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Verfahren zur Gewinnung von Enzymen und Toxinen mit Hilfe von Bakterien.
Es ist belcannt, aus bestimmten Bakterien und Schimmelpilzen Eiweiß oder Stärke
verflüssigende bzw. verzuckeräde Enzyme herzustellen, indem man die betreffenden
Organisinen an der Oberfläche von stickstoffreichen Nährlösungen oder an der Oberfläche
von gedämpften,' stickstoffreichen Stoffen (Bohnen oder Kleie) unter gleichzeitiger
Luftzufuhr züchtet. Als stickstoffreiches Material zur Züchtung derartiger Organismen
werden bekanntlich auch häufig Sojqbohiien verwendet.
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Das den Gegenstand der Erfindung bildende Verfahren bezweckt ebenfalls
die Züchtung von aeroben Bakterien auf stickstoff-und kohlenhydrathaltigem Material
und die Gewinnung von Enzymen sowie von Toxinen aus diesen Bakterien im großen.
Die Bedingungen, unter welchen die Züchtung vorgenommen wird, sind jedoch wesentlich
verschieden von denen, welche zur Zeit in Anwendung gebracht werden. Man erhält
dabei das gewünschte Produkt infolge der besonderen Arbeitsweise, der Apparatenanordnung
und der den Bakterien gewährten Bedingungen direkt, ohne zu einer Füllung oder einer
Verdampfung der Lösungen Zuflucht nehmen zu müssen, in einem solchen Konzentrationsgrad,
daß es eine gleiche oder sogar höhere diastatische Kraft besitzt als die Produkte,
welche man bisher nur unter Verdampfung enzyrnhaltiger Auszüge vegetabilischen Ursprungs,
wie beispielWeise von Malzextrakten, erhalten konnte.
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Bei. der Verflüssigung der stärke- -und stickstoffhaltigen Substanzen
bei Gegenwart von Alkali vermittels Bakterien haben sich eine Reihe Schwierigkeiten
ergeben, wenn es sich darum handelt, den Laboratoriumsversuch in den Großbetrieb
zu übertrageh.
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Diejenigen Bakterien, welche in den kleinen Laboratoriumsapparaten
genügend aktive Lösungen gaben, sonderten keine Enzyme ab, wenn man sie in Kulturapparate
von größeren Abmessungen übertrug.
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Das Studium des Einflusses von Metallen auf die Bildung von Enzymen
durch Bakterien- hat gezeigt, daß die Vermehrung der a#robischen Bakterien, welche
auf an stickstoffhaltigen Stoffen reichem Nährboden wachsen, durch die Anwesenheit
von bestimmten Metallen um so mehr gehemmt wird, je
bedeutender die Menge
des den Bakterien gelieferten Sauerstoffes ist, und daß bei sonst ganz gleichen
Bedingungen die Bildung von Enzymen mit der Natur der Metalle wechselt, in deren
Gegenwart die Kultur gezüchtet wird.
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So hat eine Serie von 96stündigen Kulturen auf einer ioprozentigen
Würze von Soja in Berührung mit verschiedenen Materialien die folgenden verflüssigenden
Kräfte gezeigt: I
ioo in Glas, 33 in verzinntem Eisen,
25 in galvanisiertem Eisen, 25 in verzinntem Kupfer, 14 in Eisen,
12 in Rohkupfer, 3 bei Gegenwart von Rohkupferspänen, ioo in ernaillierten
Metallen, ioo in Aluminium.
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Außerdem ist gefunden worden, daß man, um mit den verschiedenen Bakterien
stärke-oder eiweißlösende Enzyme zu erhalten, Nährstoffe wählen muß, welche sehr
reich an Stickstoff und verhältnismäßig arm an Kohlenhydraten sind.
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Wenn man z. B. zum Vergleich die Bakterien auf einer ioprozefitigen
Würze von Reis, Mais, Kartoffeln oder Gerste einerseits und auf einer ioprozentigen
Würze aus Ölkuchen von Soja anderseits züchtet, so findet man, daß die Würze von
Soja fünf- bis zehnmal mehr Diastasen ergibt, als die erstgenannfen Substanzen.
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Außerdem wurde festgestellt, daß die diastasische Kraft proportional der
Menge des in den Rohmaterialien enthaltenen assimilierbaren Stickstoffs ist, daß
alle Rohtnaterialien, die nur einen Teil Stickstoff ungefähr auf höchstens
35 bis 45 Teile Kohlenhydrate enthalten, wenig aktive Enzymlöstingen ergeben,
und daß in diesen Lösungen die Ausscheidun-'der Enzyme vdrzö,-ert wird. Im Gegensatz
hierzu geben die Rohmaterialien, welche einen Teil Stickstoff auf io bis 15 Teile
Kohlenhydrate enthalten, an Enzymen sehr reiche Lösungen. Solche Rohmaterialien
sind z. B. die Soiabohne und besonders die Kuchen von entöltem Soja; man kann auch
eiweißhaltige pflanzliche oder tierische Stoffe anwenden (Kaseine, Maisfibrin usw.).
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Eine Anzahl von an der Luft lebenden Mi# kroben gedeiht sehr schlecht
in der Tiefe von Nährlösungen, selbst wenn diese dauernd von einem starken Luftstrom
durchzogen werden, und sie geben unter diesen Bedingungen saure Lösungen, welche
sehr wenig Enzyme enthalten. In direkter Berührung mit der Luft gezüchtet, geben
dieselben Bakterien im Gegenteil alkalische Lösungen, die viel Enzyme enthalten,
wenn der Nährboden genügend reich a.n Stickstoff ist.
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Die Kulturmethocle und die Vorrichtungen, welche nachstehend beschrieben
sind, lassen sich auf alle Pilze verwenden, welche die beiden obengenannten Eigenschaften
besitzen; beispielsweise auf B. subtilis, B. niesentericus, Getreidebrandarten,
Käsebakterien u. dgl.
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Um eine gute Enzymbildung zu erzielen, ist es notwendig, die Bedingungen
so zu wählen, daß die Pilze auf der Oberfläche der-Flüssigkeit wachsen, uncl es
ist wesentlich, daß die Kulturen auf der Oberfläche -der Flüssigkeit bleiben
und einen Schleier bilden. Für diejenigen Arten der Bakterien, welche schwierig
einen Schleier bilden, ist es vorteilhaft, sie auf der Oberfläche einer konzentrierten
Maische oder einer solchen, welche feste Bestandteile enthält, zu züchten. Die direkte
Berührung der Bakterien mit der Luft ist notwendig, denn die Lüftung der in der
Flüssigkeit untergetauchten Bakterien ergibt, wie gesagt, keine gute Enzymausbeute.
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Am Anfang ist es zweckmäßig, viel Luft züi "-eben; wenn aber der Schleier
anfängt, sich zu verdichten, ist es angebracht, die Lüftung genau 01 auf das notwendige
Mindestmaß herabzusetzen -. damit der Gehalt an Enzymen sich nicht vermindert.
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Die Lüftung an der Oberfläche muß in der Weise geschehen, daß die
Kohlensäure nach Bedarf entweichen kann, und der Kulturapparat muß derart eingerichtet
sein, daß man die Lüftung einstellen kann, wenn die Analyse des entweichenden Gases
anzeigt, daß es nicht zu viel Kohlensäure enthält. Um die Lüftung am Ende der Kultur
vermindern zu können, drückt man die Luft von oben nach unten.
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Die Kulturen, welche vollständiger Ruhe überlassen werden, scheiden
ihre Enzyme langsam in die Nährlösung ab; die Erzeugung und Ausscheidung
kann aber beschleunigt werden, wenn man die - Kulturen in eine schwache mechanische
Bewegung (Erzitterung) versetzt, die deraftig sein muß,- daß ein Untersinken der
Pilzdecken vermieden wird. Man begünstigt auf diese Weise die Diffusion der aktiven
Substanzen und das Zubringen von neuen Nährs'toffeh.
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Ferner wurde 'erkannt, daß durch Verdampfen der Lösungen, welche die
nach dem neuen Verfahren hergestellten Enzyme enthalten, eine Vermehrung ihrer enzyrnatischen
Wirksamkeit hervorgebracht wird. Wenn man bei spielsweise mit einer Lösung arbeitet,
von der i g 2oo g Stärke zu verflüssigen vermag, so ergibt sich, daß
i g dieser selben Lösung nach dem Eindampfen bis zur Sirupdicke
300 bis 4009'Stärlce zu verflüssigen vermag.
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Diese neu festgestellten Kulturbedingungen haben dazu geführt, zur
Ausübung des neuen Verfahrens im großen besondere Apparate zu -konstruieren, mit
deren Hilfe es gelingt, den Bakterien . alle Bedingungen zu gewähren, welche
nötig sind, um die größtmögliche enzymatische Kraft zu entwickeln.
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Es versteht sich von selbst, daß die Form des Apparates wechseln kann'.
Das Ergebnis wird ein um so besseres sein, je genauer man sich den oben angegebenen
Bedingungen anpassen wird,
Wenn es sich um'umfangreiche Einrichtungen
handelt, gibt man den folgenden Anordnungen den Vorzug, welche gestatten, große
Mengen von verflüssigende - n Enzymen zu bereiten, ohne wesentliche Abhängigkeit
von Handarbeit,.da die Füllung, die Leerung und die Reinigung der Apparate sich
mechanisch durch Zentrifugalkraft bewerkstelligen lassen.
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Es soll hier als Beispiel die Anordnung beschrieben werden, welche
am meisten geeignet ist und am zuverlässigsten die Züchtung von Reinkulturen gewährleistet.
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Diese Apparate sind in Fig. i der Zeichnung im Aufriß, teilweise im
Schnitt, und in Fig. 2 im Grundriß dargestellt.
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Mit i ist ein Sterilisierautoklav bezeichnet, der genügend druckfest
sein muß. Derselbe ist versehen mit einem Dampfrohr --, welches zu gleicher
Zeit als E, litleertingsrohr dienen kann, mit einem Stutzen 3, welcher einen
Hahn zum Einbringen der Aussaat trägt, und mit einem zweiten Stutzen 4, welcher
das Sicherheitsventil 5, das - Manometer 6 und einen Reinigungshahn
7 trägt. Der Autoklav enthält ein Rührwerk mit Handantrieb.
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Bei 8 befindet sich ein Wattefilter, um die Druckluft keimfrei
zu machen, welche bei 9
eintritt; die Hähne i cr und i i öffnen den Dampfzutritt;
Hahn i i trägt einen kleinen Reinigungshahn i?,. Bei 13 ist ein Hahn, welcher
abwechselnd zum Einleiten von Dampf und reiner Luft dient; er steht in Verbindung
mit dem Luftbefeuchter 14 und durch das Luftrohr 16 mit dem Kulturapparat 15;
17 und 18 sind zwei Hähne, welche zur Sterilisation der Würze in i notwendig
sind.
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Der Kulturapparat 15 hesteht aus einem Aluminiumgehäuse (von
einem Durchmesser von i bis'i,6o in), welches unter einem Überdruck von i Atm. sterilisiert
werden kann; er ist an seinem oberen Teil mit 'einem Stutzen versehen, an welchen
das Einlaßrohr 2 angeschlossen ist, und mit einem weiteren Stutzen, welcher mit
dein Lufteinlaßrohr 16 verbunden ist. -Dieses Rohr 16 trägt ein Sicherheitsventil
und ein Manometer. Der Kulturapparat besitzt an seinem unteren Teil einen Aluminitimstutzen
ig, welcher mit einem Hahn 2-o und einem Rohr 2 1 verbunden ist, das in einen Wassereimer.22
eintaucht.
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Das Gefäß i# ist mit einem Stopfbüchsendeckel versehen, der
einen Antrieb für die senkrechte, in einem Zapfenlager 24 ruhende Achse
23 trägt. Dieser Antrieb besteht beispielsweise aus einer Welle
33, welche vermittels einer Handkurbel 34 gedreht wird und durch die konisc'hen
Zahnräder 35, 36 in Verbindung mit der Achse:2#3 steht.
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Die Welle 23 trägt eine Reihe von Platten 25, welche
io bis 2o mm Abstand voneinander haben und durch zentrale Ringe 26 sowie
durch von Stangen:27 gehaltene Klötze getragen werden. Diese Klötze sied bei
28 zwischen zwei sehr kräftigen Widerlagsplatten festgeklemmt, so daß sie
die vollständig horizontale Lage der Platten sichern. Schließlich trägt jede Platte
einen Rand von etwa 5 mm Höhe, je nach der Schichth51le der Flüssigkeit,
welche man anzuwenden wünscht, und einen Überlauf 29.
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Um den Apparat zu füllen, verfährt man auf folgende Weise: Durch das
Mannloch des Korahers i führt man das Wasser und z. B. die Sojahuchen ein. Man bringt
die Masse zum Kochen, indem man Dampf durch io eintreten läßt, während die Stutzen
3 und 4 ganz und der Hahn 17 leicht geöffnet sind, um die Keimfreiheit
des oberen Teils des Rohrs 2, zu sichern. Zu gleicher Zeit läßt man Dampf durch
13, 14 und 16 in das Gefäß 15 einströmen, um dieses sowie den Hahn 2o, welcher
zuerst offen ist, und den Behälter 2:2, welcher leer ist, zu sterilisieren.
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Man erhitzt den Inhalt des Kochers bei einer Atmosphäre Überdruck
ungefähr 30 Minuten lang, indem man den Rührer dreht, damit die Sterilisation
der Maische. und die gleichmäßige Durchinischung vollständig wird.
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Unterdessen hat man das Gefäß 15 mit den Platten:25 und dein unteren
fast geschlossenen Hahn:2o unter Dampfdruck: fertig sterilisiert; man dreht hierauf
die Platten, so daß sie durch :2o das kondensierte 'Wasser ausschleudern, mit welchem
sie beladen -waren. Man ersetzt hierauf den Dampf durch keimfreie Luft unter Beobachtung
der von der Hefereinzucht her bekannten Vorsichtsmaßregeln.
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Den Sterilisator i setzt man unter den Druck der keimfreien Luft durch
den Hahn io. Durch Hahn 13 hindurch erzeugt man in 15 einen Überdruck von
i Atm. Den Autoklaven i kühlt man ab, indem man vermittels eines gelochten Rohrs
3o Wasser über den oberen Teil des Zylinders laufen läßt, und impft durch Stutzen
3 unter Beachtung der gewöhnlichen aseptischen Vorsichtsmaßregeln. Hierauf
kühlt man bis 35 oder 40' C ab, setzt das Kochgefäß i im
' ter einen Luftdruck von ungefähr 2 Atm. und läßt alsdann die '\#Türze nach
15 laufen, indem man das Ventil 7 leicht öffnet. ,
Um eine gute Verteilung
der Würze auf den Platten zu sichern, erteilt man den Platten eine leichte hin und
her gehende Bewegung.
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Wenn die Entleerung des Sterilisators bewirkt ist, hält man die Temperatur
in dem Saal, in welchem sich der Apparat 15 befindet, auf einer solchen Höhe, daß
die Thermometer 31 und 32 das Temperaturoptimum für die Entwicklung der in
Betracht kommenden Bakterienart angeben. Am Anfang läßt man
einen
ziemlich kräftigen Luftstrom einwirken, bis die Bakterien eine ununterbrochene Decke
auf der Oberfläche jeder Platte bilden. Um die Ketten der Bakterien auseinanderzureißen,
übt-nian mehrmals im Tage eine hin und her gehende Bewegung aus. Hierauf beschränkt
man die Luftzufuhr auf das Mindestmaß, die Alialvse des bei 2:2 austretenden Gases
-estattet es, sich Klarheit über den Ge-
halt an Sauerstoff zu verschaffen
und sich so zu überzeugen, daß eine genügende Menge desselben den Bakterien zur
Verfügung steht.
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Wenn die Kultur das ,Maximum an enzymatischer Kraft erreicht hat
- was man feststellen kann, indem man eine Probe bei ig abzieht -, dreht
man die Platten und entleert sie -durch Zentrifugalkraft unter Öffnen des Halines:2o.
Hierauf wäscht man das Gefäß mit Wasser, das in der gleichen Weise wie die Enzvinlösung
aus dem Apparat entfernt wird.
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15ie Anwendung der Zentrifugalkraft hat den Vorteil, daß man in einigen
Sekunden die Platten vollständig entleeren kann, und daß sie ferner durch einfaches
Einspritzen von Wasser auf eine so vollkommene Weise gereinigt werden können, daß
der Apparat niemals für Reinigungszwecke auseinandergenommen zu werden braucht,
und daß während der Sterilisation sich keinerlei Niederschlag bildet.
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Die Leerung durch Zentrifugalkraft ist auch deshalb wichtig, weil
beim Auseinandernehmen der ans weichem Metall, beispielsweise Aluminium, bestehenden
Platten diese sich leicht verbiegen und unbrauchbar -werden würden, da alsdann die
Flüssigkeit sich nicht mehr gleichmäßig auf der Fläche in dünner Schicht verteilen
könnte. Diese Entleerungsart vermeidet auch jede Handarbeit, welche mit der Auffüllung
und Entleerung von voneinander unabhängigen Platten verbunden sein würde. Ferner
würde auch diese Handarbeit sehr gefährlich sein in den Fällen, in denen es sich
um die Herstellung von Toxinen handelt.
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EineAbänderung des beschriebenenVerfahrens würde in der kontinuierlichen
Züchtung der Bakterien bestehen, wobei man den Apparät nach einer ersten Züchtung
mehr oder weniger vollständig leert und ihn dann, ohne ihn vorher mit Wasser zu
waschen, aufs neue mit Würze oder Maische füllt, so daß diese Füllung durch die
Bakterien, welche auf den Platten geblieben sind, geimpft wird.
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Mit Hilfe des neuen Verfahrens und bei Beobachtung der Regeln, welche
oben angegeben sind, erhält man in zwei bis drei Tagen Lösungen von äußerst kräftigen
Enzymen, von welchen z. B. :2oo bis 300 1 genügen, um ioo t Getreide zu verflüssigen.
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Die Vorteile des beschriebenen Apparates bestehen in der Einfachheit
seiner Bauart, in der Erzielung großer Oberflächen bei be, schränktern Raum, in
der Einfachheit- der Handhabung bei äußerst beschränkter Handarbeit.
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Der Apparat kann selbstverständlich in verschiedener Weise verändert
werden; es könnte z. B. der vertikale Zylinder 15 durch einen liegenden Zylinder
ersetzt werden; auch könnte die Art der Befestigung der Platten, je nachdem
man Emaille, Aluminium, Glas, Porzellan tisw. verwendet, eine verschiedene sein;
ferner könnte anstatt der Platten das ganze Gefäß 15 hin und her bewegt und gedreht
werden, um die Entleerung der Platten zu bewirken. Man könnte das Gefäß 15 auch
aus einer Reihe unabhängiger Platten bilden, um die Pilze auf festem Nährboden zu
züchten, wie auf Ölkuchen voll Soja mit i bis 2 Teilen Wasser. Endlich könnte man
auch den Zylinder 15 mit Bimsstein, Koks, Hobelspänen usw. anfüllen, aber die Erfahrung
hat gelehrt, daß die Züchtung auf solchen festen Substanzen und in besonders dünnen
Schichteil nur eine schwache enzYmatische Kraft ergibt.
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Die enzymreichen Kulturen, welche mit Hilfe von eiweißreichen Rohmaterialien
erzeugt sind, können auch leicht an der Luft aufbewahrt werden nach Zusatz von geeigneten
antiseptischen Mitteln, wie z. B. io bis 15 Prozent Salz, 4 bis 5 pro Mille
4oprozentigem Formol, wie es im Handel erhältlich ist, USW.
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Die enzymatische Kraft dieser Lösungen, welche in verspundeten Fässern
aufbewahrt werden können, nimmt mit der Zeit in gerin-0- in ,e Maße zu. Schließlich
kann man zum Zweck der Konservierung diese Enzyme oder Toxine auch durch ein Salz,
z. B. durch Aminoniumsulfat, -fällen, oder die alkalischen Lösungen im Vakuum eindampfen.
Durch das Eindampfen im Vakuum oder an der Luft erhält man, wie oben näher erläutert
wurde, eine Vermehrung der Wirksamkeit der Diastase.
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Man kann den neuen Apparat ebenso wie für die Erzeug;ung von Enzymen
auch zur Herstellung von Toxinen benutzen, wie beispielsweise zur Herstellung von
Toxinen der Tuberkelbazillen oder der Diphteriebazillen. Auch dann geht das Verfahren
genau in der beschriebenen Weise vor sich.