DE2932862C2

DE2932862C2 - Verfahren zur Herstellung von Zellkulturen in Reinkultur und Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens

Info

Publication number: DE2932862C2
Application number: DE2932862A
Authority: DE
Inventors: Walter L. 16055 Sarver Pa. Gerner; Paul A. 16023 Cabot Pa. Lemke; Stephen B. 16262 Worthington Pa. Maul; John B. 16001 Butler Pa. Yoder
Original assignee: BUTLER COUNTY MUSHROOM FARM Inc 16262 WORTHINGTON PA US; Butler County Mushroom Farm Inc 16262 Worthington Pa
Current assignee: Sylvan Spawn Laboratory Inc Kittanning Pa Us
Priority date: 1978-08-18
Filing date: 1979-08-14
Publication date: 1984-03-01
Also published as: JPS5545396A; FR2433575B1; CH648345A5; JPS6015304B2; GB2039203B; GB2050134B; GB2039203A; FR2433575A1; GB2050134A; DE2932862A1; US4204364A

Description

2. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man den oder die Inkubationsbehälter während des Abfiillens der inokulierten bzw. geimpften Mischung in eine den jeweiligen Behälter umfließende laminare Strömung steriler Luft bringt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein festes Nährstoffsubstrat aus Korn oder Getreide herstellt, und daß das Nährstoffgemisch Wasser und Kalk enthält.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, .dadurch gekennzeichnet, daß man als Impfstoff Pilzmyzel verwendet.

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Merkmale;

'a) einen eine Ein- und Auslaßöffnung (12) und mindestens einen Flüssigkeits- oder Gaseinläß (33) aufweisenden Trommelmischer (10) mit zugeordneter Heiz- und Kühleinrichtung, um den Trommelmischerinhalt auf einer Temperatur von mindestens 122° C zu halten,

/b) ein Anschlußsystem (13), das abdichtend an die Ein- und Auslaßöffnung (12) anschließbar ist und zwei eine Meßkammer (17) begrenzende Ventile (14, 16) und einen Flüssigkeits- oder Gaseinlaß umfaßt,

c) eine an dem Auslaßende (J9) des Anschlußsystems (13) anbringbare Kappe (21) zum Festhalten eines Flüssigkeits- oder Gasvolumens innerhalb des Anschlußsystems (13) zwischen dem einen Ventil (14) und der Kappe (21),

d) einen Luftfilter (38),

e) eine unter Zwischenschaltung des Luftfilters (38) an die Flüssigkeits- oder Gaseiniässe anschließbare Druckluftquelle (27),

f) eine an die Flüssigkeits- oder Gaseiniässe anschließbare Druckluftquelle (28) und

g) eine Einrichtung zur Erzeugung einer laminaren Strömung steriler Luft im Bereich und um das Auslaßende (19) des Anschlußsystems (13).

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Trommelmischer (10) ein V-förmiger Trommelmischer mit üblichem Heiz- bzw. Kühlmantel ist.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung von Zellkulturen in Reinkultur auf einem Festkörpersubstra·., und zwar insbesondere auf die sterile Hersteilung von Pilzmyzel.

Die Herstellung von Pilzmyzel ist bekannt. So ist es

ι beispielsweise bekannt, trockenes Korn bzw. Getreide mit Wasser und Calciumcarbonat in eine Flasche bzw. einen Behälter zu füllen, der mit einem Baumwollstöpsel verschlossen und sterilisiert wird. Die Flasche wird nach Sterilisierung gekühlt und das Korn bzw. Getreide wird

iü mit Myzel inokuliert bzw. geimpft, bevor die Flasche wieder verschlossen und während der Myzelinkubation stehen gelassen wird, siehe beispielsweise US-PS 18 69 5 J 7. Bei der Herstellung von Pilzmyzel ist die Sterilisierung der Nährstoffe und der Kulturbehälter

ι ί von besonderer Bedeutung, um da* Wachstum anderer Bakterien oder von Schimmelpilzen zu verhindern, die einen schädigenden Einfluß auf das Pilzmyzel bzw. die Pilzsporen haben könnten.
_u Die Herstellung von Tempeh ist ebenfalls seit

2o?iJahrhunderten bekannt, und zwar insbesondere im

' !orientalischen Kulturraum. Tempeh wird auf Sojabohnen fermentiert, die mit verschiedenen Species von ,Rhyzopus inokuliert bzw. geimpft werden. Neuere ^erfahren ermöglichen die schnelle Fermentation von

2ϊ Tempeh in Kunststoffsäcken, in denen der Pilz eine myzelartige Masse bildet, welche die Sojabohnen zu kuchenähnlichen Produkten verbindet.

Verbesserte Verfahren bei der Herstellung von •Pilzmyzel beinhalten das Vorkochen und Aufquellen des (Kornes bzw. Getreides, um deren Kuchenbildung während der Sterilisation zu verhindern, siehe US-PS 25 30 318. Die Verwendung eines granulatförmigen Holzkohlegrundstoffes mit einem Getreidesubstratüberzug für das Wachsen bzw. Herstellen von Myzel

!bzw. Pilzsporen ist in der US-PS 26 77 917 beschrieben. -'Die US-PS 28 51 821 behandelt die Verwendung von sterilisierbaren Kunststoffsäcken für die Inkubation von iMyzel und dessen Versendung, wobei die Sacköffnung jeweils mit einem atmungsfähigen Filtermaterial verschlossen wird. Der Sack und dessen Inhalt werden anschließend im wesentlichen in der gleichen Weise wie die früheren Glasflaschen sterilisiert, gegebenenfalls auch durch Bestrahlung, wobei der Sackinhalt bzw. der Nährstoff anschließend mit dem jeweils erwünschten Impfstoff geimpft und inkubiert wird. Ein Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, daß keine Glasflaschen benötigt werden, die sehr kostspielig, zerbrechlich und raumauf-'wendig sind, wobei wesentliche Verfahrensschritte innerhalb der Kunststoffsäcke durchgeführt werden können. Es besteht außerdem die Möglichkeit, nach der Inkubation das Myzel zu dem jeweiligen Wachstumsort zu transportieren, ohne daß die Kultur bzw. das Myzel in einen Zwischenbehälter übergeben werden muß. Da die erforderlichen Anlagen außerordentlich aufwendig in der Herstellung und im Betrieb sind, sind sie sehr selten und auch außerordentlich weit voneinander entfernt, was einen beträchtlichen Transport des Myzels bzw. der Kultur zur Folge hat. Die Benutzung von Kunststoffsäkken für die Inkubation stellt somit einen beträchtlichen

fao Fortschritt bei der Herstellung und dem Transport von Pilzmyzel bzw. Pilzkulturen dar. Weitere bereits angewandte Verbesserungen bestehen für den Transport des Myzels bzw. der Kulturen. So beschreibt beispielsweise die US-PS 33 35 521 den Transport von Championmyzel bzw. Championkulturen in luftdicht verschlossenen Behältern mit Eiskühlung.

Auch heute werden die bevorzugten Methoden für die Myzelinokulation und -inkubation in flexiblen

Kunststoffbehältern durchgeführt. Es sind viele Verbesserungen bei der Gestaltung und Konstruktion derartiger Behälter vorgeschlagen worden, einschließlich einer in der GB-PS 11 76 188 beschriebenen Verfahrensweise, gemäß der das Filterelement in die Behälterwandung ^r> eingearbeitet bzw. inkorporiert ist. Audi die US-PS 39 38 ö58 beschreibt die Verwendung eines porösen Filtermediums, welches in den Wandungen eines Kunststoffsackes angebrachte Schlitze überdeckt. Die US-PS 40 63 383 behandelt das Wachstum bzw. die m Herstellung von Pilzmyzel bzw. Piizkulturen in einem Kunststoffsdck, der mit einer mikroporösen Beatmungswand versehen ist. die einen Belag für Perforationen des Sackes bildet.

Bei den üblichen Verfahren zum Herstellen von i^r> Pilzmyzel wird sowohl bei der Verwendung von Glasflaschen als auch von Kunststoffsäcken der Nährstoff oder das Substrat normalerweise in dem Behälter sterilisiert, um das Wachstum von unerwünsch-. ten Bakterien oder anderen unerwünschten Mikroorga-•^.'riismen zu verhindern. Diese Verfahren sind jedoch V; außerordentlich laborintensiv. Die Sterilisierung von -^'mit Nährstoff gefüllten Flaschen oder Säcken, die "' Inokulation bzw. das Impfen der sterilisierten Nährstoff- -Λ behälter und das Inbewegungsetzen der einzelnen Nährstoffbehälter zum Zwecke des Einmischens des .-;Impfstoffes während der Inkubation erfordern zahlreiche von Hand durchzuführende Prozesse. Auch vor -,einigen Jahren durchgeführte Versuche, das Substrat in ".großen Chargen vor dem Einfüllen in Flaschen zu 'sterilisieren und zu inokulieren bzw. zu impfen, haben sich als nicht erfolgreich herausgestellt und wurden infolge von Verunreinigungs- bzw. Vergiftungsproblemen aufgegeben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung von Zellkulturen, insbesondere Pilzmyzel und Pilzsporen, zu schaffen, welche nicht die den bekannten Verfahren und Vorrichtungen anhaftenden Nachteile aufweisen und die zu einer Verringerung der Laborarbeit bei der Sterilisation und der Inokulation bzw. dem Impfen führen, wobei auch die Möglichkeit einer Verunreinigung bzw. Schädigung während der Inokulation bzw. des iriipfens und den anschließenden Sackfüllschritten usw. auf ein Minimum reduziert sein soll. Dabei sollen insbesondere die Mischprozesse eliminiert werden, die bisher nach der Inokulation bzw. dem Impfen der Nährstoffbehälter erforderlich gewesen sind.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß man >('

a) ein Nährstoffgemisch unter gleichzeitiger Sterilisation bei einer Temperatur von mindestens 122° C mischt,

b) das sterilisierte Gemisch abkühlt,

c) mit einem Impfstoff beimpft,

d) mischt und

e) die Mischung unter sterilen Bedingungen in mindestens einen Inkubationsbehälter abfüllt.

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Das erfindungsgemäße Verfahren besteht somit im wesentlichen darin, Nährstoffmittel in einen Mischer, insbesondere Trommelmischer, einzuführen, der auf bestimmte Temperaturen gebracht und unter bestimmte Drücke gesetzt werden kann, die für die Sterilisierung der Mischung bzw. des Gemisches notwendig sind. Im Fall von Pilzmyzel bzw. Pilzsporen besteht eine typische Mischung vorzugsweise aus 50 bis 60 Gewichtsprozent Korn oder Getreide, 40 bis 50 Gewichtsprozent Wasser und 1 Gewichtsprozent Kalk.

Der Mischerinhalt wird gemischt und durch erhitzen des Mischers auf eine Temperatur von mindestens 122°C sterilisiert. Vorzugsweise wird während der Sterilisation und des Mischern Dampf mit einem Überdruck von 1.0546 kg/cm² in den Mischer eingeleitet. Die Temperatur und der Druck werden vorzugsweise 35 bis 120 Minuten, insbesondere etwa 45 Minuten, lang aufrechterhalten, um eine ausreichende Sterilisierung zu erhalten.

Anschließend läßt man den Mischer und die Mischung unter einer sterilen Luftatmosphäre bei einem Überdruck auf etwa 27° C abkühlen, bevor der Impfstoff unter sterilen Bedingungen in den Mischer gegeben und gründlich mit dem Nährstoff vermischt wird. Nach Beendigung des Mischens wird der Mischer an eine Sackfüllstation angeschlossen, und zwar unter Verwendung eines sterilen Anschluß- bzw. Verbindungssystems, •welches eine Meßeinrichtung enthält, um jeweils •abgemessene Mengen des beimpften Nährstoffes in die .!Säcke abfüllen zu können. Die Sackfüllstation befindet sich in einer laminaren Strömung steriler Luft, um zu verhindern, daß Verunreinigungen bzw. Giftstoffe in jien einzelnen Sack oder das Anschlußsystem eindringen können. Die sterilisierten Säcke, von denen jeder einen Beatmungsstreifen enthält, befinden sich während (des Füllens im Bereich des Auslaßendes des Anschlußsystems. Die Säcke werden unmittelbar nach dem Füllen verschlossen bzw. versiegelt und sind anschließend für die Inkubation und die Auslieferung fertig.

Das erfindungsgemäße Verfahren vermeidet den relativ kritischen Schritt des Beimpfens von Einzelsäkken oder Einzelflaschen, wie es bisher bei der Herstellung von Pilzmyzel od. dgl. notwendig gewesen ist.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 ist gekennzeichnet durch folgende Merkmale:

a) einen eine Ein- und Auslaßöffnung und mindestens einen Flüssigkeits- oder Gaseinlaß aufweisenden Trommelmischer mit zugeordneter Heiz- und Kühleinrichtung, um den Trommelmischerinhalt auf einer Temperatur von mindestens 122 C zu halten,

b) ein Anschlußsystem, das abdichtend an die Ein- und Auslaßöffnung anschließbar ist und zwei eine Meßkammer begrenzende Ventile und einen Flüssigkeits- oder Gaseinlaß umfaßt,

c) eine an dem Auslaßende des Anschlußsystems anbringbare Kappe zum Festhalten eines Flüssigkeits- oder Gasvolumens innerhalb des Ansclilußsystems zwischen dem einen Ventil und der Kappe,

d) einen Luftfilter,

e) eine unter Zwischenschaltung des Luftfilters an die Flüssigkeits- oder Gaseinlässe anschließbare Druckluftquelle,

f) eine an die Flüssigkeits- oder Gaseinlässe anschließbare weitere Druckluftquelle und

g) eine Einrichtung zur Erzeugung einer laminaren Strömung steriler Luft im Bereich und um das Auslaßende des Anschlußsystems.

Das erfindungsgemäße Verfahren schafft in Verbindung mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine sterile Umgebung während des Mischens von Nährstoff und Impfstoff. Dieses ist von wesentlicher Bedeutung

bei der Herstellung von Pilzmyzel und bei der Herstellung verschiedener anderer Zellstämme bzw. Zellkulturen.

Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen -■ Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, daß der sterilisierte Nährstoff in einer größeren Masse inokuliert bzw. eingeimpft, gemischt und unter sterilen Bedingungen in sterile Behälter zum Zwecke der Inkubation abgefüllt werden kann.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung (vgl. die Patentansprüche) ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, welche insbesondere die Herstellung von Pilzmyzel zum Inhalt hat. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist in schematischer Weise in der Zeichnung dargestellt. Es zeigt

Fig.l in schematischer Darstellung teilweise im Schnitt eine Seitenansicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung, und

Fig.2 ein Schemadiagramm des Luft-Dampf-Anschlußsystems.

F i g. 1 zeigt in schematischer Darstellung einen Trommelmischer 10, bei dem es sich vorzugsweise um einen V-förmigen Trommelmischer mit üblichem (nicht dargestellten) Heiz- bzw. Kühlmantel handelt. Der Trommelmischer rotiert um die Achse 11 und ist mit einer Ein- und Auslaßöffnung zum Einfüllen und Entladen des Nährmittels bzw. Nährstoffes versehen.

Gemäß F i g. 1 enthält der Trommelmischer 10 zwei öffnungen, nämlich die Ein- und Auslaßöffnung 12 und eine Dampf- und Luftleitung 33, durch v/elche Impfstoff ' in den Mischer eingeführt werden kann. Wenn der Impfstoff fest oder partikelförmig ist, wird er unter dem Einfluß der Schwerkraft unter sterilen Bedingungen durch die Ein- und Auslaßöffnung 12 in den Behälter eingeführt. Die Ein- und Auslaßöffnung 12 wird dann vorzugsweise in eine solche Lage gebracht, daß sie unter einem geeigneten Winkel schräggestellt oberhalb der durch die Achse 11 gehenden Horizontalebene des Trommelmischers 10 liegt. Alternativ kann ein flüssiger Impfstoff unter sterilen Bedingungen durch die Leitung 33 in den Trommelmischer 10 eingeführt werden. Bei beiden Impfmethoden müssen sämtliche Anschlußleitungen und Ventile vor der Beimpfung des Nährstoffes bzw. Nährmittels sterilisiert werden bzw. sich in einem sterilen Zustand befinden, um eine Kontamination der Mischerfiillung bzw. -charge auszuschalten.

Die Ein- und Auslaßöffnung ist so gestaltet, daß sie mittels eines luftdichten Anschlußstückes bzw. einer luftdichten Dichtung, beispielsweise einer Kamlok-Schnellkupplung, mit der Anschlußleitung 13 verbunden werden kann. Das verwendete luftdichte Anschlußstück bzw. die verwendete luftdichte Dichtung muß sterilisiert werden können und Oberdrücke bis zu etwa J,0546kg/cm^z aushalten können. Die Anschlußleitung bzw. das Anschlußsystem 13 mißt sowohl das beimpfte Substrat ab, und durch dieses Anschlußsystem wird das beimpfte Substrat auch den fnkubationsbehältern bzw. Inkubationssäcken zugeführt. Das Anschlußsystem 13 besteht vorzugsweise aus rostfreien Stahlrohren und umfaßt erste und zweite Ventile 14 und 16, vorzugsweise Dreh- bzw. Sperrklappen. Der Abstand bzw. Raum zwischen den beiden Ventilen 14 und 16 bildet im wesentlichen eine Meßkammer 17, deren Volumen im wesentlichen dem Volumen des zu füllenden Inkubationsbehälters bzw. -sackes en tsprich t

Das Anschlußsystem 13 erstreckt sich durch den Boden bzw. Fußboden 18 zu einer Abfölfstation 20. Die Abfülistation befindet sich innerhalb einer laminaren Strömung von sterilisierter Luft, und zwar insbesondere in einem völlig reinen Raum. Die Abfüllstation 20 enthält eine abnehmbare Kappe 21, die über das Ende 19 des Anschlußsystems 13 geschoben werden kann, um Dampf aufzunehmen, der zu Sterilisationszwecken in das Anschlußsystem 13 eingeblasen wird. Nach der Sterilisation des Anschlußsystemes 13 wird die Kappe 21 entfernt, und (gestrichelt dargestellte) sterilisierte Säcke 22 werden über das Auslaßende des Anschlußsystems 13 geschoben, um,gefüllt zu werden. Im Bereich des Auslaßendes 19 des Anschlußsystemes 13 ist eine Sackverschließeinrichtung angeordnet, um die Säcke unmittelbar nach dem Füllen durch Heißverschweißen zu verschließen.

Da das erfindungsgemäße Verfahren eine Autoklavbehandlung der Säcke 22 nicht erforderlich macht, können die Säcke vorzugsweise aus einer Polyäthylenfolie bestehen, die durch Gas, Elektronenstrahl oder sonstige Strahlung sterilisierbar ist. Ein solches Material ist bei weitem weniger aufwendig, als das bisher für diese Zwecke verwendete Material in Form von Polypropylen oder Nylon. Jeder Sack enthält einen Streifen aus einem synthetischen Fasermaterial, beispielsweise ein papierartiges Faservlies aus thermisch verschweißten Hochdruckpolyäthylenfasern, damit die Zellen atmen können.

F i g. 2 zeigt in schematischer Darstellung ein steriles Luft- und Dampfsystem 26, das eine Druckluftquelle 27 mit einem Überdruck von 1,0546 kg/cm² und eine Dampfquelle 28 umfaßt. Die Dampfquelle 28 ist an den Trommelmischer 10 über den Kondenstopf 29, eine Leitung 31, ein Ventil 32 und die Leitung 33 angeschlossen. Der Leitung 33 ist im Bereich der Achse des Trommelmischers 10 eine Drehkupplung 34 zugeordnet. Die Druckluftquelle 27 ist an die Leitung 36 über ein Ventil 37 angeschlossen. In der Leitung 36 liegt zum Zwecke der Sterilisierung der von der Druckluftquelle 27 kommenden Luft ein Luftfilter 38. Bei dem Luftfilter 38 handelt es sich um ein sterilisierbares Filter. Das Auslaßende des Luftfilters 38 ist an eine Leitung 39 angeschlossen, die über ein Ventil 41 an die in den Trommelmischer 10 führende Leitung 33 und über Ventile 42 und 43 an die Meßkammer 17 angeschlossen ist. Das Luft- und Dampfsystem 26 enthält weiterhin Leitungen 44 und 46 und zugeordnete Ventile 47,48, um dem Anschlußsystem 13 und dem Luftfilter 38 Sterilisationsdampf zuführen zu können. Als Teil des Luft- und Dar.ipfsystems 26 enthält die Kappe 21 der Abfüllstation 20 einen Ablauf 51 und einen Kondenstopf 52.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Pilzmyzel wird der Trommelmischer 10 durch die Öffnung 12 mit einem Feststoffsubstrat beschickt, welches in den üblichen Anteilen beispielsweise Roggenkorn, Kalk und Wasser enthält. Der Mischer kann während der Beschickung gekühlt oder vorerwärmt werden. Zu Beginn des Mischvorganges erfolgt jedoch über den Heizmantel eine Erwärmung, um die in dem Trommelmischer befindliche Mischung auf eine Temperatur von mindestens 122°C zu erhitzen. Gleichzeitig wird das Ventil 32 geöffnet, um Dampf mit einem Druck von etwa 1,0546 kg/cm² in den Trommelmischer 10 einzulassen. Das Mischen wird bei einer Temperatur von mindestens 122° C während eines Zeitraumes von 35 bis 125 Minuten, vorzugsweise 45 Minuten, fortgeführt. Die Zeitdauer für die Sterilisierung der Nährstoffmischung soll in bekannter Weise möglichst klein sein, da jede

zusätzliche bzw. übermäßige Sterilisierung das Myzelwachstum verlangsamt.

Gegen Ende der Sterilisation wird die Dampfzufuhr in den Mischer unterbrochen, und es findet eine Abkühlung durch den Mischermantel statt, um die Temperatur der Mischung auf etwa 10 bis 32°C zu bringen. Der Dampf wird abgeschaltet oder entspannt, um das Kühlen des Mischers zu erleichtert). Wenn der Dampf abgeschaltet wird, wird von der Drtickluftquelle 27 sterile Luft durch das Luftfilter 38 und die ι ο Einlaßleitung 33 in den Mischer eingeführt, um innerhalb des Trommelmischers einen Überdruck aufrechtzuerhalten. Nach dem Abkühlen wird der Impfstoff in den Trommelmischer eingeführt. Wenn es sich um einen festen Impfstoff handelt, wird dieser vorzugsweise unter dem Einfluß der Schwerkraft durch die öffnung 12 unter sterilen Bedingungen in den Mischer 10 eingeführt, oder im Falle eines flüssigen Impfstoffes durch· die Leitung 33. Um den Impfstoff unter sterilen Bedingungen durch die öffnung 12 einzuführen, muß diese öffnung zuerst sterilisiert werden, wobei eine sterilisierte Luftströmung aus der Öffnung 12 ausströmen muß. Es ist auch möglich, festen Impfstoff mittels einer sterilisierten Bombe zuzuführen, die an der Öffnung 12 festgemacht werden kann, so daß dann eine Strömung sterilisierter Luft überflüssig ist. Es Jcönnen auch andere geeignete Verfahren zur Zufuhr der Kultur angewandt werden.

Der Impfstoff wird gründlich mit dem sterilisierten Nährstoff gemischt. Nach Beendigung des Mischens wird das Anschlußsystem 13 an die öffnung 12 angeschlossen und sterilisiert. Die Sterilisation erfolgt in der Weise, daß das Auslaßende 19 mittels der Kappe 21 verschlossen und Dampf in das Anschlußsystem durch die Ventile 43 und 47 und die Leitung 44 eingeblasen wird. Nach Beendigung der Sterilisation wird die Kappe entfernt, und ein Sack wird über das Auslaßende 19 gezogen. Danach wird die Öffnung 12 zusammen mit dem ersten Ventil 14 geöffnet, während das zweite Ventil noch geschlossen bleibt. Das inokulierte bzw. geimpfte Substrat kann somit in die Meßkammer 17 einströmen, bis diese gefüllt ist, Woraufhin das erste Ventil 14 geschlossen wird. Danach wird das Ventil 16 geöffnet, um den Inhalt der Meßkammer 17 in den über das Auslaßende 19 gezogenen Sack einströmen zu lassen. Gleichzeitig mit dem öffnen des Ventils 16 wird sterile Luft in die Kammer 17 eingeblasen, um den Raum des aus dieser Kammer ausströmenden Substrates einzunehmen. In den Mischer wird sterile Luft eingeblasen, um einen geringen positiven Druck bzw. Überdruck aufrechtzuerhalten so daß auch hier der durch das Ausströmen der Mischung aus dem Mischer gebildete Raum wieder aufgefüllt wird.

Das Abfüllen der Säcke 22 findet vorzugsweise in einem sauberen Raum statt, wobei es jedoch auch möglich ist, die Abfüllstation 20 in eine Umgebung zu bringen, in der eine laminare Strömung sterilisierter Luft vorliegt (vgl. Punkt g) des Anspruchs 5) um das Eindringen von Verunreinigungen bzw. Giftstoffen in den Sack zu verhindern. Nach dem Füllen des Sackes wird dieser versiegelt, so daß während der folgenden Inkubation nur Luft durch den Atmungsstreifen in den Sack eindringen kann.

Hierzu I Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Zellkulturen in Reinkultur auf einem Festkörpersubstrat, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein Nährstoffgemisch unter gleichzeitiger Sterilisation bei einer Temperatur von mindestens 122⁰C mischt,

b) das sterilisierte Gemisch abkühlt,

c) mit einem Impfstoff beimpft,

d) mischt und

e) d!e Mischung unter sterilen Bedingungen in mindestens einen Inkubationsbehälter abfüllt.