CH653702A5 - Verfahren zum zuechten von zellgewebe, verfahren zur gewinnung eines viralen impfstoffes und verfahren zur gewinnung einer biologisch aktiven substanz. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten von Zellgewebe, ein Verfahren zur Gewinnung eines viralen Impfstoffes sowie ein Verfahren zur Gewinnung einer biologisch aktiven Substanz.

Bei der Herstellung von Zellgeweben werden die Zellen traditionell in Roux-Zylindern oder Rollflaschen gezüchtet. Um grosse Mengen an Gewebe zu gewinnen, ist eine grosse Anzahl von solchen Flaschen notwendig. Dies Verfahren ist sehr arbeitsintensiv. Viele unterschiedliche Systeme sind vorgeschlagen worden, um Zellkulturen, die eine Verankerung der Zellen erfordern, wie tierische, pflanzliche oder Pilzzellen, einschichtig auf einer Haftoberfläche zu züchten, von Laboratoriumsverhältnissen auf grosse Produktionsmassstäbe umzusetzen. Viele Zellkulturen zeigen als Erfordernis für ein Wachstum eine Verankerungsabhängigkeit auf einer entsprechenden Oberfläche. Da der Kontakt von Zelle zu Zelle weiteres Wachstum verhindert, wird so eine einlagige Zellschichtkultur geschaffen, die die zur Verfügung stehende Fläche bedeckt. Für hohe Herstellungsgeschwindigkeiten von biochemischen Substanzen, beispielsweise von Impfstoffen, z.B. für Mumps, für Röteln, Masern, Grippe, Paragrippe, Mareksche Erkrankung oder Infektionen der Atmungswege von Zell-Linien Fibroblast von Kükenembryos, Virenzellen von Ochsen, Grünaffenzellen, menschliche diploide Lungenoder Haut-Fibroblaste, ist eine grosse Oberfläche erforderlich.

Die Erzeugung vieler virualer Impfstoffe und Biochemika, z.B. Interferon, menschliche Wachstumshormone, Somatasta-tin, Alphathymasin-1 sowie menschliches Insulin hängen von der erfolgreichen Züchtung von tierischen Zellen in Form einer an einer Oberfläche haftenden Monoschicht ab. Ähnliche Produkte können von Pflanzenzellen und von fungalen Zellengewebekulturen gewonnen werden.

Nachdem die Technik der Molekularbiologie viele neue Zellenreihen produziert haben, sind vergrösserte Produktionsausmasse angestrebt und Verfahrensvorrichtungen angeboten worden, welche grössere Oberflächen aufweisen.

Insbesondere ist eine Prozesseinheit erhältlich, welche eine Reihe von Metallscheiben aufweist, die zusammen mit einer Welle rotierend montiert sind. Diese Scheiben sind in einem Kessel montiert, der Speise- und Abführungsleitungen für flüssige und gasförmige Medien aufweist. Im Betrieb wird das Gefäss mit einem Serum gefüllt und so gehalten, dass sich die Scheiben in horizontalen Ebenen befinden, so dass sich die Zellen auf den Platten absetzen können. Der Kessel wird gekippt, so dass sich die Scheiben in einer senkrechten Ebene befinden, wobei der Kessel teilweise entleert wird, um einen Kopfraum für die Belüftung zu erhalten. Die Scheiben werden dann langsam rotiert, so dass die Zellen für die weitere Behandlung weitergeführt werden können. Bei einer anderen

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Ausführungsform des Apparates werden die Zellen auf einer Reihe von Rohren gezüchtet und behandelt.

Einrichtungen dieser Art sind teuer in der Herstellung und können den Produktionserfordernissen nicht leicht ange-passt werden. Auch ist eine genaue Kontrolle des Prozesses nicht leicht möglich, da die Kultur im wesentlichen chargenweise erfolgt, wobei die Temperatur und die anderen Variablen nicht leicht von der Aussenseite her gesteuert werden können.

Es ist Aufgabe der Erfindung, Verfahren der eingangs näher bezeichneten Art so weiterzubilden, dass die aufgezeigten Nachteile und Schwierigkeiten vermieden werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Züchten von Zellgewebe, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Zellen auf den Platten eines Plattenwärmetauschers absetzen und ein Wachstumsmedium in kontinuierlicher Zirkulation durch die zwischen den Platten definierten Strömungsräume passieren lässt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Gewinnung eines viralen Impfstoffes, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man Zellen auf den Platten eines Plattenwärmeaustauschers absetzen und ein Wachstumsmedium in kontinuierlicher Zirkulation durch die zwischen den Platten definierten Strömungsräume passieren lässt, und dem zirkulierenden Wachstumsmedium während seiner Zirkulation einen Virus zufügt.

Durch Impfen des Wachstumsmediums mit einem Virus kann eine Infektion an Ort und Stelle der Zellen erreicht werden, was zur Produktion von Impfstoffen führt. Der Virus kann auch dazu verwendet werden, um die Zelltypen zu transformieren. Alternativ kann der Kultur auch ein Traspo-son oder ein Plasmid zugefügt werden. Unter bestimmten Umständen können andere Zusatzstoffe erforderlich sein, z.B. Antibiotika oder ein Zusatz wie Natriumbutyrat für die Stimulation einer Interferonproduktion.

Gegenstand der Erfindung ist ausserdem ein Verfahren zur Gewinnung einer biologisch aktiven Substanz, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man Zellen auf den Platten eines Plattenwärmeaustauschers absetzen und ein Wachstumsmedium in kontinuierlicher Zirkulation durch die zwischen den Platten definierten Strömungsräume passieren lässt, und die biologisch aktive Substanz extrahiert.

Vorzugsweise wird Luft oder Sauerstoff im zirkulierenden Wachstumsmedium bei seinem Eintritt in den Wärmetauscher gelöst.

Zweckmässigerweise wird Luftsauerstoff oder Kohlendioxyd aus dem Wachstumsmedium, nach dessen Verlassen des Wärmetauschers, entfernt.

Vorzugsweise werden nur alternierende Strömungsräume für die Züchtung von Zellgewebe verwendet, während die dazwischenliegenden Strömungsräume für die Zirkulation von Wasser oder einem anderen Medium bei kontrollierter Temperatur ausgenutzt werden.

Bei einer Ausführungsform kann eine selektierte Variation der wirksamen Fläche, auf der die tierischen Zellgewebe gezüchtet werden, dadurch erhalten werden, dass man Impfstoff- und Wachstumsmedien durch selektierte Strömungsräume des Wärmetauschers umlenkt.

Durch Trennung des Wärmetauschers in zwei oder mehr getrennte Wachstumsbereiche können die anfänglichen Impfstoffe im kleineren Massstabe gezüchtet werden, bevor eine aseptische Übertragung auf den gesamten Wärmetauscher stattfindet.

Ein Vorteil einer solchen Methode besteht darin, dass eine Subkultur, die bei geringerem Flächenausmass gezüchtet werden kann, zunächst auf Veränderungen der Morphologie, Karyologie und Lebensdauer getestet werden kann, bevor Kulturen grösseren Ausmasses angelegt werden. Sollte die

Subkultur mutiert sein oder verunreinigt sein, kann sie aufgegeben werden.

Die Selektion kann mit Hilfe eines Verbindungsnetzes erfolgen. Es kann zweckmässig sein, dass die Geschwindig-5 keit des Impfstoffes und des Wachstumsmediums im wesentlichen in allen Prozessströmungsräumen konstant bleibt.

Unter Geschwindigkeit wird hier sowohl die Richtung als auch die Bewegungsgeschwindigkeit der Strömung verstanden. Es wurde festgestellt, dass bestimmte Zellreihen besser io wachsen, wenn das Wachstumsmedium über eine Zellmonoschicht, die an einer senkrechten Fläche haftet, in Aufwärtsrichtung strömt, während alle anderen Zell-Linien einen Vorzug für nach unten fliessende Medien besitzen.

Indem man sicherstellt, dass die Strömungsgeschwindig-15 keit im wesentlichen konstant ist, kann die bevorzugte Strömung für eine spezielle Zellwachstumslinie über die ganze Plattenfläche aufrecht erhalten werden.

Vorzugsweise wird die effektive Fläche, auf der die Zellgewebe gezüchtet werden, mit Hilfe eines Einsatzes vergrös-2o sert, der in irgendeinen oder mehrere Prozessströmungsräume des Wärmetauschers eingesetzt wird.

Durch Vergrösserung der Oberfläche mit Hilfe von Einsätzen kann die Gesamtzahl von Zellen, die in dem Wärmetauscher gezüchtet werden kann, vergrössert werden. 25 Der Einsatz kann ein Gitter aus Polypropylen, aus einem Drahtnetz aus rostfreiem Stahl oder eine perforierte Metallplatte sein.

Durch Einsetzen irgendeines der oben erwähnten Einsätze zwischen die Platten des Prozessströmungsraumes kann 30 die Gesamtfläche, die für die Züchtung zur Verfügung steht, bis zu 65% bei gleichem Innenvolumen des Wärmetauschers vergrössert werden. Ein Gitter aus Polypropylen ist billiger als ein Metallgitter aus rostfreiem Stahl oder Platten. Ein solches Polypropylengitter ist jedoch weniger geeignet für die 35 Verwendung im Zusammenhang mit Medien, welche Feststoffanteile oder andere störende Komponenten aufweisen, da es wesentlich schwieriger ist, die Maschenöffnungen sauber zu halten und zu sterilisieren.

Der Einsatz kann eine Platte eines Plattenwärmetauschers 40 sein.

Der Effekt des Hinzufügens einer eingesetzten Platte zu dem Stapel besteht darin, den Oberflächenbereich der Prozessströmungsräume um 100% oder mehr zu steigern, indem man eine Zahl von Prozessströmungsräumen zwischen jedem 45 Paar von Strömungsräumen für eine Hilfsflüssigkeit aufweist.

Die Haftung der Zellgewebe an den Oberflächen der Strömungsräume kann durch eine Vorbehandlung dieser Flächen verstärkt werden. Die Vorbehandlung kann durch Sandstrahlen oder Glasstrahlen der Oberflächen der Strömungsräume 50 erfolgen. Die sich ergebende, mit Narben bedeckte Oberfläche liefert eine geeignete Umgebung sowohl für das anfängliche Einfangen als auch für gute langdauernde Haftung dieser Zellen, die sonst nicht leicht an glatten Zellen haften.

Die Vorbehandlung kann alternativ dazu die Anwendung 55 eines Oberflächenüberzuges auf die Oberfläche des Strömungsraumes umfassen.

Durch Überziehen der Flächen der Strömungsräume mit beispielsweise Polylysin, Histonen, Protaminen, Collagen, Gelantine, Glas oder Polystyrol-Kunststoff mit Protonen, die 60 von den oberflächlichen aromatischen Gruppen entladen worden sind, kann die Affinität der Zellen für die Oberfläche vergrössert werden.

Um die Zellen von der Oberfläche freizusetzen, kann ein proteolytisches Mittel, z.B. Trypsin oder Pronase angewendet 65 werden. Der Vorteil eines Plattenwärmetauschers als Züchtungskessel besteht darin, dass die Temperatur leicht auf Werte unter 15° herabgesenkt werden kann, bevor die Behandlung mit dem proteolytischen Mittel erfolgt. Bei einer

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Temperatur unter 15 °C wird der Zugang von Trypsin und Pronase zu kritischen Zellkomponenten stark herabgesetzt. Ausserdem vermindert die niedrige Temperatur das Ausmass der Haftung an der Oberfläche an den seitlichen Ecken der Zellen und verstärkt die Freilegung der verbleibenden Haftungsbereiche. Diese Wirkungen kumulieren die Verminderung sowohl der erforderlichen Trypsin- oder Pronase-Aktivierungseinheiten wie auch die Einwirkungszeit für das Freisetzen der Zellen.

Die Haftung der Zellgewebe an den Oberflächen der Strömungsräume kann auch durch eine Vorbehandlung dieser Oberflächen vermindert werden.

Eine solche Vorbehandlung umfasst die Anwendung eines dünnen Filmüberzuges aus Polytetrafluoräthylen auf die Oberfläche der Strömungsräume.

Eine solche Fläche ist geeignet für Zellen, die nur eine relativ leichte Haftung an der Oberfläche erfordern und die auf leichte Weise entfernt werden müssen.

Vorzugsweise wird eine Duplex-Dichtungsanordnung angewendet.

Wenn die Zellen oder Produkte von den Zellen von besonders gefährlicher Natur sind, kann der Plattenwärmetauscher in einer solchen Form konstruiert werden, dass er ein Auslecken jeglichen gefährlichen Materials in die Atmosphäre oder des Temperatursteuermediums durch die Abdichtungsmittel verhindert. Eine solche unfallsichere Abdichtung zur Verhinderung jeglichen Entweichens von gefährlichen Fluiden in die Atmosphäre oder in die Hilfsflüssigkeit ist in der britischen Patentanmeldung 206 28 33A beschrieben. Ein Überwachungssystem ist dort ebenfalls beschrieben, um eine frühzeitige Warnung von jedem Auslek-ken durch die erste Dichtung zu geben. Dies kann besonders wichtig sein, wenn es sich bei den Kulturen um hoch patho-gene Organismen handelt.

Es ist auch möglich, dass man die Zerlegung der an den Oberflächen haftenden Zellen an Ort und Stelle ausführt.

Durch Zerlegen der an der Oberfläche haftenden Zellen an Ort und Stelle kann der Gehalt der Zellen wiedergewonnen werden. Die Zerlegung kann auf eine Vielzahl von Arten erfolgen, z.B. durch viruale Infektion, durch Temperaturänderung oder mittels eines osmotischen Schocks.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist überdies eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, welche gekennzeichnet ist durch einen Plattenwärmetauscher, Mittel zum Zirkulieren eines Temperatursteuermediums durch einen Satz von Strömungsräumen des Wärmetauschers, Mittel zum Zirkulieren eines Wachstumsmediums durch den anderen Satz von Strömungsräumen, Mittel zum Entfernen von Gasen aus dem zirkulierenden Wachstumsmedium, nachdem dieses den Wärmetauscher verlassen hat, Mittel zum Injizieren von Luft oder Sauerstoff in das zirkulierende Wachstumsmedium, sowie durch Mittel zum Injizieren eines Impfmediums in das zirkulierende Medium und durch eine Instrumenteneinrichtung zum Messen der Arbeitsparameter zur Kontrolle des Verfahrens.

Unter bestimmten Umständen, z.B. bei Wachstum einer pathogenen Zellen-Linie, bei Zell-Linien, die mit einem Pathogen geimpft sind, oder bei einem Zell-Linienwachstum in Gegenwart eines Giftes oder eines Karziogen, kann es wünschenswert sein, einen Wärmetauscher anzuwenden, bei dem nebeneinanderliegende Platten, welche einen Strömungsraum für das Prozessmedium begrenzen, paarweise dem Umfang nach und um den Umfang der durchgehenden Öffnungen, welche die Kanäle zur Weiterleitung der Hilfsmedien begrenzen, verschweisst sind, während die Strömungsräume für die Hilfsmedien durch flexible Dichtungen abgedichtet werden.

Auf diese Weise wird Gebrauch gemacht von relativ grossen Flächenbereichen, wie sie in einem Plattenwärmetauscher zur Verfügung stehen. Es ist ersichtlich, dass durch Zufügen oder Entfernen von Platten die zur Verfügung stehende Fläche leicht an den gewünschten Zweck angepasst werden kann. Ausserdem kann durch Zirkulieren von gesteuerten Temperaturheiz- oder Kühlungsmedien in den Zwischenräumen die Züchtungstemperatur genau eingestellt werden. Wenn eine gewellte Oberfläche verwendet wird, können die ursprünglich eingeführten Zellen ohne die Notwendigkeit einer Reorientierung der Flächen, auf denen die Zellen gezüchtet werden sollen, sich absetzen. Da nur ein kleiner Teil des gesamten Wachstumsmediums in Kontakt mit den Zellen zu jeder gegebenen Zeit steht, kann eine Kontrolle des Prozesses durch Behandlung des Mediums ausserhalb des Wärmetauschers erhalten werden, indem man z.B. den pH-Wert, den Nährstoffgehalt, den gelösten Sauerstoffgehalt und dgl. überwacht und regelt.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand schematischer Zeichnungen an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Es zeigen :

Figur 1 ein schematisches Diagramm einer Einrichtung für die Züchtung von Zellen zum Durchführen des erfindungsgemässen Verfahrens ;

Figur 2 eine schematische Ansicht einer abgewandelten Einrichtung zum Züchten von Zellkulturen;

Figur 3 eine auseinandergezogene Darstellung eines Plattenwärmetauschers; und

Figur 4 schematisch zwei mögliche Einsätze, durch die die Oberfläche, die für das Zellwachstum zur Verfügung steht, vergrössert werden kann.

In Fig. 1 ist eine Ausführungsform einer Einrichtung gezeigt, um eine einschichtige Gewebekultur zu erhalten, und zwar unter Verwendung eines Plattenwärmetauschers 1A und 1B als biologischer Reaktor mit grossem Flächenbereich. Wie es bei einem Plattenwärmetauscher 1A und 1B normal ist, enthält dieser einen Stapel von z.B. gewellten Platten (nicht dargestellt), welche in vorbestimmter Flächenabstandsbezie-hung stehen. Um eine Verankerung der Zellen zu gewährleisten, besitzen die Platten Kontaktpunkte zwischen benachbarten Platten. Diese können entweder durch sich kreuzende und aneinanderliegende Wellungen in den Platten gebildet werden, oder indem man örtlich Vorsprünge auf den Wellungen oder dgl. vorsieht, welche normalerweise die gegenseitige Plattenabstützung gewährleisten. Diese Kontaktpunkte liefern eine sichere Verankerung, von welcher aus die Zellen sich über die Plattenfläche bei ihrem fortschreitenden Wachstum ausbreiten können.

Ein Vorratstank 2 für ein ernährendes Wachstumsmedium mit einem Auslass 3 ist an eine Pumpe 4 angeschlossen, die das Medium vom Tank 2 über einen Satz von Strömungsräumen (bei 43 gezeigt) des Wärmetauschers 1 leitet. Vom Wärmetauscher 1 aus kann das Medium zurück über eine Entgasungsvorrichtung 6 und eine Rückführungsleitung 27 zum Tank 2 geführt werden.

Zwischen der Pumpe 4 und dem Wärmetauscher 1A und 1B ist eine Injektionsleitung 8 vorgesehen, die verwendet werden kann, um Luft oder Sauerstoff in den Kreis einzuführen. Eine Abzugsleitung 28 ist stromab der Pumpe 4 vorgesehen. Ein Vorratstank 5 liegt parallel zum Tank 2, um ein zweites Medium durch die Pumpe 4 durch den Wärmetauscher 1A und 1B zirkulieren zu lassen. Das Medium wird dem Tank 5 über die Leitung 42 zugeführt.

Dampfeinlässe 9 bis 16 sind dazu vorgesehen, um an Ort und Stelle eine Dampfsterilisation des Systems vornehmen zu können. Dazu gehören die Kondensatleitungen 17 bis 26. Die Entgasungsvorrichtung 6 kann beispielsweise in Form eines Vakuumkessels ausgebildet sein. Sie dient dazu, Luft und/ oder Kohlendioxyd und/oder andere Gase aus dem zirkulierenden Medium zu entfernen, um so eine aerobe bakterielle

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Verunreinigung zu vermeiden. Gleichzeitig können dadurch auch Abfallprodukte des Zellenwachstums innerhalb der Wärmetauscher 1A und 1B entfernt werden. Die Luft oder das abgezogene Kohlendioxydgas können durch einen Sterili-sierungsfilter 7 entfernt werden, so dass verhindert wird, dass pathogene Organismen in die Umgebung gelangen.

Wenn keine Entgasungsvorrichtung erforderlich ist, kann die überschüssige Luft vom Injektionspunkt 9 einfach durch Entlüften des Tankes 2 über einen Filter 29 abgeleitet werden.

Die Instrumentation für die Steuerung des Prozesses umfasst ein pH-Messgerät 30, ein Druckmessgerät 31 und ein Temperaturmessgerät 32. Das pH-Messgerät 30 steuert die Injektion von zur Korrektur dienenden Säuren oder Alkalistoffen über eine Leitung 33. Das Druckmessgerät 31 steuert ein Druckventil 34.

Die Strömungsräume, die zwischen jenen verbleiben, die durch das zirkulierende Medium besetzt sind, sind an einen Wärme- oder Kühlwasserkreis angeschlossen, dem eine Pumpe 35 angehört. Das Wasser kann beispielsweise durch einen Wärmetauscher 36 geleitet werden, wo es durch Dampf erhitzt wird. Dieser wird über eine Leitung 37 und ein Ventil 38 zugeleitet, welches durch das Temperaturmessgerät 32 gesteuert wird. Wenn eine Kühlung gewünscht wird, kann frisches oder selbst gekühltes Wasser über eine Leitung 39 zur Verfügung gestellt werden, welches durch den Wärmetauscher gepumpt und dann durch ein Ablaufventil 40 abgeleitet wird.

Vor Betriebsbeginn muss die dargestellte Einrichtung sterilisiert werden. Dies kann entweder durch chemische Sterilisationsmittel oder vorzugsweise durch Dampf bei einer Temperatur von 121 °C und für die Dauer von 30 Min. erfolgen. Hierzu dienen die Dampfeinlässe 9 bis 16.

Ein steriles Wachstumsmedium, das die geeigneten Impfstoffe für die betreffende Zell-Linie enthält, kann dann auf aseptische Weise in den Tank 2 eingeführt werden. Dieses Impfmittel kann in genügender Menge in den Plattenwärme-tauscherabschnitt 1A eingeleitet werden, um den Raum des Plattenwärmetauschers 1A auszufüllen und die Plattenober-flächenbereiche zu überfluten. Alternativ kann auch ein steriles Wachstumsmedium von Tank 2 eingeführt werden, wobei die Impfung mit der entsprechenden Zell-Linie dadurch erfolgt, dass das Impfmaterial an der Injektionsöffnung 44 eingeleitet wird. Sterile Luft oder Sauerstoff können durch den Impfstoff vom Injektor 8 in Blasen hindurchgeleitet werden, falls dies erforderlich ist. Alternativ dazu kann das Impfstoffmaterial auch in beide Abschnitte des Wärmetauschers 1A und 1B eingebracht werden. Aufgrund der gewellten Natur der Platten setzen sich die Zellen des Impfstoffes in natürlicher Weise auf den horizontalen Komponenten der Plattenoberfläche ab. Damit ist keine Reorientierung oder Zellenanbringungsmechanismus notwendig, wie dies bei flachen Platten oder Scheiben notwendig sein kann. Die vielen Kontakte zwischen den Platten oder den Vorsprüngen liefern eine sichere Verankerung, von denen aus die Zellen sich über die Plattenoberflächen ausbreiten können. In jeder Ausführungsform, die einen Einsatz in einem oder in mehreren Strömungsräumen umfasst, werden sich die Zellen ebenso an den Flächen der Einsätze festlegen.

Nachdem die Zellenhaftung erreicht ist, kann das Impfmedium abgezogen werden. Das System wird dann erneut mit frischem Medium beladen, welches dann durch die Abschnitte 1A oder die Abschnitte 1A+ 1B rezirkuliert wird, so dass die anhaftenden Zellen bis zu der erforderlichen Dichte wachsen können. Luft oder Sauerstoff kann durch die Öffnung 8 bei Bedarf injiziert werden. Die Vorrichtung 6 zum Entfernen von Luft oder CO2 kann aktiviert werden, um eine aerobe bakterielle Verunreinigung zu verhindern und die Abfallprodukte des Zellenwachstums abzuführen. Das

Medium wird dann zu dem Tank 2 zurückgeleitet.

Während der Zellenwachstumsphase müssen die Bedingungen der Kulturen auf optimalem Niveau gehalten werden. Die sterile Luft, die über Injektor 8 eingeleitet wird, muss 5 genau kontrolliert werden, ebenso wie der pH-Wert des Mediums. Die Luft oder der Sauerstoff werden in das zirkulierende Medium gelöst. Eine sehr genaue Temperaturkontrolle kann durch Zirkulieren von warmem oder kaltem Wasser auf der Serviceseite 41 der Platten unter Verwendung 10 einer Pumpe 35 erhalten werden.

Wenn nur der Abschnitt 1A als Impfabschnitt des Plattenwärmetauschers verwendet wird, kann man die Zellen dann, wenn das Zellenwachstum beendet ist, durch Abziehen des Wachstumsmediums und Füllen des Systems mit Trypsin-15 Lösung entfernen, durch die die Zellen von den Plattenoberflächen gelöst werden. Dabei kann man die Strömungsgeschwindigkeit vergrössern, um Turbulenz zwischen den Strömungsplatten des Abschnittes 1A zu erhalten, um so das Lösen der Zellen von den Plattenflächen zu unterstützen. Die 20 Zellensuspension kann dann in beide Abschnitte 1A und 1B des Plattenwärmetauschers eingeleitet werden, um so die Zellen durch Einfliessenlassen auf den gesamten zur Verfügung stehenden Flächen der Platten einzuleiten. Nachdem die Zellen wieder an den Platten haften, kann die Trypsinlösung 25 abgezogen werden. Das System kann dann erneut mit einem Wachstumsmedium gefüllt werden. Die Prozedur wird dann wiederholt, bis das Zellenwachstum vollständig ist. Es ist dann möglich, irgendein weiteres auslösendes Mittel einzuleiten, z.B. einen Virus oder einen Zusatzstoff wie Natrium-30 butyrat, um die Interferon-Produktion zu stimulieren.

Das Entfernen der extrazellularen Produkte wird durch vollständiges Abziehen des Mediums vom System erreicht.

Wenn die Zellen selbst geerntet werden sollen, wird dieselbe Prozedur wie zuvor beschrieben ausgeführt und 35 schliesslich die Zellensuspension endgültig über die Leitung 28 abgeleitet.

Eine Alternative zur Injektion von Luft oder Sauerstoff zu Belüftungszwecken besteht darin, das Medium mit Sauerstoff zu übersättigen, wie dies in der GB-Patentanmeldung 40 203 47 50A beschrieben ist.

In Fig. 2 ist eine weitere Ausführungsform der Einrichtung zum Züchten von Zellen unter Verwendung eines Plattenwärmetauschers 50 gezeigt.

Ein Vorratsbehälter 51 für ein Wachstumsmedium ist mit 45 einer Rühreinrichtung 52, einem Temperaturfühler 53 und einem Fühler 54 für den pH-Wert ausgerüstet und kann mit Hilfe von Dampfinjektion durch die Öffnung 56 sterilisiert werden. Das Wachstumsmedium kann dem Behälter durch die Öffnung 55 zugeleitet werden. Korrekturen des pH-Wer-50 tes und der anderen Grosse kann über eine Zusatzöffnung 74 erfolgen.

Ein Dreiwegeventil 57 verbindet den Vorratsbehälter 51 mit einer für eine Erntelösung bestimmten Einlassöffnung 58 und mit einer Pumpe 59. Diese Pumpe zirkuliert das Wachs-55 tumsmedium vom Vorratsbehälter an der Einlass- und der Auslassöffnung 60 vorbei in die Prozessströmungsräume 61 des Wärmetauschers. Das Wachstumsmedium wird dem Vorratsbehälter über einen Strömungsmessteil 62 zurückgeführt.

Der Kopfraum des Behälters 51 kann durch eine Leitung 60 63 über eine Strömungsmesseinrichtung 64 in zugemessener Weise begast werden. Ein Sterilisationsfilter 65 kann in die Begasungsleitung 63 eingefügt sein. Proben können an einer Probeentnahmeöffnung 70 abgezogen werden.

Die Prozessströmungsräume des Wärmetauschers werden 65 durch Dampf sterilisiert, der durch eine Öffnung 68 zugeführt und als Kondensat durch eine Öffnung 69 abgeführt wird.

Ein Impfstoff wird normalerweise durch eine Öffnung 60 in das System eingeführt, um die Prozessströmungsräume 61

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des Wärmetauschers 50 zu füllen. Die Temperatur der Pro-zess- und der Hilfsflüssigkeiten kann mittels der Fühler 66 und 67 überwacht werden. Überschüssige Gase in dem System können durch den Sterilisationsfilter 71 abgelassen werden. Die Hilfsflüssigkeit zirkuliert in den Strömungsräumen 72 und kann gekühlt oder erhitzt werden, und zwar durch eine Einheit 73.

Die Vorteile beider dieser Systeme umfassen:

1. Eine ausgedehntere Oberfläche für das Zellwachstum bei kleinem Volumen, bis auf maximal 1500 m2.

2. Gewellte Oberflächen liefern eine gute Zellenhaftung.

3. Die Flächengrösse kann leicht durch Wegnehmen und Zufügen von Platten verändert werden.

4. Eine gute Verfahrenssteuerung ist möglich aufgrund des geringen Füllvolumens für das Medium und die Rezirku-lierungsströmung.

5. Eine rasche Ausgleichung der Temperatur gestattet eine Optimierung der Produktbildung und eine Minimierung der Zellverluste während der Überführung zwischen Anzucht und Produktionsstadium.

6. Es werden aseptisches Wachstum und Produktgewinnung gewährleistet.

Es wird nun Bezug genommen auf Figur 3. Diese zeigt in auseinandergezogener Darstellung einen Plattenwärmetauscher. Bei diesem sind die Platten 80 und 84 zwischen einem Kopf 81 und einem Nachfolgestück 82 zusammengedrückt. Ein Anschlussstück 83 kann dazu verwendet werden, die Strömung der Prozessflüssigkeit und der Hilfsflüssigkeit über die Platten 80 und 84 zu trennen, wodurch effektiv zwei Wärmetauscher innerhalb des gleichen Rahmens zu liegen kommen.

Durch Anwendung einer im wesentlichen ähnlichen Anordnung kann die Strömung von Nährstoff durch den Abschnitt 80 (AI in Fig. 1), wie sie gestrichelt in Fig. 3 angedeutet ist, von der Strömung des Nährstoffes durch den Abschnitt 84 (1B in Fig. 1), wie er mit ausgezogener Linie in Fig. 1 angedeutet ist, getrennt werden, während die Hilfsflüssigkeit, die in strichpunktierten Linien gezeigt ist, durch beide Abschnitte 80 und 84 fliesst.

Figur 4 zeigt einige mögliche Einsätze, die zwischen den Platten der Prozessströmungsräume eingesetzt werden können, um die für das Zellenwachstum erforderliche Fläche ver-grössern zu können.

Die perforierte Metallplatte 90 weist Öffnungen 91 auf, in welche die Kontaktpunkte der benachbarten Platten, welche die Strömungsräume umgrenzen, eingreifen können. Die Platte selbst kann beispielsweise aus rostfreiem Stahl, Titan oder anderem geeigneten Metall bestehen.

Das Gitter 92 kann aus einem Drahtgitter aus rostfreiem Stahldraht oder aus Polypropylen bestehen. Zum Säubern werden die Zellen von den Platten und/oder Einsätzen in der Weise entfernt, wie dies zuvor beschrieben wurde, und aus dem System ausgewaschen. Danach folgt eine Säuberung und Sterilisation durch Dampf. Ein Anbrennen wird so vermieden.

Um das Verständnis der Erfindung noch zu verbessern, sind folgende Beispiele angegeben.

Beispiel 1

Die zuvor beschriebene Vorrichtung weist eine zur Verfügung stehende Fläche für die Zellkulturen von 2 m2 auf, die durch 24 Platten aus rostfreiem Stahl gebildet wird. Diese Anordnung wurde zum Züchten von menschlichen Fibroblasten verwendet, und zwar wie folgt:

Der Wärmetauscher und die Teile des zugehörigen Rohrwerkes, welche den Wärmetauscher mit dem Vorratsbehälter für das Wachstumsmedium verbinden, wurden durch direkte Injizierung von Dampf bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 für die Dauer von 60 Min. sterilisiert. Der Behälterkessel, bestehend aus einem Fermentationskessel aus Glas und rostfreiem Stahl mit einer Kapazität von 3 1, der zusammen mit den übrigen Rohren und der Pumpe zum Zirkulieren des Wachstumsmediums verwendet wird, wurde durch einen Autoklavenpro-zess für die Dauer von 140 Min. bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert.

Der Wärmetauscher wurde durch Passieren von kaltem Wasser durch die Mantelseite abgekühlt. Danach wurde die Temperatur im Bereich von 36-37 °C durch Zirkulieren von Wasser von kontrollierter Temperatur durch die Mantelseite stabilisiert. Das Reservoir, das restliche Rohrwerk und die Pumpe wurden dann mit dem Wärmetauscher aseptisch verbunden.

Ein Impfmittel von 1,8 x IO8 MRC aus menschlichen Fibroblastzellen, die in 2,7 1 Wachstumsmedium suspendiert waren, wurde dann aufwärts in die Zellenkulturkammer des Wärmetauschers eingeführt, bis die Kammer vollständig gefüllt war. Das verwendete Wachstumsmedium war Eagle's-Medium, welches Earle's-Salze enthält und wurde mit 8% Ochsenserum, nicht wesentlichen Aminosäuren und Penicil-lin/Streptomycin ergänzt. Das Medium wurde mit 2,2 g Natriumbikarbonat pro Liter gepuffert, mit 5% Kohlendioxyd in Luft überlagert und enthielt als pH-Indikator Phenorot.

Zusätzliche 3,1 1 Wachstumsmedium wurden in den Vorratsbehälter auf aseptische Weise eingeleitet. Der Inhalt wurde umgerührt, der Kopfraum des Behälters mit 5% Kohlendioxyd in Luft begast und der Inhalt auf 37 °C erhitzt und auf dieser Temperatur gehalten.

Man Hess dann das System ungestört bei 3 °C für die Dauer von 24 Std. ruhen, so dass die Zellen sich an der Oberfläche der Wärmetauscherplatten ansetzen konnten.

Am Ende der Haftungsperiode wurde das Wärmewachstumsmittel in dem Kreis zirkuliert, der den Vorratsbehälter, die Pumpe, die Kulturseite des Wärmetauschers enthielt, mit einer Geschwindigkeit von 100-130 ml pro Min. für die Dauer von 7 Tagen, derart, dass die Strömung nach oben durch den Wärmetauscher erfolgt, während gleichzeitig Wasser durch die Mantelseite geleitet wurde. Das Wachstumsmedium wurde dann vollständig aus der Vorrichtung abgezogen und 5,8 1 frisches Wachstumsmedium aseptisch eingeführt. Das frische Wachstumsmedium wurde mit einer Geschwindigkeit von 130-280 ml pro Min. für die Dauer von weiteren drei Tagen zirkuliert.

Danach wurde die Zirkulation des Wachstumsmediums gestoppt. Mit Phosphat gepufferte Salzlösung (3 1) wurde eingeleitet, um das Wachstumsmedium nach unten durch den Wärmetauscher zu verdrängen. Die phosphatgepufferte Salzlösung wurde dann wiederum durch 0,25%iges Trypsin in phosphatgepufferter Salzlösung (1 1) ersetzt. Die Zellkulturkammer wurde vollständig entleert und bei einer Temperatur von 36-37 °C gehalten, und zwar indem man Wasser durch die Mantelseite leitete. Dies geschah für die Dauer von 1 Std. Drei aliquote Teile (21) von serumfreiem Wachstumsmedium wurden dann in der Folge aufwärts in die Zellkulturkammer geleitet, wobei eine Mischung aus 5% Kohlendioxyd in Luft durch jedes Aliquot pulsiert wurde, bevor die Füllung aus der Kammer abgezogen und die nächste aliquote Menge zugeführt wurde.

Die Zahl der Zellen, die geimpft und geerntet wurde, wurde bestimmt durch einen Coulter-Zähler und mit einem Hämozytometer überprüft.

Gesamtheit der geimpften Zellen 1,8 x 108

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1. im abgezogenen Wachstumsmedium 2,2 x 106

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3. pulsiertes serumfreies Medium 29,1 x IO8

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Beispiel 2

Unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 wurden menschliche Fibroblaste wie folgt gezüchtet:

Ein Wärmetauscher mit 24 Platten aus rostfreiem Stahl und einer für die Zellenkultur zur Verfügung stehenden Fläche von 2 m2 wurde mit 1,35 x IO8 MRC 5 menschlichen Fibroblastzellen geimpft. Die Zellen wurden als Suspension in dem Wachstumsmedium eingeführt, welches das notwendige Minimum an Medium (Eagle) mit Earle's-Salzen umfasst und mit 8% Ochsenserum, nicht essentiellen Aminosäuren, Penicillin/Streptomycin und 2,2 g/1 Natriumbikarbonat ergänzt worden war.

Der geimpfte Behälter wurde bei 35 °C für die Dauer von 17,5 Std. so gehalten. Das Volumen des Wachstumsmediums wurde vergrössert auf 5,8 1 und das Wachstumsmedium wurde dann durch die Zellenkulturkammer mit einer Geschwindigkeit von 100-200 ml pro Min. für die Dauer von 5 Tagen zirkuliert. Die Strömung erfolgte durch den Wärmetauscher von unten nach oben und im Gegenstrom zu der Strömung des Wassers durch die Mantelseite. Das Wachstumsmedium wurde abgezogen und ersetzt durch 5,8 1 frisches Wachstumsmedium, das weitere 5 Tage zirkuliert wurde. Das zirkulierende Medium wurde bei einer Temperatur von 34-36 °C gehalten und durch Passieren von 5% Kohlendioxyd in Luft durch den Kopfraum des Vorratsbehälters mit Sauerstoff beladen; pH des Wachstumsmediums wurde durch Zugabe von Natriumbikarbonat auf dem gewünschten Wert gehalten.

Das Wachstumsmedium, das von den Zellkulturkammern 5 entnommen wurde, wurde mit durch Phosphat gepufferter Salzlösung ergänzt und die Zellen für die Entnahme von den Wachstumsflächen durch Waschen mit 0,25% Trypsin, gelöst in mit Phosphat gepufferter Salzlösung, vorbereitet. Nachdem alle Lösungen von der Zellenwachstumskammer abgezogen io worden war, wurden die Zellen bei 35-37 °C für 1,5 Std. in Gegenwart von restlicher Trypsinlösung gehalten. Die Zellen wurden von der Einrichtung mit drei aliquoten Mengen eines serumfreien Wachstumsmediums entfernt, welches durch Injizierung von 5% Kohlendioxyd enthaltende Luft aufge-15 rührt wurde, während die aliquote Menge jeweils in der Zellenkulturkammer gehalten wurde.

Gesamte geimpfte Zellenzahl

1,35

X

10s geerntete Zellen

2o 1. im abgezogenen Wachstumsmedium

1,2

X

106

2. in der gepufferten Waschsalzlösung

1,5

X

10"

und in der Trypsin-Lösung

3. in dem pulsierten serumfreien Medium

16,1

X

108

insgesamt

16,2

X

108

25

Weitere Überprüfungsvorrichtungen, wie Analysierungs-geräte für Glukose, gelösten Sauerstoff und Kohlendioxyd können verwendet werden.

G

2 Blatt Zeichnungen

Claims (15)

1. 653 702

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zum Züchten von Zellgewebe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen auf den Platten eines Plattenwärmetauschers absetzen und ein Wachstumsmedium in kontinuierlicher Zirkulation durch die zwischen den Platten definierten Strömungsräume passieren lässt.
2. 2. Verfahren zur Gewinnung eines viralen Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, dass man Zellen auf den Platten eines Plattenwärmeaustauschers absetzen und ein Wachstumsmedium in kontinuierlicher Zirkulation durch die zwischen den Platten definierten Strömungsräume passieren lässt, und dem zirkulierenden Wachstumsmedium während seiner Zirkulation einen Virus zufügt.
3. 3. Verfahren zur Gewinnung einer biologisch aktiven Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass man Zellen auf den Platten eines Plattenwärmeaustauschers absetzen und ein Wachstumsmedium in kontinuierlicher Zirkulation durch die zwischen den Platten definierten Strömungsräume passieren lässt, und die biologisch aktive Substanz extrahiert.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Luft oder Sauerstoff in dem zirkulierenden Wachstumsmedium bei seinem Eintritt in den Wärmetauscher gelöst wird.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Luftsauerstoff oder Kohlendioxyd aus dem Wachstumsmedium nach dessen Verlassen des Wärmetauschers entfernt werden.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass lediglich abwechselnde Strömungsräume für die Züchtung von Zellgewebe und die dazwischenliegenden Strömungsräume für die Zirkulation von Wasser oder einem anderen Medium bei kontrollierter Temperatur ausgenutzt werden.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine ausgewählte Variation in der wirksamen Fläche, auf der tierische Zellgewebe gezüchtet werden, dadurch erhalten werden, dass man die Impfkultur und das Wachstumsmedium durch ausgewählte Strömungsräume des Wärmetauschers umleitet.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Geschwindigkeit der Impfkultur und des Wachstumsmediums im wesentlichen in allen Strömungsräumen konstant gehalten wird.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die wirksame Fläche, auf der die Zellgewebe gezüchtet werden, durch Einfügen eines Einsatzes in einen oder mehreren Prozess-Strömungsräumen des Wärmetauschers vergrössert wird.
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man das Haften der Zellgewebe an den Flächen der Prozess-Strömungsräume durch eine Vorbehandlung dieser Flächen verstärkt.
11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Haftung der Zellgewebe an den Flächen des Prozess-Strömungsraumes durch eine Vorbehandlung dieser Flächen vermindert.
12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,

    dadurch gekennzeichnet, dass man eine Doppeldichtung einsetzt.
13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,

    dadurch gekennzeichnet, dass man die Zerstörung der an der Oberfläche haftenden Zelle an Ort und Stelle ausführt.
14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13,

    dadurch gekennzeichnet, dass man die Zusammensetzung des Impfmediums und des Wachstumsmediums, die Temperaturen des Verfahrens, der Hilfsflüssigkeiten und die Strömungsgeschwindigkeit mit Hilfe elektronischer Steuermittel überwacht und kontrolliert.
15. 15. Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch einen Plattenwärmetauscher (1 A, 1B), Mittel (35) zum Zirkulieren eines Temperatursteuermediums durch einen Satz von Strömungsräumen (41) des Wärmetauschers (1), Mittel (4) zum Zirkulieren eines Wachstumsmediums durch den anderen Satz von Strömungsräumen (43), Mittel (6) zum Entfernen von Gasen aus dem zirkulierenden Wachstumsmedium, nachdem dieses den Wärmetauscher (1) verlassen hat, Mittel (8) zum Injizieren von Luft oder Sauerstoff in das zirkulierende Wachstumsmedium, sowie durch Mittel (44) zum Injizieren eines Impfmediums in das zirkulierende Medium und durch eine Instrumenteneinrichtung (30,31,32) zum Messen der Arbeitsparameter zur Kontrolle des Verfahrens.