂肪細胞の脱分化方法。
- 前記傾斜角度は、90度以下であることを特徴とする、請求項10又は11に記載の脂肪細胞の脱分化方法。
- 前記培養容器が、請求項1〜8のいずれか1項に記載の培養容器であることを特徴とする、請求項10〜12のいずれか1項に記載の脂肪細胞の脱分化方法。
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