DE102005041526A1

DE102005041526A1 - Semi-kontinuierlicher Fermentationsprozess

Info

Publication number: DE102005041526A1
Application number: DE200510041526
Authority: DE
Inventors: Ralf Harand
Original assignee: Altana Pharma AG
Current assignee: Takeda GmbH
Priority date: 2005-08-31
Filing date: 2005-08-31
Publication date: 2007-03-01
Also published as: WO2007025968A1; JP2009505672A; EP1924682A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biosynthese eines Biomoleküls durch Mikroorganismen in einer Vielzahl von Fermentationsbehältern, welche eine Außenwand aufweisen, die für die Mikroorganismen undurchlässig, jedoch zumindest in einem Teilbereich gasdurchlässig ist; DOLLAR A umfassend die Schritte DOLLAR A (a) Einbringen eines Nährmediums in die Fermentationsbehälter; DOLLAR A (b) ggf. Verschließen der Fermentationsbehälter, so dass ein Stoffaustausch mit der Umgebung nur noch durch die Außenwand der Fermentationsbehälter hindurch erfolgen kann; DOLLAR A (c) ggf. Sterilisieren der Fermentationsbehälter; DOLLAR A (d) Animpfen des Nährmediums in jedem Fermentationsbehälter durch aseptische Zugabe der Mikroorganismen; DOLLAR A (e) Einbringen der Fermentationsbehälter in ein Fermentationsbad, in welchem ein Gas oder Gasgemisch gelöst ist; und DOLLAR A (f) ggf. Entfernen der Fermentationsbehälter aus dem Fermentationsbad. DOLLAR A Ferner betrifft die Erfindung einen Fermentationsbehälter und dessen Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biosynthese von Biomolekülen durch Mikroorganismen und einen Fermentationsbehälter, welcher vorteilhaft in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann.

Zahlreiche pharmazeutische (Zwischen-)Produkte werden heutzutage auf biochemischem Weg hergestellt. Dabei werden häufig Mikroorganismen, wie z.B. Zelllinien, Pilze (Hefen) oder Bakterien, in geeigneten Medien kultiviert und mit den Nährstoffen versorgt, welche für die Biosynthese des gewünschten Biomoleküls erforderlich sind. Je nach verwendetem Mikroorganismus müssen dabei üblicherweise wohl definierte Rahmenbedingungen, wie z.B. pH-Wert, Temperatur, Salz- und Nährstoffkonzentration, Art und Partialdruck bestimmter Gase, etc. genau eingehalten werden, damit eine Biosynthese gelingt und über einen längeren Zeitraum aufrecht erhalten werden kann.

Da auf diese Weise nicht nur optimale Wachstumsbedingungen für einen bestimmten Organismus geschaffen werden, muss sorgfältig darauf geachtet werden, dass keine Kontamination durch Fremdorganismen, aber auch keine sonstige Verunreinigung erfolgt. Üblicherweise werden derartige Prozesse in Kesseln (Fermentern) mit einer Reihe typischer Einbauten durchgeführt, wie z.B. Rührwerke, Zu- und Abluftfilter, Temperiervorrichtungen, etc. Die verwendeten Gerätschaften und auch die Nährmedien werden üblicherweise vor der Kultivierung der Mikroorganismen sterilisiert. Darüber hinaus werden meist während des gesamten Prozesses aseptische Bedingungen aufrecht erhalten.

Biotechnologische Prozesse können grundsätzlich kontinuierlich, semi-kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden.

Es ist bekannt, dass kontinuierliche Prozesse prinzipiell deutlich kostengünstiger, rationeller, mit geringeren Qualitätsschwankungen und sicherer Ablaufen als Chargen-Prozesse (Batch-Prozesse). Dennoch werden in der pharmazeutischen Biotechnologie kontinuierliche Prozesse bisher kaum angewendet. Dafür sind vor allem zwei Gründe verantwortlich: einerseits besteht von Seiten der Aufsichtsbehörden der Wunsch nach einer nachverfolgbaren Definition der einzelnen Chargen, andererseits besteht das Risiko, dass selbst die kleinste (mikrobiologische) Kontamination zu einem nicht berechenbaren Ergebnis, zu einem Aufschaukeln oder gar zum Umkippen des Prozesses führen kann.

Bei semi-kontinuierlicher Durchführung biochemischer Prozesse wird üblicherweise ein Fermenter zur Kultivierung benutzt und zu bestimmten Zeitpunkten ein Teil des enthaltenen Fermentationsmediums entnommen und durch frisches Nährmedium ersetzt (sog. fed-batch Kultur). Das in regelmäßigen Abständen entnommene Fermentationsmedium enthält dann das durch Biosynthese synthetisierte Biomolekül. In diesem Zusammenhang kann beispielsweise auf US 5,342,765 und US 6,610,516 verwiesen werden. Diese Art der semi-kontinuierlichen Prozessführung hat jedoch den Nachteil, dass die kultivierten Mikroorganismen – wenigstens zum Teil – relativ lange im Fermenter verbleiben, was bei Mikroorganismen mit vergleichsweise geringer genetischer Stabilität zu Problemen durch Mutationen führen kann. Ferner erhöht das wiederholte Entnehmen und Nachfüllen von Medium das Risiko, den Fermentationsansatz durch Fremdorganismen zu kontaminieren.

Bei diskontinuierlicher Durchführung biochemischer Prozesse (Chargen-, Batch-Prozesse) wird pro Fermenter ein Prozess angesetzt und anschließend vollständig aufgearbeitet. Eine Kostenminimierung bei diskontinuierlicher Prozessführung ist praktisch nur möglich, wenn der Ansatz pro Charge vergrößert wird, wenn also beispielsweise von einem Reaktor mit einem Fassungsvermögen von 1.000 l auf einen Reaktor mit einem Fassungsvermögen von 15.000 l übergegangen wird. Die Ansatzvergrößerung erhöht jedoch auch das Kostenrisiko, da im Falle einer Kontamination ggf. der gesamte Großansatz verworfen werden muss.

Neben dem Risiko der Kontamination besteht bei großen Volumina ein wesentliches Problem derartiger Prozesse im mangelhaften Stofftransport. So müssen beispielsweise zugeführte Gase, wie O₂, eine vergleichsweise große Wegstrecke durch das Fermentationsmedium zurücklegen, ehe sie vom Ort ihrer Einspeisung die Mikroorganismen erreicht haben. Dies gilt ebenso für Nebenprodukte des Prozesses, wie beispielsweise CO₂, welche abgeführt werden müssen. Es ist bekannt, dass Stofftransportproblematiken überproportional mit der Vergrößerung des Prozessmaßstabs ansteigen. Gelöst wird dieses Problem häufig durch starke Rührwerke, welche eine hohe kinetische Energie in das Fermentationsmedium einbringen. Von Nachteil ist dabei jedoch, dass gleichzeitig hohe Scherkräfte erzeugt werden, welche die Mikroorganismen schädigen können.

Es besteht somit ein Bedarf an einem Prozess zur Biosynthese eines Biomoleküls, welcher die vorstehend genannten Nachteile der Prozesse des Standes der Technik minimiert oder umgeht.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Biosynthese eines Biomoleküls durch Mikroorganismen bereitzustellen, welches Vorteile gegenüber dem Stand der Technik aufweist. Das Verfahren sollte auch in großem Maßstab durchgeführt werden können und das Risiko verringern, dass im Falle einer Kontamination, insbesondere mit Fremdorganismen, der gesamte (Groß-)Ansatz verworfen werden muss. Ferner sollte das Verfahren kostengünstig sein, automatisiert und in Reinraumkonzepte integriert werden können.

Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst. Es wurde überraschend gefunden, dass sich das mit der Möglichkeit der Kontamination einhergehende Kostenrisiko verringern lässt, wenn das Fermentationsmedium auf eine Vielzahl von Fermentationsbehältern aufgeteilt wird und diese während der Biosynthese unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biosynthese (Fermentation) eines Biomoleküls durch Mikroorganismen in einer Vielzahl von Fermentationsbehältern, welche eine Außenwand aufweisen, die für die Mikroorganismen undurchlässig, jedoch zumindest in einem Teilbereich gasdurchlässig ist,
umfassend die Schritte

(a) Einbringen eines Nährmediums in die Fermentationsbehälter;
(b) ggf. Verschließen der Fermentationsbehälter, so dass ein Stoffaustausch, vorzugsweise Gasaustausch, mit der Umgebung nur noch durch die Außenwand der Fermentationsbehälter hindurch erfolgen kann;
(c) ggf. Sterilisieren der Fermentationsbehälter;
(d) Animpfen des Nährmediums in jedem Fermentationsbehälter durch aseptische Zugabe der Mikroorganismen;
(e) Einbringen der Fermentationsbehälter in ein Fermentationsbad, in dem ein Gas oder Gasgemisch gelöst ist, wobei das Fermentationsbad vorzugsweise mit dem Gas oder Gasgemisch durchsprudelt wird; und
(f) ggf. Entfernen der Fermentationsbehälter aus dem Fermentationsbad.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass die Biosynthese in den Fermentationsbehältern als separate Kompartimente abläuft, so dass eine eventuelle Kontamination nur einen einzelnen Fermentationsbehälter, nicht jedoch den gesamten Reaktionsansatz betrifft. Der einzelne kontaminierte Fermentationsbehälter kann meist infolge seiner atypischen Verfärbung mit bloßem Auge identifiziert und aussortiert werden. Auf diese Weise wird das Kostenrisiko des Gesamtverfahrens erheblich reduziert. Dennoch können im wesentlichen alle Vorteile, welche die Vergrößerung des Reaktionsansatzes mit sich bringt, genutzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich automatisieren und/oder semi-kontinuierlich durchführen.

1 zeigt eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. 2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Schritte (e) und (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens. 3 bis 7 zeigen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters.

Der Begriff "Biosynthese" im Sinne der Beschreibung umfasst jede Fermentation, d.h. die Umsetzung von biologischen Materialien durch Mikroorganismen, insbesondere Bakterien-, Pilz-, oder Zellkulturen.

Unter "Biomolekül" im Sinne der Beschreibung ist jedes organische Molekül zu verstehen, welches durch Mikroorganismen, die ggf. genetisch manipuliert sind, im Wege einer Biosynthese (Fermentation) hergestellt werden kann. Beispiele für Biomoleküle sind Proteine, welche ggf. posttranslational modifiziert sein können.

Unter "Nährmedium" im Sinne der Beschreibung ist ein Medium zu verstehen, welches grundsätzlich zur Aufzucht von Mikroorganismen geeignet ist, diese jedoch noch nicht enthält. Dabei umfasst der Begriff auch solche Medien, denen für die spätere Biosynthese essentielle Zusätze (z.B. Aktivatoren oder bestimmte Nährstoffe) erst zu einem späteren Zeitpunkt des Verfahrens zugeführt werden.

Unter "Fermentationsmedium" im Sinne der Beschreibung ist ein Medium zu verstehen, welches bereits Mikroorganismen enthält, die das Nährmedium noch nicht, bereits zum Teil oder vollständig umgesetzt haben.

In Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Nährmedium in die Fermentationsbehälter eingebracht. Die Art und die Zusammensetzung des Nährmediums hängt von den Mikroorganismen ab, welche zur Biosynthese eingesetzt werden. Bevorzugt handelt es sich bei dem Nährmedium um eine Flüssigkeit, in welcher übliche Nähr- und Hilfsstoffe gelöst und/oder suspendiert vorliegen. Derartige Nähr- und Hilfsstoffe sind dem Fachmann bekannt. In diesem Zusammenhang kann beispielsweise vollumfänglich verwiesen werden auf S. Isaac et al., Kultur von Mikroorganismen, Spektrum Akademischer Verlag, 1996; K. Schügerl, Bioreaktionstechnik, Bioprozesse mit Mikroorganismen und Zellen, Birkhäuser Verlag, 1997; M.A. Harrison et al., General Techniques of Cell Culture (Handbooks in Practical Animal Cell Biology), Cambridge University Press (1997); M. Clynes, Animal Cell Culture Techniques, Springer, Berlin, 1998; T. Lindl, Zell- und Gewebekultur, Spektrum Akademischer Verlag, 2002; V. Vinci et al., Handbook of Industrial Cell Culture: Mammalian, Microbial, and Plant Cells, Humana Press, 2002; und C.D. Helgason et al., Basic Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 3rd Bk&Cdr ed. (2004).

Üblicherweise enthalten derartige Nährmedien Puffer, Elektrolyte, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Vitamine und/oder Coenzyme. Zusätzlich können aber auch beispielsweise Antibiotika, gegen welche die verwendeten Mikroorganismen resistent sind, Farbstoffe, etc. enthalten sein.

Bevorzugt enthält das Nährmedium zu diesem Zeitpunkt noch keine Mikroorganismen, mit denen später die Biosynthese durchgeführt werden soll (d.h. es liegt zu diesem Zeitpunkt bevorzugt noch kein Fermentationsmedium vor).

Das Einbringen des Nährmediums in die Fermentationsbehälter kann auf verschiedene Weise verwirklicht werden. Die Abfüllung der Fermentationsbehälter mit Nährmedium kann unter aseptischen oder, wenn eine abschließende Sterilisation der befüllten Fermentationsbehälter vor der Animpfung in Schritt (d) erfolgen soll – unter nicht aseptischen Bedingungen erfolgen.

Bevorzugt weisen die Fermentationsbehälter Öffnungen auf, welche zum Befüllen mit Nährmedium geeignet sind und vorzugsweise wiederverschließbar sind.

Handelt es sich bei dem Nährmedium um eine Flüssigkeit, so kann diese beispielsweise in die Fermentationsbehälter gegossen, gespritzt, getropft, gesprüht, gepresst oder auf sonstige Weise eingebracht werden. Die Abfüllung kann auf am Markt verfügbaren Abfüllmaschinen für Flüssigkeiten, z.B. großvolumige Beutel oder Flaschen für Parenteralien, erfolgen.

Umfasst das Nährmedium einen Feststoff, welcher erst später gelöst wird, so kann dieser beispielsweise mit Hilfe von Trichtern, Löffeln, Schaufeln oder Spateln in die Fermentationsbehälter gefüllt werden. Zur Lösung der Feststoffe kann anschließend eine geeignete Flüssigkeit, üblicherweise Wasser, eine wässrige Lösung oder Halogenkohlenwasserstoffe, insbesondere Perfluorkohlenwasserstoffe, z.B. Perflubron, in die Fermentationsbehälter gefüllt werden.

Vorzugsweise werden die Fermentationsbehälter wenigstens zu 70% ihres Volumens mit Nährmedium befüllt, bevorzugter wenigstens zu 80% und insbesondere wenigstens zu 90% oder sogar wenigstens zu 95%. Auf diese Weise wird gewährleistet, dass das Nähr- bzw. Fermentationsmedium während der Biosynthese die Außenwand der Fermentationsbehälter zu einem Großteil benetzt, so dass der Gasaustausch, welcher während der Biosynthese durch zumindest einen Teil der Außenwand hindurch erfolgt, einen hohen Wirkungsgrad erreicht.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den optionalen Schritt (b), welcher vorzugsweise unmittelbar nach Schritt (a) durchgeführt wird. Dabei werden die Fermentationsbehälter in einer Weise verschlossen, dass ein Stoffaustausch mit der Umgebung nur noch durch die Außenwand der Fermentationsbehälter hindurch erfolgen kann. Die Außenwand der Fermentationsbehälter ist zu diesem Zweck zumindest in Teilbereichen aus einem Material gefertigt, welches einen späteren Stoffaustausch, insbesondere Gasaustausch, mit der Umgebung ermöglicht.

Die Öffnungen der Fermentationsbehälter, durch welche beispielsweise in Schritt (a) das Nährmedium in die Fermentationsbehälter eingebracht wurde, werden in diesem optionalen Verfahrensschritt verschlossen. Dies kann irreversibel, beispielsweise durch Verschweißen oder Verkleben geschehen. Bevorzugt erfolgt das Verschließen jedoch auf eine Weise, welche reversibel ist. Dazu können die Fermentationsbehälter beispielsweise Schraubverschlüsse oder ähnlich wirkende Verschlüsse aufweisen, welche zum wiederholten Öffnen und Verschließen geeignet sind. Derartige Verschlüsse sind dem Fachmann bekannt. Es stehen abhängig von den ggf. an den Fermentationsbehältern befindlichen Anschlüssen bzw. Öffnungen eine Vielzahl an Verschlusstechniken und -maschinen zur Verfügung, beispielsweise Gummistopfen, Aluminiumbördelkappen, Schraub- oder Steckverschlüsse (z.B. Luer-Lock-Verschlüsse).

Das Verschließen der Fermentationsbehälter bewirkt, dass kein unkontrollierter Stoffaustausch zwischen der Umgebung der Fermentationsbehälter und ihrem Inneren erfolgen kann. Da die Außenwand der Fermentationsbehälter für Mikroorganismen undurchlässig ist, können nicht nur keine Mikroorganismen aus dem Innern der Fermentationsbehälter entweichen, sondern insbesondere auch keine Mikroorganismen von außen in die Fermentationsbehälter eindringen.

Bevorzugt befinden sich nach Durchführen von Schritt (a) und (b) innerhalb des Fermentationsbehälters noch keine Mikroorganismen, mit denen später die Biosynthese durchgeführt werden soll (d.h. es liegt zu diesem Zeitpunkt noch kein Fermentationsmedium vor).

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt anschließend in Schritt (c) die Sterilisation der Fermentationsbehälter. Dieser Prozessschritt empfiehlt sich, wenn die Befüllung in Schritt (a) und ggf. das Verschließen in Schritt (b) unter nicht aseptischen Bedingungen erfolgt sind und deshalb die befüllten Fermentationsbehälter abschließend, d.h. in befülltem Zustand am Ende des Abfüllprozesses, sterilisiert werden sollen. Die optionale Sterilisation kann auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten dazu bekannt, beispielsweise kann die Sterilisation durch Heißdampf, trockene Hitze, ionisierende Strahlung (γ- oder β-Sterilisation) oder mit Ethylenoxid erfolgen.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Sterilisation mit Heißdampf im Gegendruckautoklaven bei 121 °C, beispielsweise für 30 Minuten. Ein ausreichender Gegendruck ist hier von Vorteil, um Schäden an den Fermentationsbehältern durch Aufblähen zu vermeiden. Ggf. kann es vorteilhaft sein, die befüllten Fermentationsbehälter während der Sterilisation zu rotieren (Rotationsautoklav), um einen besseren Wärmeübergang zu erreichen und ein "Anbacken" des Nährmediums innerhalb der Fermentationsbehälter durch lokale Überhitzung zu vermeiden.

Durch den optionalen Sterilisationsschritt (c) wird gewährleistet, dass etwaige Kontaminationen des Nährmediums durch Fremdorganismen, wie z.B. durch Bakterien, Zellen oder Pilze, unschädlich gemacht werden.

Im Anschluss an die optionale Sterilisation der Fermentationsbehälter in Schritt (c) wird in Schritt (d) das Nährmedium jedes Fermentationsbehälters durch aseptische Zugabe der Mikroorganismen angeimpft. Auf diese Weise wird das Nährmedium in ein Fermentationsmedium überführt. Dazu wird bevorzugt vorübergehend ein Zugang von außen in das Innere der Fermentationsbehälter geschaffen. Bei diesem Zugang kann es sich um eine Öffnung handeln, welche ggf. zuvor in Schritt (b) verschlossen wurde.

Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auf unterschiedliche, dem Fachmann bekannte Art und Weise realisiert werden. Beispielsweise können die Fermentationsbehälter mit einer Vorrichtung zur aseptischen Zugabe einer festen oder flüssigen Zusammensetzung ausgerüstet sein, welche zum Zwecke der Zugabe der Mikroorganismen mit einer Nadel oder einem Dorn durchstochen werden kann und sich nach dem Entfernen der Nadel oder des Dorns wieder selbsttätig verschließt. Geeignete Materialien zur Herstellung derartiger Verschlüsse sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise eignen sich Membranen, wie sie auch zur Herstellung von Septen verwendet werden, beispielsweise zur aseptischen Entnahme von Injektionsseren mit Hilfe von Kanülen.

Die zum Animpfen der Fermentationsbehälter verwendeten Mikroorganismen können bevorzugt zunächst in einer Schüttler- oder Vorkultur gemäß den Standardmethoden der Mikrobiologie und den Anforderungen des speziellen Mikroorganismus kultiviert werden.

Alternativ können zum Animpfen Mikroorganismen aus Fermentationsbehältern entnommen werden, welche das erfindungsgemäße Verfahren bereits durchlaufen und zur Biosynthese des zu synthetisierenden Biomoleküls beigetragen haben. Fertig abreagierte (fermentierte) Fermentationsbehälter können dazu aus dem laufenden Prozess entnommen werden. Ggf. nach Überprüfung der Fermentationsbehälter auf mikrobiologische Kontaminationen und Messung der Zelldichte wird aus diesen Fermentationsbehältern unter aseptischen Bedingungen Fermentationsmedium entnommen, um damit frische, mit Nährmedium befüllte Fermentationsbehälter anzuimpfen. Welche Überprüfungen notwendig sind, hängt vom jeweiligen Mikroorganismus und den Anforderungen an das durch Biosynthese herzustellende Biomolekül ab. Wie häufig der Prozess mit aus ihm selbst hervorgegangenen, fertig abreagierten Fermentationsbehältern erneut angeimpft werden kann und darf, bzw. wie oft neue Vorkulturen gezüchtet werden müssen, hängt von der genetischen Stabilität des verwendeten Organismus bzw. dem Auftreten unerwünschter genetischer Veränderungen ab (Mutationen, Rückmutationen, etc.).

Die mit Nährmedium befüllten und sterilen Fermentationsbehälter werden nun mit Fermentationsmedium aus der Schüttlerkultur oder aus einem fertig abreagierten (fermentierten) Fermentationsbehälter angeimpft. Dazu wird eine definierte Menge des Fermentationsmediums (typischerweise im Bereich einiger Mikroliter bis zu wenigen Millilitern) aus der Schüttlerkultur oder dem abreagierten Fermentationsbehälter aseptisch entnommen und den mit frischem Nährmedium befüllten, sterilen Fermentationsbehältern aseptisch zugegeben. Mit dem Fermentationsmedium einer Schüttlerkultur oder eines fermentierten Fermentationsbehälters können auf diese Weise viele mit frischem Nährmedium befüllte und sterile Fermentationsbehälter angeimpft werden. Dies kann manuell oder mit Hilfe entsprechender handelsüblicher Gerätschaften, z.B. Laborautosampler oder pharmazeutischer Abfüllmaschinen für Small-Volume-Parenterals erfolgen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Zelllinien und Hefen. Die Art der gewählten Mikroorganismen richtet sich nach dem durch Biosynthese zu synthetisierenden Biomolekül.

Bevorzugt handelt es sich bei dem zu synthetisierenden Biomolekül um ein Peptid oder Protein, welches ggf. posttranslational modifiziert sein kann. Zu dessen Expression werden bevorzugt gentechnisch manipulierte Bakterien, Zelllinien oder Hefen eingesetzt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei den Mikroorganismen um Bakterien, welche rekombinante SP-C-Inclusion Bodies herstellen. Bei SP-C handelt es sich um Surfactant-Protein C, ein Polypeptid, welches u.a. zur Behandlung des Atemnotsyndroms von Frühgeborenen und Erwachsenen geeignet ist. In diesem Zusammenhang kann beispielsweise verwiesen werden auf DE-A 44 18 936 und A. ten Brinke et al., Biochim Biophys Acta. 2002, 1583(3):253-65.

Nach der Beimpfung erfolgt in den Fermentationsbehältern die Biosynthese der Biomoleküle durch die Mikroorganismen. Dazu werden in Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Fermentationsbehälter in ein Fermentationsbad eingebracht, in welchem ein Gas oder Gasgemisch gelöst ist. Vorzugsweise wird das Fermentationsbad mit einem Gas oder Gasgemisch durchsprudelt (Begasungswanne). Unter diesen Bedingungen wachsen die Mikroorganismen, vermehren sich und produzieren das gewünschte Biomolekül durch Biosynthese.

Es können mehrere Fermentationsbehälter gleichzeitig in das Fermentationsbad eingebracht werden. Alternativ können die Fermentationsbehälter nacheinander in das Fermentationsbad eingebracht werden. Bevorzugt befinden sich zu einem gegebenen Zeitpunkt mehrere Fermentationsbehälter im Fermentationsbad, andere Fermentationsbehälter noch nicht und wiederum andere Fermentationsbehälter nicht mehr im Fermentationsbad.

Die Begasungswannen sind vorzugsweise mit einer Flüssigkeit gefüllt (Fermentationsbad), in der sich das Gas oder Gasgemisch lösen kann, mit dem die Begasungswannen begast werden. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Wasser, um eine wässrige Lösung oder um einen Halogenkohlenwasserstoff, insbesondere Perfluorkohlenwasserstoff, z.B. Perflubron. Aus der Flüssigkeit, in welcher das Gas bzw. Gasgemisch gelöst ist und welches vorzugsweise ferner mit Gasbläschen durchsprudelt wird, findet zwar auch ein direkter Übertritt von Gasblasen in das Innere des Fermentationsbehälters statt, aber der überwiegende Teil des Übertritts findet von der Flüssigkeitsphase zum Fermentationsbehälter statt. Der größte Teil der für den Gasaustausch zum Fermentationsbehälter zur Verfügung stehenden Gase ist in der Flüssigkeit gelöst.

Die Begasung der Fermentationsbehälter in einer Flüssigkeit hat gegenüber der direkten Begasung mit Gas in gasförmiger Umgebung u.a. den Vorteil, dass sich in der Flüssigkeit Gasblasen ausbilden, welche infolge ihres Auftriebs sehr schonend für Verwirbelungen des Fermentationsmediums innerhalb der Fermentationsbehälter sorgen. Darüber hinaus lässt sich eine Flüssigkeit besser temperieren als ein Gas und kann ferner zur Übertragung mechanischer Impulse (Vibrationen, Ultraschall, etc.) genutzt werden.

Auch kann der Gasübertritt von der Flüssigphase in den Fermentationsbehälter besser erfolgen als ein Übertritt von der Gasphase in den Fermentationsbehälter. Gerade bei anaerober Fermentation mit Inertgas als Begasungsmedium (N₂, He, Ar, etc.) ist die Personalsicherheit einer mit Flüssigkeit befüllten Begasungswanne leichter zu gewährleisten als die einer mit Gas gefüllten Kammer. Zusätzlich lässt sich eine Begasungswanne viel besser von gelöstem Sauerstoff befreien als eine mit Gas befüllte Kammer. Der Inertgasstrom dient zusätzlich dazu, ggf. Substanzen auszutragen, welche für die Mikroorganismen toxisch sind, z.B. Sauerstoff (anaerobe Fermentation), Schwefelwasserstoff, Methan und andere Kohlenwasserstoffe, flüchtige Amine, etc. Schließlich kann die Fermentationsströmung dazu verwendet werden, die Fermentationsbehälter ein- und auszutragen.

Die Fermentationsbehälter werden vorzugsweise vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht. Es ist jedoch auch möglich, die Fermentationsbehälter nur teilweise einzutauchen.

Handelt es sich bei den Mikroorganismen um solche, bei denen die Biosynthese unter anaeroben Bedingungen erfolgt, so handelt es sich bei dem Gas bzw. dem Gasgemisch vorzugsweise um ein Inertgas, wie z.B. Stickstoff bzw. um ein stickstoffhaltiges Gasgemisch. Handelt es sich bei den Mikroorganismen um solche, bei denen die Biosynthese unter aeroben Bedingungen abläuft, so handelt es sich bei dem Gas bzw. Gasgemisch vorzugsweise um Sauerstoff bzw. um ein sauerstoffhaltiges Gemisch, wie Luft.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens steht in Schritt (e) das Gas oder Gasgemisch unter einem Druck, der größer als Atmosphärendruck ist. Beispielsweise kann das Gas oder Gasgemisch bei einem Überdruck von mindestens 0,1 bar, bevorzugter mindestens 0,2 bar, noch bevorzugter mindestens 0,3 bar, am bevorzugtesten mindestens 0,4 bar und insbesondere mindestens 0,5 bar in den Fermentationsbehälter eingebracht werden, wodurch der Gasaustausch durch die Außenwand des Fermentationsbehälters verbessert werden kann. Der Überdruck ist dabei bezogen auf den Umgebungsdruck der Atmosphäre, üblicherweise 1,0 bar (1013 hPa). Bei den genannten Drücken handelt es sich um Gasvordrücke in der Zufuhrleitung, wobei der minimale Gasdruck nicht notwendigerweise mindestens 0,1 bar Überdruck sein muss.

Der minimale aussetzende Überdruck errechnet sich aus der Füllhöhe der Fermentationswanne (Dichte des Füllmediums Füllhöhe) und wird darüber hinaus bestimmt von den Strömungswiderständen in den Gaszuleitungen und Gasverteilungseinrichtungen, sowie von der gewünschten Begasungsrate (in m³/min). Bevorzugt ist der Druck beim Einblasen größer als die Summe aus Umgebungsluftdruck und hydrostatischem Druck in der Fermentationswanne (Dichte Füllhöhe).

Die Begasungswanne ist in diesem Fall vorzugsweise als Druckgefäß ausgebildet. Der Gasaustausch zwischen dem Fermentationsbad außerhalb des Fermentationsbehälters und dem Innern des Fermentationsbehälters, d.h. dem Fermentationsmedium, erfolgt bevorzugt hauptsächlich durch Gas, welches im gelösten Zustand im Fermentationsbad vorliegt. Ein direkter Gasaustausch, d.h. ein Transport von Gasmolekülen in gasförmigem, ungelöstem Zustand durch die Außenwand des Fermentationsbehälters hindurch, findet zwar statt, spielt jedoch eine nur untergeordnete Rolle.

Vorzugsweise wird das Gas oder das Gasgemisch auf der Unterseite des Fermentationsbehälters über geeignete Einlassdüsen in das Fermentationsbad eingeblasen, so dass sich das Gas bzw. Gasgemisch einerseits im Fermentationsbad löst, andererseits auch in Form kleiner Bläschen im Fermentationsbad aufsteigt und dabei die im Fermentationsbad befindlichen Fermentationsbehälter umsprudelt. Da die Außenseite der Fermentationsbehälter zumindest in Teilbereichen gasdurchlässig ist, nehmen die Fermentationsbehälter einen Teil, insbesondere des gelösten Gases bzw. des Gasgemisches aus dem Fermentationsbad auf.

Je nach Gasdurchlässigkeit des zur Herstellung der Fermentationsbehälter verwendeten Materials kann der Gasaustausch mit der Umgebung, d.h. mit dem Fermentationsbad, mehr oder weniger stark ausgeprägt sein. Der überwiegende Teil des Gasaustauschs findet in gelöster Form der Gase statt. Dies macht den Austausch auch effektiver, als bei einem zusätzlichen Übertritt von der Flüssigphase zur Gasphase und umgekehrt.

Beim aeroben Prozess erfolgt ein Gastransport des Sauerstoffs von der Gasblase durch die Grenzfläche in das Füllmedium der Begasungswanne (Fermentationsbad), von dort bis in die Nähe der Oberfläche des Fermentationsbehälters, durch die Grenzfläche des Füllmediums des Fermentationsbads in das permeable Material der Wand des Fermentationsbehälters, von der Außen- zur Innenseite der Wand des Fermentationsbehälters, von der Innenseite der Wand durch die Grenzfläche des Nähr- bzw. Fermentationsmediums, durch das Nähr- bzw. Fermentationsmedium bis zum Mikroorganismus und schließlich durch dessen Zellmembran hindurch. Der Stofftransport der Abgase (CO₂, CH₄, H₂S, Amine, etc.) erfolgt in umgekehrter Reihenfolge.

In einer bevorzugten Ausführungsform passieren gelöste Gase die Außenwand des Fermentationsbehälters und gehen im Innern des Fermentationsbehälters in den gasförmigen Zustand über, so dass sich auch im Inneren der Fermentationsbehälter Gasbläschen bilden. Die innerhalb der Fermentationsbehälter befindlichen und darin aufsteigenden Gasbläschen sorgen infolge ihres Auftriebs für Verwirbelungen des Fermentationsmediums, so dass ein Absetzen der in den Fermentationsbehältern befindlichen Mikroorganismen verhindert und ein intensiver Stoffaustausch gewährleistet wird.

Auf starke Rührwerke kann daher verzichtet werden, so dass auch keine großen Scherkräfte auftreten. Da sich die Mikroorganismen innerhalb der Fermentationsbehälter und vorzugsweise nicht im Fermentationsbad befinden, ist es jedoch auch möglich, zur Verbesserung des Stofftransports innerhalb des Fermentationsbads dieses durch Eintrag kinetischer Energie zu verwirbeln. Eventuelle dabei auftretende Scherkräfte sind für die Mikroorganismen vergleichsweise unschädlich, da diese durch die Außenwand der Fermentationsbehälter ausreichend geschützt werden. Große Scherkräfte treten vor allem auch deshalb nicht auf, weil die Mikroorganismen in den Fermentationsbehältern weitgehend vor äußeren Kräften in den Fermentationsbädern geschützt sind. Auf starke Rührwerke in den Fermentationsbädern möchte man nicht in jedem Fall verzichten, da der Rührenergieeintrag maßgeblich den Gasübergang von den Gasblasen in das Füllmedium des Fermentationsbads beeinflusst.

Zur Begasung weisen die Begasungswannen eine Vorrichtung auf, mit deren Hilfe die Begasung erfolgt. Zum Gaseintrag können dienen: ein einfaches Tauchrohr mit zusätzlicher mechanischer Vorrichtung zur Verwirbelung der Gasblasen oder ein Tauchrohr mit vielen feinen Bohrungen, ein sog. „Begasungsring" (d. h. ein ringförmiges Rohr mit vielen feinen Bohrungen), ein Begasungsteller oder aus feinporigen Werkstoffen hergestellte Gaseinleitungs- und Verteilungsvorrichtungen. Als feinporige Werkstoffe kommen beispielsweise Sinterstahl, (Sinter-)Kunststoffe, gelochte Gummimembranen (z.B. bei sich selbst verschließenden Begasungstellern), Filtermembranwerkstoffe, etc. in Betracht.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Schritt (e) das Fermentationsbad temperiert. Die Temperierung kann durch geeignete Heiz- oder Kühlelemente erfolgen. Üblicherweise wird eine Temperatur im Bereich von 20 bis 60 °C, vorzugsweise 30 bis 40 °C, eingestellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Flüssigkeit in der Begasungswanne, d.h. das Fermentationsbad, bewegt und vermischt, um die Diffusionsstrecken für die Gase in der Flüssigkeit möglichst kurz zu halten. Die Vermischung kann durch Rührer oder Pumpen erfolgen. Bevorzugt können die Fermentationsbehälter und das darin enthaltene Fermentationsmedium durch Druckschwankungen, Bewegungen der Wannenflüssigkeit und/oder durch Vibrationen in Bewegung gehalten werden, um den Stofftransport und die Diffusion im Fermentationsbad und im Fermentationsmedium zu fördern.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt (e) das Fermentationsbad mit Ultraschall beschallt. Die verwendeten Frequenzen liegen bevorzugt im Bereich von 20 bis 120 kHz. Der typische Energieeintrag sollte im Rahmen des Eintrags bei typischen Laborultraschallwannen liegen. Zu wenig Energieeintrag führt dazu, dass die Energie durch die Fermentationsbehälter absorbiert wird und zu wenig im Nähr- bzw. Fermentationsmedium ankommt. Zu viel Energie würde die Zellen zerstören. Eine genaue Festlegung kann ein Fachmann abhängig von der Größe und Geometrie der Behälter und der Anlage treffen.

Die Beschallung mit Ultraschall hat den Vorteil, dass ein Absetzen der Mikroorganismen und der ggf. im Fermentationsmedium suspendierten Partikel wirksam verhindert wird, so dass eine möglichst homogene Verteilung gewährleistet wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfndungsgemäßen Verfahrens enthält das Fermentationsbad neben dem Gas oder Gasgemisch zumindest eine Substanz, welche von den Mikroorganismen für die Biosynthese benötigt wird und für welche die Außenwand der Fermentationsbehälter zumindest in einem Teilbereich durchlässig ist. In diesem Fall erfolgt der Stofftransport der Substanz durch die Außenwand der Fermentationsbehälter durch Diffusion (Osmose). Da die Mikroorganismen innerhalb der Fermentationsbehälter diese Substanz kontinuierlich verbrauchen, wird das Gefälle des chemischen Potentials der Substanz zwischen Fermentationsmedium und Fermentationsbad kontinuierlich aufrecht erhalten. Bevorzugt handelt es sich bei der Substanz um ein Molekül eines relativ geringen Molekulargewichts. Bevorzugt liegt das Molekulargewicht der Substanz unterhalb von 5.000 g/mol, bevorzugter unterhalb von 2.500 g/mol und insbesondere unterhalb von 1.000 g/mol.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens synthetisieren die Mikroorganismen durch Biosynthese ein Biomolekül, für welches die Außenwand des Fermentationsbehälters undurchlässig ist. Auf diese Weise wird das synthetisierte Biomolekül in den Fermentationsbehältern zurückgehalten. Eine Isolierung erfolgt erst nach Beendigung des Prozesses zur Biosynthese eines Biomoleküls und Entleerung der Fermentationsbehälter. Grundsätzlich ist es aber auch denkbar, dass die Außenwand der Fermentationsbehälter für das synthetisierte Biomolekül durchlässig ist, so dass dieses nicht nur aus dem Fermentationsmedium im Innern der Fermentationsbehälter, sondern aus der Flüssigkeit des Fermentationsbads isoliert werden kann.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Fermentationsbehälter zur Durchführung von Schritt (e) in einer Haltevorrichtung fixiert, welche die Fermentationsbehälter gleichmäßig am Stoffübergang (Gasaustausch) teilnehmen lässt oder welche die definierte Entnahme und Identifizierung der einzelnen Fermentationsbehälter in der Wanne, z.B. bei der Entnahme erleichtert. Zu diesem Zweck kann die Haltevorrichtung mit einer Beschriftung, z.B. einer Nummerierung, versehen sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Begasungswanne ein Transportsystem auf, an welchem die Fermentationsbehälter befestigt sind und mit dem die Fermentationsbehälter durch die Begasungswanne transportiert werden. Es ist möglich, dass mehrere Begasungswannen hintereinander durchlaufen werden, so dass das Transportsystem die einzelnen Fermentationsbehälter von Begasungswanne zu Begasungswanne befördert. Zwischen den einzelnen Begasungswannen können verschiedene Prozesse zur Steuerung des mikrobiellen Wachstums, der Expression und Produktion des gewünschten Biomoleküls ablaufen, beispielsweise die Zugabe von Starter-, Steuer- oder Botenstoffen, das Nachfüllen von Nährmedium, etc.

Bevorzugt werden die Fermentationsbehälter in dem Fermentationsbad solange inkubiert, bis die Biosynthese zu einem gewissen Mindestumsatz des Biomoleküls geführt hat und die zugeführten Nährstoffe weitgehend verbraucht sind. Die Dauer, welche erforderlich ist, um unter den gewählten Bedingungen einen bestimmten Umsatz zu erreichen, kann durch einfache Vorversuche ermittelt werden. Die Entnahme der Fermentationsbehälter kann somit zeit- oder fortschrittgesteuert erfolgen, wobei der Fortschritt der Biosynthese auch in regelmäßigen Intervallen durch Zelldichtemessungen überprüft werden kann. Es kann, falls der Prozess es erfordert, auch eine Entnahme der Fermentationsbehälter aus dem Fermentationsbad zum Zwecke einer Nachbeimpfung erfolgen. Diese kann mit Nährmedium und/oder mit bestimmten Substanzen zur Steuerung, zur Induktion oder zum Abbruch bestimmter Phasen des Wachstums und der Produktion der Mikroorganismen notwendig sein.

Danach werden die Fermentationsbehälter ggf. in Schritt (f) aus dem Fermentationsbad entfernt. Vorzugsweise werden sie von außen gereinigt und einer automatischen oder visuellen Inspektion unterzogen.

Einzelne der entnommenen Fermentationsbehälter können für Schritt (d), d.h. zum Animpfen frischer, mit Nährmedium befüllter Fermentationsbehälter genutzt werden.

Die übrigen Fermentationsbehälter können anschließend geöffnet werden, z.B. durch Entfernung von Verschlusskappen oder Stopfen. Anschließend wird der Inhalt zur weiteren Verarbeitung, z.B. Homogenisierung und Separation der Zellen entleert. Das durch Biosynthese erhaltene Biomolekül kann danach durch geeignete Verfahren isoliert werden, beispielsweise durch Extraktion, Kristallisation, Zentrifugation oder chromatographische Verfahren, wie z.B. durch Affinitätschromatographie. Geeignete Verfahren, welche insbesondere von der Art des synthetisierten Biomoleküls abhängen, sind dem Fachmann bekannt. In diesem Zusammenhang kann beispielsweise verwiesen werden auf H. Schott, Affinity Chromatography: Template Chromaoography of Nucleic Acids and Proteins (Chromatographic Science), Marcel Dekker (1984); R.K. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer; 3 ed. (1993); S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford University Press; 2nd ed. (2001); und H. Ahmed, Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization, CRC Press (2004).

Falls das durch Biosynthese erhaltene Biomolekül nicht zu empfindlich ist, können die Fermentationsbehälter vor der Entleerung und der weiteren Verarbeitung sterilisiert werden.

Ist das Biomolekül hingegen zu empfindlich, werden die Fermentationsbehälter vorzugsweise zunächst unter entsprechenden aseptischen Bedingungen geöffnet, entleert und anschließend die entleerten Fermentationsbehälter sterilisiert und danach gereinigt, oder umgekehrt.

Schritte (b), (c) und (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens sind optional, Schritte (a), (d) und (e) obligatorisch. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren neben den Schritten (a), (d) und (e) zumindest einen, vorzugsweise zumindest zwei der optionalen Schritte (b), (c) und (f). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren alle Schritte (a), (b), (c), (d), (e) und (f), vorzugsweise in dieser Reihenfolge.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Volumen der Fermentationsbehälter typischerweise im Bereich von 1 ml bis 10 l. Bevorzugt beträgt das Volumen der Fermentationsbehälter jeweils höchstens 10.000 ml, bevorzugt höchstens 1.000 ml, bevorzugter höchstens 800 ml, noch bevorzugter höchstens 600 ml, am bevorzugtesten höchstens 500 ml und insbesondere höchstens 400 ml.

Auf diese Weise wird gewährleistet, dass ein Ansatz von mehreren hundert oder tausend Litern auf eine ausreichend große Anzahl von Kompartimenten aufgeteilt wird, wodurch sich das Risiko der Kontamination des gesamten Ansatzes deutlich verringert.

Fermentationsbehälter, welche eine Kontamination aufweisen, können in der Regel an einer Verfärbung des Fermentationsmediums erkannt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Außenwand der Fermentationsbehälter zumindest in einem Teilbereich aus einem transparenten Material gefertigt, so dass eine derartige Verfärbung des Fermentationsmediums durch einfache Sichtkontrolle festgestellt und entsprechend verfärbte, d.h. kontaminierte Fermentationsbehälter aussortiert werden können.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden entleerte Fermentationsbehälter in einem optionalen Schritt (g) wiederverwertet.

Dazu werden sie, soweit erforderlich, nach der Entleerung des Fermentationsmediums mitsamt dem synthetisierten Biomolekül und den Mikroorganismen mit gängigen Reinigungsverfahren gewaschen, beispielsweise mit heißem, gereinigtem Wasser (nach europäischem Arzneibuch), welches mit Hilfe einer Düse in den Innenraum der Fermentationsbehälter gesprüht wird und über eine Öffnung ablaufen kann. Nach dem Reinigen der Fermentationsbehälter kann ein Trockenschritt erfolgen, z.B. mit Hilfe eingeblasener, filtrierter Luft.

Anschließend ist es möglich, die leeren, ggf. gereinigten und getrockneten Fermentationsbehälter einer Sterilisation zu unterziehen. Dazu stehen die entsprechenden Standardverfahren zur Verfügung, wie sie vorstehend bereits im Zusammenhang mit Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben wurden.

Zur Vermeidung von Kontaminationen, Undichtigkeiten und Problemen im späteren Prozess ist es zu empfehlen, die entleerten Fermentationsbehälter vor dem erneuten Einsatz einer Inspektion auf Beschädigungen und Materialermüdung zu unterziehen. Bevorzugt erfolgt daher abschließend eine optische Überprüfung der leeren Fermentationsbehälter auf Beschädigungen und Undichtigkeiten.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird es semi-kontinuierlich durchgeführt, was auf verschiedene Weise verwirklicht werden kann. Ein semi-kontinuierliches Verfahren im Sinne der Beschreibung umfasst ein Verfahren, bei dem aus der Vielzahl der in Schritt (a) befüllten Fermentationsbehälter wenigstens zwei Fermentationsbehälter zeitlich nacheinander der Inkubation in Schritt (e) unterzogen werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des semi-kontinuierlich geführten erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Gesamtheit aller Fermentationsbehälter zu einem gegebenen Zeitpunkt in wenigstens drei Gruppen aufgeteilt werden:

(i) leere Fermentationsbehälter;
(ii) mit Nährmedium befüllte, jedoch noch nicht mit Mikroorganismen angeimpfte Fermentationsbehälter;
(iii) mit Fermentationsmedium befüllte, d.h. mit Nährmedium befüllte und auch bereits mit Mikroorganismen angeimpfte Fermentationsbehälter.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des vorzugsweise semi-kontinuierlich geführten, erfindungsgemäßen Verfahrens werden zu einem gegebenen Zeitpunkt wenigstens N Fermentationsbehälter in N verschiedenen Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt, wobei die N verschiedenen Schritte ausgewählt sind aus Schritten (a), (b), (c), (d), (e) und (f), und wobei N 2, 3, 4, 5 oder 6 sein kann.

1 zeigt eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die leeren, ggf. gereinigten und ggf. sterilisierten Fermentationsbehälter werden in Schritt (a) mit Nährmedium befüllt, in Schritt (b) verschlossen und ggf. in Schritt (c) sterilisiert. Die auf diese Weise vorbereiteten Fermentationsbehälter werden anschließend in Schritt (d) mit Mikroorganismen, welche durch ein Oval angedeutet sind, angeimpft. In Schritt (e) erfolgte die Vermehrung der Mikroorganismen und die Biosynthese des gewünschten Biomoleküls (nicht dargestellt) in einer Begasungswanne. In Schritt (f) werden die fertig abreagierten (fermentierten) Fermentationsbehälter geöffnet und die Mikroorganismen zusammen mit dem synthetisierten Biomolekül entnommen. Abschließend werden die verwendeten Fermentationsbehälter in Schritt (g), ggf. nach Reinigung, Trocknung und/oder Sterilisation dem Ausgangspunkt des Verfahrens wieder zugeführt. Ein Teil der Mikroorganismen aus fermentierten Fermentationsbehältern wird in den Prozess zurückgeführt und dient der (erneuten) Animpfung in Schritt (d).
2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Schritte (e) und (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Fermentationsbehälter (1) sind mit Hilfe geeigneter äußerer Befestigungsmittel (2) an einer Transportvorrichtung (3) befestigt und werden in Pfeilrichtung bewegt. Parallel zur Förderrichtung der Transportvorrichtung (3) ist eine Begasungswanne (4) angeordnet, welche mit einem Fermentationsbad (5) befüllt ist und eine Begasungsvorrichtung (6) aufweist, über die Luft bzw. Sauerstoff in die Begasungswanne (4), d.h. in das Fermentationsbad (5) eingeblasen wird. Die Luft- bzw. Sauerstoffblasen steigen innerhalb der Begasungswanne (4) in Richtung der Pfeile (7) im Fermentationsbad (5) auf. Anstelle von Sauerstoff kann auch Inertgas (z.B. He, Ar, N₂, etc.) oder CO₂ oder andere Gase bzw. deren Gemische verwendet werden, je nach Anforderungen des jeweiligen Fermentationsprozesses (aerob vs. anaerob). Im Laufe der Beförderung der Fermentationsbehälter (1) mit Hilfe der Transportvorrichtung (3) werden die einzelnen Fermentationsbehälter (1) in das Fermentationsbad (5) eingetaucht und auf diese Weise begast. Nach einer gewissen Dauer, welche von der Länge der Begasungswanne (4) und der Geschwindigkeit der Transportvorrichtung (3) abhängig ist, werden die Fermentationsbehälter (1) wieder aus dem Fermentationsbad (5) in der Begasungswanne (4) entfernt. Ein Fachmann erkennt, dass im Anschluss weitere Begasungswannen von der Transportvorrichtung (3) angesteuert werden können und zwischenzeitlich die Fermentationsbehälter bestimmten Verfahrensschritten zugeführt werden können, wie Nachfüllen von Nährmedium, Kontrolle des Wachstums der Mikroorganismen, partielle Entnahme des zu synthetisierenden Biomoleküls, Kontrolle auf Kontaminationen, etc.
Das erfindungsgemäße, vorzugsweise semi-kontinuierliche Verfahren kann ferner durch folgende Merkmale gekennzeichnet sein:

– der Inhalt der Fermentationswanne (das Fermentationsbad) kann umgepumpt werden;
– das Fermentationsbad kann beim Umpumpen filtriert werden, um die Keimbelastung zu reduzieren bzw. zu kontrollieren;
– das Fermentationsbad kann beim Umpumpen im Durchlauf sterilisiert oder keimreduziert werden; geeignete Verfahren dazu sind dem Fachmann bekannt (Hitzesterilisation, Pasteurisierung, UV-Sterilisation, Sterilisation mit ionisierender Strahlung);
– das Fermentationsbad kann beim Umpumpen filtriert oder ultrafiltriert werden, um Feststoffe, Ausfällungen und unerwünschte Stoffe, z.B. Endotoxine, zu entfernen;
– das Fermentationsbad kann zur Entfernung von H₂S (z.B. bei der anaeroben Fermentation) ein gelöstes Metallsalz enthalten, dessen Kation schwerlösliche Sulfide bildet (z.B. CoCl₂, FeCl₂); die entstehenden Ausfällungen können abfiltriert und entfernt werden; auf diese Weise wird kontinuierlich ein hohes Konzentrationsgefälle an H₂S zwischen Fermentationsbehälter und Fermentationsbad aufrecht erhalten, so dass eine kontinuierliche Diffusion und Entfernung von H₂S aus dem Fermentationsbehälter erreicht werden kann;
– das Fermentationsbad kann weitere Substanzen gelöst enthalten, welche mit unerwünschten Substanzen schwerlösliche Niederschläge bilden, die dann abfiltriert werden können; und/oder
– das Fermentationsbad kann beim Umpumpen durch eine gefüllte Säule oder Schüttung gepumpt werden, um bestimmte unerwünschte Substanzen zu entfernen; hierzu sollte die Säulenfüllung bzw. die Schüttung ein immobilisiertes Material enthalten, welches eine Affinität zu der zu entfernenden Substanz aufweist bzw. mit diesem chemisch reagiert; die Füllung bzw. Schüttung kann regelmäßig erneuert werden (z.B. kann eine entsprechende Füllung aus gesintertem reinem Eisen zur Entfernung von H₂S verwendet werden – an der Oberfläche der Eisenkörner bildet sich Eisensulfid).

Das erfindungsgemäße Verfahren hat sowohl ökologisch als auch aus ökonomisch Vorteile, insbesondere wenn man die Anforderungen berücksichtigt, welche an Reinräume für die pharmazeutische Produktion gestellt werden. Der Bau und der Betrieb von Reinräumen für die pharmazeutische Produktion ist kostenintensiv. Die Kosten steigen typischerweise fast linear mit dem umbauten Reinraumvolumen an.
Bei Reinräumen für die pharmazeutische Produktion steht der Schutz des Produktes vor äußeren Verunreinigungen im Vordergrund. Deshalb weisen solche Reinräume typischerweise einen Überdruck gegenüber den umgebenden Räumen auf.
Aus Gründen des Schutzes der Umwelt und des Menschen vor Kontamination mit gentechnisch veränderten Mikroorganismen gibt es Bestrebungen, die Fermentationsräume gegenüber der Umwelt mit Unterdruck zu versehen.
Beide Konzepte – Überdruck einerseits und Unterdruck andererseits – lassen sich jedoch nur sehr aufwendig miteinander vereinbaren, was letztendlich zu ineinander verschachtelten Reinraumkonzepten mit unterschiedlichen Druckniveaus führt.
Solche Reinraumkonzepte treiben die Kosten für den Betrieb einer Produktion in Reinräumen noch weiter in die Höhe. Es besteht daher ein großer Bedarf an Konzepten, welche den Bedarf an Reinraumvolumina möglichst minimieren.
Es wurde überraschend gefunden, dass das der Erfindung zugrundeliegende Konzept die Minimierung der Reinraumvolumina und die teilweise Trennung von Reinräumen mit Überdruck- und Unterdruckkonzept erlaubt, so dass auf eine Verschachtelung weitgehend verzichtet werden kann.
Beim Betrieb eines herkömmlichen Fermentationskessels werden praktisch alle Prozessschritte an einem Ort, üblicherweise in einem Raum durchgeführt. Der Raumbedarf ist damit hoch und erfordert deshalb einen vergleichsweise großen Reinraum. Sowohl Produktschutz als auch Schutz der Umwelt müssen dann für diesen Raum gewährleistet werden.
Im Unterschied dazu kann das erfindungsgemäße Verfahren semi-kontinuierlich und daher an verschiedenen Orten bzw. Räumen mit dafür individuell an das Reinraumkonzept angepassten Bedingungen durchgeführt werden, was das Reinraumkonzept insgesamt vereinfacht und die Kosten reduziert.
Bei der Befüllung der Fermentationsbehälter (Schritt (a)) muss nur der Schutz des Produktes berücksichtigt werden. Da die einzelnen Fermentationsbehälter vergleichsweise klein sind, reicht ein kleiner Reinraumbereich aus, z.B. ein Isolator.
Für die Animpfung der Fermentationsbehälter (Schritt (d)) muss der Schutz sowohl des Produktes als auch der Umwelt berücksichtigt werden. Aufgrund der geringen Größe der Fermentationsbehälter genügt auch hier ein vergleichsweise kleiner Reinraumbereich, z.B. in der Größe eines Isolators.
Alle Transporte, Zwischenlagerungen und vor allem die Fermentation selbst (Schritt (e)) finden in geschlossenen Systemen statt, so dass ein spezielles Reinraumkonzept nicht erforderlich ist. Gefahren durch eventuelle Undichtigkeiten von Fermentationsbehältern kann durch Zugabe von Bioziden in das Fermentationsbad begegnet werden.
Für die Entleerung der Fermentationsbehälter (Schritt (f)) muss der Schutz des Produktes und – falls eine vorherige Sterilisation nicht möglich ist – auch der Schutz der Umwelt berücksichtigt werden. Aufgrund der geringen Größe der Fermentationsbehälter genügt hier wiederum ein minimaler Reinraumbereich, z.B. in der Größe eines Isolators.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Fermentationsbehälter, welcher vorteilhaft in dem vorstehend beschriebenen Verfahren eingesetzt werden kann. Der erfindungsgemäße Fermentationsbehälter umfasst

– eine Außenwand, welche für Mikroorganismen undurchlässig, jedoch zumindest in einem Teilbereich gasdurchlässig, vorzugsweise sauerstoffdurchlässig, ist;
– eine verschließbare Befüllöffnung; und
– ggf. eine Vorrichtung zur aseptischen Zugabe einer festen oder flüssigen Zusammensetzung; wobei das Verhältnis der äußeren Oberfläche des Fermentationsbehälters zu seinem Innenvolumen mindestens 0,5 cm²/ml, bevorzugt mindestens 1,0 cm²/ml, bevorzugter mindestens 2,5 cm²/ml, noch bevorzugter mindestens 4,0 cm²/ml, am bevorzugtesten mindestens 5,0 cm²/ml und insbesondere mindestens 6,0 cm²/ml beträgt.

Fermentationsbehälter verschiedener Bauart sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise offenbart US 5,686,304 einen Beutel mit dünnen, gasdurchlässigen Außenwänden aus Silikonkautschuk.
Die Fermentationsbehälter des Standes der Technik haben jedoch den Nachteil, dass der Gasaustausch zwischen dem Fermentationsmedium und der Umgebung nicht optimal ist, wodurch die Bedingungen für die Biosynthese beeinträchtigt werden können. Zur Erreichung eines möglichst hohen Oberflächen/Volumen-Verhältnisses müssen die Fermentationsbehälter des Standes der Technik praktisch gasfrei befüllt werden. Um die Schichtdicken des Nähr- bzw. Fermentationsmediums innerhalb der Fermentationsbehälter niedrig zu halten, darf das Füllvolumen bei flexiblen Beuteln nur einen Bruchteil der maximalen Füllkapazität betragen, welche bei kompletter Ausbauchung des Beutels erreicht werden könnte.
Die Fermentationsbehälter des Standes der Technik bauchen aus. Das Ausbauchen erfolgt insbesondere mit zunehmender Beutelgröße in zunehmendem Maße undefiniert. Für industrielle Prozesse sind aus ökonomischen Gründen Füllmengen über 200 ml zu bevorzugen. Die undefinierten Verformungen führen zu ungleichmäßigen Wachstumsbedingungen. Diese wiederum bedeuten Nachteile in der Verwendung der Fermentationsbehälter für einen standardisierten, sich wiederholenden, industriellen Prozess. Die Fermentationsbehälter des Standes der Technik sind deshalb zwar für Laborexperimente, jedoch für einen semi-kontinuierlichen industriellen Prozess nur bedingt geeignet.
Es wurde überraschend gefunden, dass sich die Bedingungen für die Biosynthese innerhalb des Fermentationsbehälters verbessern lassen, wenn die äußere Oberfläche des Fermentationsbehälters zu seinem Innenvolumen in einem bestimmten Verhältnis steht. Dieses Verhältnis kann einen signifikanten Einfluss auf den Verlauf der Biosynthese haben.
Einerseits ist der Stoffaustausch umso besser, je größer das Verhältnis ist.
Andererseits gilt jedoch: je kleiner das Verhältnis ist, desto kompakter sind die einzelnen Fermentationsbehälter, desto einfacher ist die Handhabung, desto leichter ist es, Bereiche mit sich direkt berührenden Behälterwandungen (Zusammenklappen) zu vermeiden, desto weniger Behältermaterial wird benötigt und desto kostengünstiger sind die Fermentationsbehälter.
Für die jeweiligen Rahmenbedingungen gibt es daher ein Optimum, zwischen den Anforderungen an den Stoffaustausch, der technischen Handhabbarkeit und den Behälterkosten. Dieses Optimum wird auch von den Eigenschaften des Behältermaterials und den möglichen maximalen Partialdruckdifferenzen an gelösten Gasen zwischen der Füllung der Fermentationswanne und dem Inhalt des Fermentationsbehälters beeinflusst.
Bei einer Schichtdicke des Behältermaterials (Außenwand) von etwa 50 bis 150 μm, ausgehend von einem Fermentationsbehälter mit zwischen 50 und 1.000 ml Füllvolumen, hergestellt aus Polymermaterial (Polysiloxanfolie) mit mittlerer Festigkeit, bei einer Sauerstoffpartialdruckdifferenz (gelöst) von ca. 150 bis 200 mbar, sollte das optimale Oberflächen/Volumen-Verhältnis zwischen 0,01 cm²/ml und 5,0 cm²/ml, bevorzugt zwischen 0,025 und 2,5 cm²/ml, noch bevorzugter zwischen 0,1 und 1,0 cm²/ml liegen.
Bevorzugt ist der erfindungsgemäße Fermentationsbehälter derart ausgerüstet, dass er vorteilhaft zum Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters sind daher auch bereits vorstehend im Zusammenhang mit der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutert worden (z.B. hinsichtlich des Volumens).
Der erfindungsgemäße Fermentationsbehälter weist eine Außenwand auf, welche für Mikroorganismen undurchlässig, jedoch zumindest in einem Teilbereich gasdurchlässig, vorzugsweise sauerstoffdurchlässig, ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters weist die Außenwand zumindest in einem Teilbereich eine Sauerstoffpermeabilität von wenigstens 500 cm³m^–2d^–1bar^–1, bevorzugter wenigstens 600 cm³m^–2 d^–1bar^–1, noch bevorzugter wenigstens 750 cm³m^–2d^–1bar^–1, am bevorzugtesten wenigstens 1.000 cm³m^–2d^–1bar^–1 und insbesondere wenigstens 1.500 cm³m^–2d^–1bar^–1 auf. Geeignete Verfahren zur Bestimmung der Sauerstoffpermeabilität sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt erfolgt die Bestimmung der Sauerstoffpermeabilität gemäß DIN ISO 53 380, Teil 3.
Geeignete Materialien zur Herstellung gasdurchlässiger Membranen sind dem Fachmann bekannt. In diesem Zusammenhang kann beispielsweise verwiesen werden auf R.W. Baker, Membrane Technology and Applications, Wiley, 2nd ed., 2004; P.E. Odendaal et al., Water Treatment Membrane Processes, McGraw-Hill Professional, 1996; T. Melin et al., Membranverfahren, Springer, Berlin, 2003; K. Görner, Gasreinigung und Luftreinhaltung, Springer, 2001; R. Rautenbach et al., Membrane Processes, John Wiley & Sons, 1989; R.E. Kesting, Polymeric Gas Separation Membranes, Wiley-Interscience, 1993; und D.R. Paul et al., Polymeric Gas Separation Membranes, CRC Press, 1993.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters ist die Außenwand zumindest in einem Teilbereich aus einer Membran gefertigt, welche auf zumindest einem Polysiloxan basiert. Geeignete Silikonmembranen sind beispielsweise in US 3,489,647 , US 3,510,387 , US 3,969,240 und US 4,093,515 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt als Bestandteil der Beschreibung gilt.
Bevorzugt erstreckt sich der gasdurchlässige Teilbereich der Außenwand des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters über mindestens 50% der Fläche der Außenwand, bevorzugter mindestens 60%, noch bevorzugter mindestens 70%, am bevorzugtesten mindestens 80% und insbesondere mindestens 90% der Fläche der Außenwand.
Bevorzugt ist die Außenwand des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters zumindest in einem Teilbereich für CO₂, H₂S, CH₄ und/oder flüchtige Amine durchlässig. Flüchtige Amine im Sinne der Beschreibung sind vorzugsweise Amine, welche bei Atmosphärendruck einen Siedepunkt von weniger als 40°C aufweisen. Beispiele sind CH₃NH₂, (CH₃)₂NH, (CH₃)₃N und CH₃CH₂NH₂.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters weist die Außenwand zumindest in einem Teilbereich eine Dicke von höchstens 150 μm, bevorzugter höchstens 125 μm, noch bevorzugter höchstens 100 μm, am bevorzugtesten höchstens 75 μm und insbesondere höchstens 50 μm auf. Die Schichtdicke der Membran kann mit herkömmlichen Methoden bestimmt werden, vorzugsweise mikroskopisch.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist der erfindungsgemäße Fermentationsbehälter eine Vorrichtung zur aseptischen Zugabe der festen oder flüssigen Zusammensetzung auf. Geeignete Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise kann die Vorrichtung zum Zwecke der Zugabe mit einer Nadel oder einem Dorn durchstochen werden und sich nach dem Entfernen der Nadel oder des Dorns wieder selbsttätig verschließen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters ist die Außenwand zumindest in einem Teilbereich für Wasser, vorzugsweise für Wasser in flüssigem Zustand, durchlässig. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Außenwand des Fermentationsbehälters zumindest in einem Teilbereich durchlässig für gelöste Substanzen eines relativ geringen Molekulargewichts. In diesem Fall erfolgt der Stofftransport der gelösten Substanz durch die Außenwand des Fermentationsbehälters durch Diffusion (Osmose). Bevorzugt liegt das Grenz-Molekulargewicht einer Substanz, welche gerade noch durchgelassen wird (auch als "cut-off" bezeichnet), unterhalb von 10.000 g/mol, bevorzugter unterhalb von 5.000 g/mol, am bevorzugtesten unterhalb von 2.500 g/mol und insbesondere unterhalb von 1.000 g/mol.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters ist die Außenwand zumindest in einem Teilbereich für Wasser, vorzugsweise für Wasser in flüssigem Zustand, undurchlässig In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters weist er ein äußeres Befestigungsmittel auf. Das äußere Befestigungsmittel kann dazu verwendet werden, den erfindungsgemäßen Fermentationsbehälter an einer automatisierten Transportvorrichtung zu befestigen und beispielsweise im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen.
Bevorzugt weist der erfindungsgemäße Fermentationsbehälter in seinem Innern ein Mittel auf, an dem die Mikroorganismen immobilisiert werden, vorzugsweise adhärieren, können. Mittel und Oberflächen, welche zu diesem Zweck geeignet sind, hängen von der Art des verwendeten Mikroorganismus ab und sind dem Fachmann bekannt.
3 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters. Der Fermentationsbehälter weist eine Außenwand (8) auf, welche zumindest in Teilbereichen gasdurchlässig ist. Seitlich ist eine Vorrichtung (9) zur Zugabe fester Zusammensetzungen angeordnet, welche mit einem Schraubverschluss (10) verschlossen ist. Auf der Oberseite befindet sich eine Vorrichtung (11) zur aseptischen Zugabe einer flüssigen Zusammensetzung, welche zum Zwecke der Zugabe mit einer Nadel oder einem Dorn durchstochen werden kann und sich nach dem Entfernen der Nadel oder des Dorns wieder selbsttätig verschließt. Dazu weist die Vorrichtung (11) ein Septum (12) auf. Ferner befindet sich an der Oberseite eine Befestigungsvorrichtung (13) mit einer Öse (14), über welche der Fermentationsbehälter beispielsweise an einer Transportvorrichtung befestigt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters ist dieser sterilisierbar, d.h. er hält den Bedingungen stand, welche je nach Sterilisationsverfahren Anwendung finden. Der Behälter sollte vorzugsweise so ausgelegt sein, dass er mehrfach sterilisiert werden kann. Zur Verfügung stehende Sterilisationsverfahren: Hitze/Sattdampf, Hitze/trocken, Ethylenoxid-Begasung, Ozon-Begasung, UV-Bestrahlung, Ultraschall, Verwendung ionisierender Strahlung, γ-Strahlung, β-Strahlung.
Bevorzugt weist der erfindungsgemäße Fermentationsbehälter eine Formbeständigkeit auf, so dass er nach Befüllen mit einer Flüssigkeit seine ursprüngliche räumliche Ausdehnung im wesentlichen beibehält. Bevorzugt wird die Formbeständigkeit durch innere und/oder äußere Einbauten (Versteifungsmittel) erreicht.
Bevorzugt ist der erfindungsgemäße Fermentationsbehälter zu einem Beutel geformt. Ist der Fermentationsbehälter kein rigider Behälter, sondern ein flexibler Beutel, so enthält der Beutel bevorzugt innere und/oder äußere Einbauten (Versteifungsmittel), die dafür sorgen, dass die Schichtdicke des Nähr- bzw. Fermentationsmediums innerhalb des Fermentationsbehälters relativ konstant gehalten wird, wobei das Ausbauchen bzw. Zusammenklappen des Fermentationsbehälters verhindert wird. Auf diese Weise wird ermöglicht, dass möglichst große Teile der für die Diffusion (Stofftransport) vorbereiteten und bestimmten Behälteroberfläche am Stoffaustausch teilnimmt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Schichtdicke des Nähr- bzw. Fermentationsmediums definiert als die größte Ausdehnung des Fermentationsbehälters senkrecht zu seiner Haupterstreckungsebene.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Fermentationsbehälter derart beschaffen, dass die größte Ausdehnung senkrecht zu seiner Haupterstreckungsebene im entleerten Zustand durch das Befüllen des Fermentationsbehälters mit Nähr- bzw. Fermentationsmedium um höchstens 30%, bevorzugter höchstens 25%, noch bevorzugter höchstens 20%, am bevorzugtesten höchstens 15% und insbesondere höchstens 10% zunimmt. Diese Zunahme kann als Maß für das Ausbauchen des Fermentationsbehälters infolge der Befüllung angesehen werden, wobei die Ausdehnung bevorzugt jeweils im freien Zustand gemessen wird, d.h. nicht im in das Fermentationsbad eingetauchten Zustand.
Zur Verbesserung der mechanischen Festigkeit können die Membranen des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters mit geeigneten Verstärkungs- oder Versteifungsmitteln ausgerüstet sein, wie sie beispielsweise in US 4,093,515 beschrieben sind. Ferner kann der beschriebene Fermentationsbehälter folgende zusätzliche Merkmale aufweisen:

– weitere Anschlüsse zur sterilen/aseptischen Entnahme und Zugabe von Flüssigkeiten, bzw. Suspensionen, Emulsionen, Lösungen;
– Anschlüsse, die ein Umpumpen und ggf. Filtrieren des Inhalts erlauben.

Um eine optimale Gas- und Stoffdiffusion von der Behälterwandung zu den Mikroorganismen im Fermentationsmedium zu erreichen, ist es vorteilhaft, die mechanischen und geometrischen Eigenschaften des Fermentationsbehälters so zu wählen, dass die Schichtdicke des Nähr- bzw. Fermentationsmediums innerhalb des befüllten Fermentationsbehälters relativ konstant im Bereich einiger mm bis einiger cm zu halten.
Die einzustellende Schichtdicke variiert je nach Beutelfüllmenge, geometrischen Anforderungen (technische Handhabbarkeit der Fermentationsbehälter), erlaubter Prozesszeitdauer, Gas- und Stoffbedarf für den spezifischen Prozess, Mikroorganismus, verwendete Beutelgeometrie und Beutelmaterial, etc. Bevorzugt liegt die mittlere Schichtdicke des Nähr- bzw. Fermentationsmediums im Bereich von 0,1 mm bis 200 mm, bevorzugter 1,0 mm bis 50 mm, noch bevorzugter 2,0 mm bis 25 mm, am bevorzugtesten 3,0 mm bis 15 mm. Die genannten Werte gelten bevorzugt für eine typische aerobe Fermentation (z.B. mit E. coli), limitiert durch den Sauerstofftransport, bei einer Füllmenge von ca. 200 ml und einem Behälter aus typischem medical grade Polysiloxan mit einer Materialstärke von 75 bis 125 μm. Diese Werte sind abhängig von dem verwendeten Material, der Schichtdicke des Materials, der am Stoffaustausch teilnehmenden Behälteroberfläche und der speziellen Diffusionskonstante des Materials für die betreffende Substanz.
Die Schichtdicke des Nähr- bzw. Fermentationsmediums im Innern des Fermentationsbehälters ist insbesondere von Bedeutung, da vorzugsweise im erfindungsgemäßen Verfahren keine Rührwerkseinbauten in den Fermentationsbehältern vorgesehen sind und deshalb der Stofftransport im Nähr- bzw. Fermentationsmedium überwiegend durch Diffusion und nur in geringerem Maße durch Strömung bzw. Kavitation erfolgt. Strömung und Kavitation können (verglichen mit einem Rührwerk) nur in vergleichsweise geringem Umfang durch Übertragung von Strömungen und Kräften (z.B. Ultraschall oder mechanisches Schaukeln) über das Medium im Fermentationsbad erfolgen.
Aus diesem Grund ist ein einfacher, lediglich am Rand versiegelter (geschweißter, geklebter oder geklemmter) Beutel aus einer Folie für das erfindungsgemäße Verfahren bestenfalls bedingt geeignet. Ein derartiger Beutel, insbesondere bei Verwendung von dünnen Wandstärken, baucht stark aus, wobei die Vorteile der dünnen Schichtstärke verloren gehen. Zusätzlich wird durch das Ausbauchen nur ein Teil der Folie des Beutels ausreichend mit Nähr- bzw. Fermentationsmedium benetzt, was zur Folge hat, dass der nicht benetzte Teil kaum am Gasaustausch teilnimmt. Insbesondere bei zunehmender Beutelgröße, wie sie z.B. für ein Verfahren im industriellen Maßstab vorteilhaft ist, wird das Ausbauchen eines herkömmlichen, am Rande verschweißten Beutels aus einer Folie nicht immer gleichförmig stattfinden. Dies hat negative Einflüsse auf die Gleichförmigkeit und Vorhersagbarkeit des Gesamtverfahrens.
Es wurde überraschend gefunden, dass dieses Problem gelöst werden kann, wenn der Fermentationsbehälter innere und/oder äußere Einbauten (Versteifungsmittel) besitzt, welche dem Fermentationsbehälter erlauben, seine Form und damit die Schichtdicke des darin enthaltenen Nähr- bzw. Fermentationsmediums in gewissen Grenzen zu erhalten. Vorteilhaft ist es dabei, wenn der Fermentationsbehälter trotz Fixierung noch immer eine ausreichende mechanische Flexibilität aufweist, um äußere Krafteinwirkungen (Ultraschall, Strömung, etc.) zu erlauben, so dass im Fermentationsmedium im Inneren des Fermentationsbehälters Strömungen und Bewegungen induziert werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters ist dieser entweder aus einem formbeständigen Material konstruiert oder weist innere und/oder äußere Einbauten (Versteifungsmittel) oder zusätzliche Verbindungen auf, welche seine Form stabilisieren, damit die Schichtdicke des Nähr- bzw. Fermentationsmediums möglichst konstant gehalten wird und/oder damit ein Zusammenklappen der Außenwand verhindert wird, so dass ein möglichst großer Teil der Außenwand am Stoffaustausch teilnehmen kann.
Eine solche Stabilisierung des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters kann erreicht werden durch:

– Ausgestaltung des Fermentationsbehälters aus einem rigiden Material mit Aussparungen ("Fenstern") aus gasdurchlässigem, flexiblem Material;
– Einbringen eines Fermentationsbehälters auch einem flexiblen Material in einen äußeren, rigiden Rahmen (z.B. mit Querstegen oder einem Gitter), welcher die Ausbauchung des Fermentationsbehälters verhindert und vorzugsweise fest mit dem Fermentationsbehälter verbunden ist;
– Einbringen innerer Einbauten aus einem rigiden Material in den Fermentationsbehälter, welche fest mit der Außenwand verbunden sind und so ein Ausbauchen verhindern;
– Verbinden der Außenwand des Fermentationsbehälters (Beutelfolie) an einer oder mehreren Stellen mit der gegenüberliegenden Außenwand des Fermentationsbehälters (Beutelfolie), um die maximale Schichtdicke des Nähr- bzw. Fermentationsmediums zu begrenzen; und/oder
– Einbringen des Fermentationsbehälters in einen rigiden Rahmen oder Überbehälter (welcher beispielsweise gleichzeitig als Transporthalterung verwendet werden kann), wobei der Fermentationsbehälter nicht fest mit dem Rahmen oder Überbehälter verbunden ist, jedoch die Form des Fermentationsbehälters fixiert und ein Ausbauchen verhindert wird.

Der stabilisierte, erfindungsgemäße Fermentationsbehälter weist gegenüber den Fermentationsbehältern des Standes der Technik in mechanischer Hinsicht insbesondere die folgenden Vorteile auf:

– in vertikaler Position: Vermeidung des undefinierten und unkontrollierten Ausbauchens bzw. Verformens nach Befüllung sowie Vermeidung des Zusammenklappens der Beutelfolie in der oberen Hälfte des Fermentationsbehälters; und/oder
– in horizontaler Position: Vermeidung des Zusammenklappens der Beutelfolie an verschiedenen Stellen.

Dies hat verschiedene vorteilhafte Wirkungen:

– definierte, dünne Schichtdicken des Nähr- bzw. Fermentationsmediums im Innern des Fermentationsbehälters werden erreicht;
– kurze und definierte mittlere Diffusionsstrecken für Stofftransporte im Nähr- bzw. Fermentationsmedium führen zu definierten, gleichmäßigen Wachstumsbedingungen;
– der überwiegende Teil der Oberfläche kann am Stofftransport teilnehmen, da das Zusammenklappen der Beutelfolie minimiert ist – dies führt zu besseren und definierteren Wachstumsbedingungen für alle Zellen im Fermentationsmedium;
– die insgesamt definierteren Bedingungen verbessern den Einsatz in einem definierten, semi-kontinuierlichen industriellen Prozess, die Prozesssteuerung und die Stabilität des Prozesses; und/oder
– die definierten Schichtdicken des Nähr- bzw. Fermentationsmediums ermöglichen eine bessere standardisierte visuelle oder physikalisch-optische Beurteilung der "Güte" des Fermentationsinhaltes (z.B. Farbbeurteilung, Trübungsbeurteilung) und des Fermentationsfortgangs (optische Zelldichtemessung) am verschlossenen Fermentationsbehälter.

4 zeigt einen herkömmlichen, befüllten Fermentationsbehälter, welcher keine Stabilisierungen enthält. Der Fermentationsbehälter weist eine Randschweißnaht (16) und einen nicht am Stoffaustausch teilnehmenden Oberflächenbereich (17) auf. In der Seitenansicht ist veranschaulicht, wie das Material des Fermentationsbehälters (Beutels) in Ermangelung von Stabilisierungen ausbaucht. Die Schichtdicke (15) des Fermentationsmediums innerhalb des Fermentationsbehälters ist daher viel größer als gewünscht.
5 bis 7 zeigen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Fermentationsbehälters, jeweils in der Vorderansicht und der Seitenansicht. Die gewünschte Schichtdicke (15) des Fermentationsmediums wird dabei durch unterschiedliche Strukturelemente verwirklicht.
5 zeigt einen befüllten Fermentationsbehälter mit stabilisierenden Verbindungen oder Verklebungen (schematisch). Die Verbindung erfolgt zwischen der Ober- und der Unterfolie (18).
6 zeigt einen Fermentationsbehälter mit stabilisierenden Einbauten, hier mit einem festen eingebauten Rahmen (19). Der Rahmen fixiert lediglich die Form des Fermentationsbehälters, unterteilt diesen jedoch nicht in getrennte Kompartimente.
7 zeigt einen Fermentationsbehälter mit einem stabilisierenden äußeren Rahmen (20).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines oder mehrerer der vorstehend beschriebenen Fermentationsbehälter zur Synthese eines Biomoleküls durch Biosynthese durch Mikroorganismen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung erfolgt die Synthese des Biomoleküls nach dem vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren.

Claims

Verfahren zur Biosynthese eines Biomoleküls durch Mikroorganismen in einer Vielzahl von Fermentationsbehältern, welche eine Außenwand aufweisen, die für die Mikroorganismen undurchlässig, jedoch zumindest in einem Teilbereich gasdurchlässig ist; umfassend die Schritte (a) Einbringen eines Nährmediums in die Fermentationsbehälter; (b) ggf. Verschließen der Fermentationsbehälter, so dass ein Stoffaustausch mit der Umgebung nur noch durch die Außenwand der Fermentationsbehälter hindurch erfolgen kann; (c) ggf. Sterilisieren der Fermentationsbehälter; (d) Animpfen des Nährmediums in jedem Fermentationsbehälter durch aseptische Zugabe der Mikroorganismen; (e) Einbringen der Fermentationsbehälter in ein Fermentationsbad, in dem ein Gas oder Gasgemisch gelöst ist; und (f) ggf. Entfernen der Fermentationsbehälter aus dem Fermentationsbad.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass – das Volumen jedes Fermentationsbehälters höchstens 1.000 ml und/oder – das Verhältnis der äußeren Oberfläche jedes Fermentationsbehälters zu seinem Innenvolumen mindestens 0,5 cm²/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e) das Gas Sauerstoff ist oder das Gasgemisch Sauerstoff enthält.
Verfahren nach einer der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e) das Fermentationsbad durch das Gas oder Gasgemisch durchsprudelt wird, wobei es beim Einblasen unter einem Druck steht, der gleich groß wie oder größer als der Atmosphärendruck ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gas oder Gasgemisch – Sauerstoff umfasst und dazu dient, den Sauerstoff für eine aerobe Fermentation einzutragen und/oder bei einer aeroben Fermentation gebildete flüchtige Nebenprodukte auszutragen, oder – keinen Sauerstoff umfasst und dazu dient, den bei einer anaeroben Fermentation den als Nebenprodukt gebildeten Sauerstoff auszutragen.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gasgemisch CO₂, CH₄ und/oder H₂S zusammen mit einem Inertgas enthält.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e) das Fermentationsbad temperiert ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e) das Fermentationsbad mit Ultraschall beschallt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Zelllinien und Hefen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsbad neben dem Gas oder Gasgemisch zumindest eine Substanz enthält, welche von den Mikroorganismen für die Biosynthese benötigt wird und für welche die Außenwand der Fermentationsbehälter zumindest in einem Teilbereich durchlässig ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen durch Biosynthese ein Biomolekül synthetisieren, für welches die Außenwand der Fermentationsbehälter undurchlässig ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es semi-kontinuierlich durchgeführt wird.
Fermentationsbehälter umfassend – eine Außenwand, die für Mikroorganismen undurchlässig, jedoch zumindest in einem Teilbereich gasdurchlässig ist, – eine verschließbare Befüllöffnung, und – ggf. eine Vorrichtung zur aseptischen Zugabe einer festen oder flüssigen Zusammensetzung, wobei das Verhältnis der äußeren Oberfläche des Fermentationsbehälters zu seinem Innenvolumen mindestens 0,5 cm²/ml beträgt.
Fermentationsbehälter nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Vorrichtung zur aseptischen Zugabe der festen oder flüssigen Zusammensetzung aufweist, welche zum Zwecke der Zugabe mit einer Nadel oder einem Dorn durchstochen werden kann und sich nach dem Entfernen der Nadel oder des Dorns wieder selbsttätig verschließt.
Fermentationsbehälter nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Außenwand zumindest in einem Teilbereich eine Sauerstoffpermeabilität von wenigstens 500 cm³m^–2d^–1bar^–1 aufweist.
Fermentationsbehälter nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Außenwand zumindest in einem Teilbereich aus einer Membran gefertigt ist, welche auf zumindest einem Polysiloxan basiert.
Fermentationsbehälter nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Außenwand zumindest in einem Teilbereich eine Dicke von höchstens 150 μm aufweist.
Fermentationsbehälter nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Außenwand zumindest in einem Teilbereich für Wasser undurchlässig ist.
Fermentationsbehälter nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Außenwand zumindest in einem Teilbereich für CO₂, H₂S, CH₄ und/oder flüchtige Amine durchlässig ist.
Fermentationsbehälter nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass er sterilisierbar ist.
Fermentationsbehälter nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass er zu einem Beutel geformt ist.
Fermentationsbehälter nach einem der Ansprüche 13 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass er ein äußeres Befestigungsmittel aufweist.
Fermentationsbehälter nach einem der Ansprüche 13 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass er in seinem Innern ein Mittel aufweist, an dem die Mikroorganismen immobilisiert werden können.
Fermentationsbehälter nach einem der Ansprüche 13 bis 23, dadurch gekennzeichnet dass er eine Formbeständigkeit aufweist, so dass er nach Befüllen mit einer Flüssigkeit seine ursprüngliche räumliche Ausdehnung im wesentlichen beibehält.
Fermentationsbehälter nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Formbeständigkeit durch innere und/oder äußere Versteifungsmittel erreicht wird.
Verwendung eines Fermentationsbehälters nach einem der Ansprüche 13 bis 25 zur Synthese eines Biomoleküls durch Biosynthese durch Mikroorganismen.
Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese des Biomoleküls nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 erfolgt.