JP2001190270A - 動物細胞傾斜培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】動物細胞担体上及び／または担体内を緩やかな
かつ均一な流速で培養液を流す 【構成】平面状担体を３０度以内に傾斜させその上端か
ら培養液を流下させる。毛細管現象を生ずる素材で培養
液を吸引し傾斜に沿って流下させると細胞を損傷するこ
となく培養液を流下させうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は動物細胞培養装置に関
し、平面または三次元の細胞担体に高密度に動物細胞を
培養または維持するのに有効であり、接着依存性または
緩やかな接着依存性細胞の培養または維持に適用され
る。その用途は皮膚、肝臓、血管等の人工臓器の研究や
製造、組織細胞、ＣＨＯ細胞や各種株化細胞等による物
質生産、薬剤の代謝研究や動物実験の代替等に利用され
る。

【０００２】

【従来の技術】従来動物細胞を少なくとも一辺が２ｃｍ
以上他辺が５ｍｍ以上の平面状の担体上で培養する場合
シャーレで静置して培養しているが細胞の種類によって
は増殖や分化のためにはストレスが必要な場合があり、
安定にストレスを加える装置がない。シャーレをゆっく
り揺する方法もあるがシャーレ内の場所によって流速が
異なるので細胞が受ける剪断力が異なる問題点があっ
た。

【０００３】さらに上記の平面状担体を用いた培養では
流速が計測できないため剪断力と細胞の損傷との関係や
最適な培養条件の検討ができない問題点もあった。

【０００４】三次元の多孔質担体に細胞を固定した固定
床で培養する場合、固定床に上部から培養液を流す方法
がある。しかし上部から培養液を流すと固定床の内部に
比し外縁付近の流速が大きくなり、動物細胞は剪断力に
脆弱であるため流速によって損傷を受けやすい。固定床
内部は逆に流速が得られず、酸素や栄養が不足して壊死
しやすい問題があった。すなわち細胞の位置によって曝
される流速が均一にならず、すべての細胞に好適な流速
で培養液を供給できないため細胞を三次元に高密度に増
殖させることができなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は従来の
欠点に鑑み培養平面または三次元担体全域で均一にかつ
細胞を損傷しない流速で培養液を流し細胞を好適な培養
環境に保つことである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を検討するうち細胞の平面状担体を３０度以下に傾斜さ
せて配置し、培養液をその上端部近傍から流せば担体全
体に均一な流速で培養液を供給できること、担体が多孔
質の場合でも担体内部と表面の流速の差を小さくしうる
こと、担体の上端部と培養液を毛細管現象を生ずる素材
で液絡すれば毛細管現象で吸い上げた培養液だけが供給
されるので担体に過剰な培養液を流すことなく一定な流
速で細胞に栄養を供給しうること等を知見し本発明を完
成させた。

【０００７】すなわち本発明は動物細胞傾斜培養装置で
あり、３０度以下に傾斜させた動物細胞の平面状担体、
培養液槽及び該培養液槽中の培養液を前記担体の上端部
近傍に供給する手段を備えたことを特徴とする。その好
適形態は上記担体は多孔質であり、三次元構造を有する
ことを特徴とする。さらにその好適形態は上記担体は傾
斜方向に配向する襞を有することを特徴とする。

【０００８】さらに上記動物細胞傾斜培養装置の好適形
態は多孔質担体の下面に接して培養液が通過しない剛体
が配置されていることである。また本発明の好適形態は
上記担体の上端部と培養液槽中の培養液は毛細管現象を
生ずる素材で液絡されていることを特徴とする。さらに
その好適形態は上記培養液槽を溢れた培養液の流路を備
えることを特徴とする。さらにその好適形態は上記担体
は複数が空隙を挟んでほぼ平行に配置されていることを
特徴としさらにその好適形態は上記空隙には中空糸が傾
斜方向に配置されていることを特徴とする。さらに本発
明の好適形態は担体の傾斜の角度を変える機構を有する
ことを特徴とする。

【０００９】

【作用】３０度以下に傾斜させた動物細胞の平面状担体
の上端部付近に培養液を供給すると培養液は担体の表面
及び／または内部を緩やかに流れるので動物細胞を損傷
することなく培養液を供給しうる。流速の調整も傾斜角
度の調整で容易にできる。流速は担体の角度のほか担体
の流れに対する抵抗、担体の長さや供給される培養液量
の影響を受け、これらの最適値は培養目的や細胞種によ
って異なるが傾斜方向に２ｃｍ以上の担体では３０度を
越えるとポンプ等で培養液を上端付近に供給した場合細
胞の外縁付近が流速が速くなり細胞に損傷が生ずること
がある上、流量の制御が難しい。担体は表面のみを利用
するものでも多孔質内部を利用できる三次元構造を有す
るものでも利用でき、襞があっても全体として平面状で
あればよい。襞が傾斜方向に配向することによって担体
の水平度が悪くても培養液は襞の凹部を流れるので傾斜
方向へ培養液を担体に沿って流下させることが出来る。

【００１０】上記担体が撓みやすいと培養液が下へかた
よってしまい全体を均一に流れないので、培養液が通過
しない剛体を配置すれば撓み防止とともに流速を均一化
する効果もある。また担体が多孔質の場合培養液が担体
から落下するのを防いで培養液を流下させることが出来
る。

【００１１】培養液槽中の培養液を担体に供給する手段
はポンプや点滴に利用されている様な静水圧による流下
手段も利用できるが担体上端部と培養液を毛細管現象を
生ずる素材で液絡することによって培養液を細胞に損傷
を与える流速に至ることなくまたポンプを使わなくても
安定な流速で供給できる。培養液が毛細管現象で吸い上
がったのち傾斜した担体に沿って流下するためには毛細
管現象を生ずる素材の下端が培養液液面より下である必
要がある。毛細管現象を生ずる素材は多孔質担体と別で
もよいが、同じ素材でもよい。このように培養液が毛細
管現象で吸い上がりそののち傾斜した担体を流れ下りる
と培養液は過剰に流れることはなく、細胞への剪断力を
少なくしうる。

【００１２】培養液を培養液槽に供給する速度が培養液
槽から担体に供給する速度より速いと長期的には培養液
槽から溢れるし、遅いと培養液槽中の培養液はなくなり
担体に十分量を供給できない。すなわち培養液槽への培
養液の供給と培養液槽から担体への培養液の供給は同じ
速度でなければならずポンプ等によるこの調整は極めて
難しい。培養液槽を溢れた培養液の流路を備えれば培養
液槽への培養液の供給速度を培養液槽から担体への供給
速度より大きくしておけばよいので調整が容易である。

【００１３】平面状担体を複数用いる場合担体を空隙を
挟んでほぼ平行に配置すればよい。担体が多孔質の場合
単に重ねてその厚さが２ｍｍを越えると動物細胞が高密
度に増殖した時に担体内部の細胞には栄養や酸素が供給
されず壊死することがあるので、担体を空隙を挟んでほ
ぼ平行に配置し、該空隙から培養液及び酸素を供給すれ
ば効率よく供給できる。空隙に培養液を供給してもよい
が、気相にして担体中のガス交換を促進してもよい。

【００１４】この空隙に中空糸を培養液の流れ方向に配
置すれば空隙を確実に確保できる。中空糸中には培養液
を流してもよいし、気相にしておけばガス交換の作用が
得られる。多孔質担体を中空糸を挟んで密着させ、中空
糸中に培養液を流せば栄養は中空糸から供給される。

【００１５】上記担体が角度を変える機構を有すると培
養液の流速や方向を変更できる。例えば担体に新鮮な培
養液を供給する時は傾斜を設けて培養液を流下させ、培
養液が担体上の細胞に供給されたり、多孔質担体内の培
養液が入れ替わったら担体の傾斜角度をゆるめて流速を
下げる又は停止すると、細胞は常時は流速にさらされな
くてすむ。また細胞を播種する時は水平にし、細胞が接
着したり固定されたら傾斜を設けて培養液を流下させる
ことも可能である。

【００１６】また担体を間欠的にシーソーのように傾斜
を反転する機構を設けておき、その上端付近に培養液を
供給し、上流と下流を間欠的に交換する事によって細胞
の環境を均一化することが出来る。担体の両端を毛細管
現象を生ずる素材で培養液槽に液絡すればポンプを使わ
なくても培養液を供給できる。

【００１７】

【発明の実施の形態】発明の実施の形態について以下に
説明する。本発明は細胞が担体表面に単層状に形成され
る場合、細胞自身がコラーゲンの足場を作って積層する
場合、多孔質担体内部に細胞が増殖または固定される場
合等平面状担体表面及び／または内部に細胞が存在する
系で利用できる。

【００１８】動物細胞の平面状担体はポリカーボネー
ト、ポリスチレンやポリエステル等プラスチックの板や
フィルムの他ガラスや金属等の平面が利用できる。平面
状多孔質担体は三次元構造を有し、細胞が親和性を有す
る素材が利用でき、担体を形成する素材自身に孔があい
ている物、素材には孔はないが孔のない素材を集めるこ
とによって素材間に孔が生ずる物やその組み合わせが利
用できる。ガーゼ、多孔質セラミック、多孔質ガラス、
ヒドロキシアパタイト、多孔質セルロース、ポリエステ
ルや四弗化エチレン等のプラスチック製不織布、金属や
ガラスの焼結体やこれらにコラーゲン等細胞が接着しや
すい素材をコーティングしたもの等が例示できる。多孔
質担体の厚みは細胞が三次元を構築できるよう０．０５
ｍｍ以上が望ましい。

【００１９】多孔質担体の孔は細胞が収納または接着で
きる大きさが必要であり、細胞を組織状にまで高密度化
する場合はその厚さは２ｍｍ以下さらに望ましくは１ｍ
ｍ以下がよい。１ｍｍを越えると内部の細胞に培養液や
酸素が十分供給されず壊死することがある。細胞密度を
組織状まで高密度化しない場合はそれ以上の厚さでも支
障がないこともある。

【００２０】

【実施例１】本発明を実施例に従って説明する。図１は
実施例１の断面図を示す。培養槽１には蓋２が被せら
れ、底面３が傾斜を持って配置されている。底面には平
面状担体４が配置され、最下端部には底面より低い位置
に培養液槽５が形成されている。培養液槽中の培養液６
はポンプ７によって抜き取られ担体４の上端付近に戻さ
れる。培養液抜き取り口８及び供給口９はそれぞれ蓋を
密封貫通して固定されている。

【００２１】

【実施例の実施の態様】上記実施例の実施の態様の例を
示す。まず担体４が水平になるように培養槽１を水平に
配置し、担体４が培養液に浸るまで培養液を張り込んで
細胞を播種する。細胞が接着した時期に培養槽を図１の
ように斜めに配置し、培養液をポンプ７で循環する。こ
のように培養すると担体上面は常時気相に触れるか薄い
培養液層を介して気相に触れるので、ガスの供給及び放
出も容易に行われる。実施例には記さなかったが長期間
培養する場合培養液の一部を抜き取り、その分新鮮な培
養液を供給するか、間欠的に培養液を交換することが望
ましい。担体は上面を接着面として利用するものと多孔
質で三次元構造を有するものが利用できる。細胞が流速
の剪断力により損傷を受ける場合はポンプを間欠的に作
動させてもよい。

【００２２】

【実施例２】図２及び図３はそれぞれ本発明の実施例２
の断面図及びそのＡ−Ｂ切断面図を示す。培養槽１の底
３の両端に傾斜に沿って設けた棚１０が形成され、その
上に通液性のない剛体１１が配置されさらにその上に可
撓性多孔質担体１２が配置されている。棚１０と底３で
囲まれた部分は培養液流路１３を形成している。培養槽
の上端及び下端には底より低い位置に培養液槽５及び培
養液貯め１４が形成されている。多孔質担体１２の上端
は培養液槽に収納され培養液に浸漬している。培養液貯
め内の培養液はポンプ７で培養液槽に戻される。培養液
槽中の培養液は担体の毛細管現象によって自動的に吸い
上げられ担体上及び担体内を流下する。構造を図示しな
いが培養槽の傾斜はシーソーのように反転可能に構成さ
れている。

【００２３】

【実施例２の実施の態様】実施例２の実施の態様を説明
する。実施例１と同様に多孔質担体１２を水平にして担
体上に細胞を播種し、細胞を固定した後図２のように傾
斜させる。培養液は毛細管現象で吸い上がり、ついで低
い方へ流下する。ポンプ７の流速は培養液の流下速度よ
り早く設定しておくと培養液槽５を溢れた培養液は培養
液流路１３を流下し、液面は常に培養液槽５の上端にな
るので担体１２を流下する培養液流速は安定する。培養
槽の傾斜を間欠的に反転させると培養液が担体上及び／
または担体内を流れる方向が逆になり担体の環境がより
均一になる。本実施例でポンプを利用しなくても間欠的
に傾斜を反転させると培養液を両方向に交互に流下させ
る事が出来る。細胞は予め担体上にシャーレで培養して
おきこれを剛体１１に乗せても良い。

【００２４】

【実施例３】図４及び図５に実施例３の断面図及びその
Ｃ−Ｄ切断面図を示す。平面状多孔質担体１２は複数が
空隙２１を有してほぼ平行に配置され、空隙には中空糸
２２が傾斜方向に配向して配置されている。多孔質担体
１２の少なくとも一つは培養液槽中の培養液に浸漬され
ている。担体は可撓性を有し、端末は図４に示すように
折れ曲がって互いに接触している。培養槽は構造を図示
しないが傾斜が反転可能に構成されている。中空糸２２
は通液性または通気性の素材で作られていることが望ま
しい。

【００２５】

【実施例３の実施の態様】実施例３の実施の態様を説明
する。培養液６はその表面張力により、毛細管現象で担
体に吸引され次いで下方に流下する。担体同士は接触し
ているので培養液は全ての担体を流下する。中空糸は空
隙を設けるためのスペーサーとしての役割も果たし、さ
らに中空糸中をも培養液が流れうるまたはガスを保持し
うるので中空糸の素材を通して栄養または酸素を細胞に
供給できるので、スペーサーが培養液または酸素が担体
中に拡散する阻害にならなくてよい利点もある。

【００２６】

【その他の実施例】本発明は上記実施例に限定されるこ
とはなく例えば傾斜させた平面状担体に平面状の毛細管
現象を生ずる素材の一端をかぶせ、他端を培養液に浸漬
する事によっても培養液を流下させうる。また培養液は
連続的に流下する必要はなく、担体上及び／または担体
内の細胞に培養液を供給してのち、１時間以内培養液を
供給せず気相と接触させてガス交換を促進した方がよい
場合もある。

【００２７】

【発明の効果】本発明は平面状担体に傾斜を設けて培養
液を流下させるため、培養液を緩やかな流速で担体上及
び／または担体内に流すことが出来る。また担体の厚さ
及び幅を流下方向に同一にしておけば上流から下流まで
均一な流速で培養液が流れるので培養結果の解析が容易
になる利点もある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１の断面図を示す

【図２】本発明の実施例２の断面図を示す

【図３】図２のＡ−Ｂ切断面図を示す

【図４】本発明の実施例３の断面図を示す

【図５】図４のＣ−Ｄ切断面図を示す

【符号の説明】

１培養槽 ２蓋 ３底面 ４平面状担体 ５培養液槽 ６培養液 ７ポンプ ８培養液抜き取り口 ９培養液供給口 １０棚 １１剛体 １２多孔質担体 １３培養液流路 ２１空隙 ２２中空糸

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岩瀬 光明 東京都新宿区東五軒町４の15 エイブル株 式会社内 (72)発明者 石川 陽一 東京都新宿区東五軒町４の15 エイブル株 式会社内 Ｆターム(参考） 4B029 AA05 AA08 AA21 BB11 CC02 CC08 GA08 GB01 GB09 GB10 4B065 AA90X BC42 BC50

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】３０度以下に傾斜させた動物細胞の平面状
   担体、培養液槽及び該培養液槽中の培養液を前記担体の
   上端部近傍に供給する手段を備えたことを特徴とする動
   物細胞傾斜培養装置
2. 【請求項２】上記担体は多孔質であり、三次元構造を有
   することを特徴とする請求項１に記載の動物細胞傾斜培
   養装置
3. 【請求項３】上記担体は傾斜方向に配向する襞を有する
   ことを特徴とする請求項１または２に記載の動物細胞傾
   斜培養装置
4. 【請求項４】多孔質担体の下面に接して培養液が通過し
   ない剛体が配置されていることを特徴とする請求項２ま
   たは３に記載の動物細胞傾斜培養装置
5. 【請求項５】上記担体の上端部と培養液槽中の培養液は
   毛細管現象を生ずる素材で液絡されていることを特徴と
   する請求項１〜４のいずれかに記載の動物細胞傾斜培養
   装置
6. 【請求項６】上記培養液槽を溢れた培養液の流路を備え
   ることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の動
   物細胞傾斜培養装置
7. 【請求項７】上記担体は複数が空隙を挟んでほぼ平行に
   配置されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれ
   かに記載の動物細胞傾斜培養装置
8. 【請求項８】上記空隙には中空糸が傾斜方向に配置され
   ていることを特徴とする請求項７に記載の動物細胞傾斜
   培養装置
9. 【請求項９】上記担体の傾斜の角度を変える機構を有す
   ることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の動
   物細胞傾斜培養装置