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Verfahren zur Herstellung von zur Bakterienanreicherung von landwirtschaftlichen
Kulturböden und als Eiweißfuttermittel geeigneten Bakterienpräparaten Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von zur Bakterienanreicherung von
landwirtschaftlichen Kulturböden und als Eiweißfuttermittel geeigneten Bakterienpräparaten
durch Submerszulaufzüchtung unter Verwendung von Azotobakterkulturen.
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Zur Bakterisierung von Ackerböden oder Saatgut werden Bakterien angewendet,
welche die Fähigkeit besitzen, atmosphärischen Stickstoff entweder durch Vermittlung
der Pflanzen oder unmittelbar zu binden. Die Bakterien der ersten Art wachsen unter
symbiotischen Bedingungen auf den Wurzeln von Schmetterlingsblütlern und denselben
verwandten Pflanzen (Knöllchenbakterien), gehören zur Familie »Rhizobium« und sind
für die einzelnen Arten der Schmetterlingsblütler spezifisch. Die anderen, atmosphärischen
Stickstoff fixierenden Bakterien entwickeln sich frei im Boden oder in der Nähe
der Wurzeln verschiedener Pflanzenarten, binden atmosphärischen Stickstoff unmittelbar,
bilden keine Knöllchen am Wurzelsystem der Pflanzen und sind von diesen spezifisch
nicht abhängig. Es sind dies in erster Linie Bakterien aus der Gruppe der Azotobakterarten.
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In der Landwirtschaft «.erden die Eigenschaften sowohl der Bakterien
der Gattung »Rhizobium« als auch der Azotobakterarten zur Herstellung wirksamer
Präparate zur Bodenbakterisierung angewendet. Die Azotobakterarten kommen vielfach
bei der Bakterisierung von Setzlingen einer Reihe landwirtschaftlicher Kulturpflanzen
zur Anwendung, um den Ertrag zu erhöhen oder die Vegetationsdauer zu verkürzen.
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Bisher werden diese Präparate durch Vermehrung von Bakterienkulturen
unter statischen Bedingungen auf verschiedenen speziellen Nährböden, d. h. auf Agar-
oder Gelmedien, unter Verwendung der verschiedensten Nährlösungen hergestellt. Die
gezüchteten Bakterienkulturen werden vom Nährboden abgestreift, mit sterilem Wasser
abgespült und auf geeignete Trägerstoffe, wie Gartenboden, Torf, Kaolin, Carboraffin
u. a., übertragen. Es ist auch bekannt, zweckmäßige Präparate durch unmittelbare
Trocknung des Inhaltes von Petrischalen mit der inkubierten Kultur zuzubereiten.
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Nach einem anderen Verfahren werden die Bakterien durch unmittelbare
Impfung eines in Milchflaschen enthaltenen agarisierten auf den Flaschenwänden zerstreuten
Ashby-Mediums (Mannit+Nährsalz) gezüchtet, von dem nach der Inkubation die Kultur
abgespült und darauf mit einem zweckmäßigen Füllmittel vermischt wird.
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Nac', den bisherigen geschilderten Verfahren unter statischen Bedingungen
lassen sich bakterienhaltige Präparate nur in bescheidenem Umfang herstellen. Die
industrielle Verwertung stößt schon wegen der dazu erforderlichen umfangreichen
Gefäße auf unüberwindliche Schwierigkeiten.
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In der Literatur sind ferner Laboratoriumsversuche zur Züchtung von
Azotobakter chroococcum-Kulturen unter submersen Bedingungen auf den obenerwähnten
Nährböden beschrieben, ebenso die submerse Vermehrung von Bakterien allgemein in
einem strömenden Medium. Auf diesen Angaben baut das erfindungsgemäße Verfahren
zur Herstellung von zur Bakterienanreicherung von landwirtschaftlichen Kulturböden
und als Eiweißfuttermittel geeigneten Bakterienpräparaten durch Submerszulaufzüchtung
auf. Gemäß der Erfindung wird eine sterile, verdünnte Ansatzmaische aus Glukose
und Dextrin enthaltenden Fabrikationsabfällen oder anderen organischen kohlenstoffhaltigen,
stickstofffreien Abfällen, wie Abfallstärke, Stärkeabfälle, Abwässer der Stärkefabrikation
u. dgl., nach Zusatz von Nährstoffen, Magnesiumcarbonat und Aktivkohle oder anderen
Metabolitabsorbenten, wie Knochenmehl, Kaolin, Kieselgur, Erden u. dgl., unter Lüftung
und Beimpfung mit Azotobakterkulturen eingemaischt und nach Verbrauch der Glukose
eine weitere Glukose und Dextrin enthaltende Lösung nebst den oben angeführten Zusatzstoffen
zugesetzt, worauf die Azotobakterkulturen unter bekannten Bedingungen
gezüchtet
sowie vermehrt werden und nach zweimaliger Separierung der Azotobakterkulturen,
Auswaschen und Eindicken die Bakterienmilch getrocknet und als Bakterienpräparat
oder Futtermittel gewonnen oder als Ansatzmaische zur Gewinnung weiterer Bakterienpräparate
verwendet wird. Gegenstand der Erfindung bildet das Verfahren als geschlossene Einheit.
Einzelstufen des Verfahrens sind bei Verfahren anderer Art bereits bekannt.
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Das neue Verfahren ermöglicht die Erzeugung der Bakterienpräparate
in großem Umfang auf industrieller Basis und die ökonomische Gewinnung großer Mengen
von Bakterienmassen. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht
darin, daß zur Erzeugung der Bakterienpräparate Abfallstoffe ausgenutzt werden,
so daß die Herstellung wesentlich verbilligt wird.
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Das Gegenstand der Erfindung bildende Herstellungsverfahren besteht
dem Wesen nach aus folgenden Einzelmaßnahmen a) Herstellung der Nährmedien zur Kultivierung
der Kulturen.
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b) Kultivierung der Reinkulturen und Herstellung der Ansatzmaische.
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c) Hauptgärung unter submersen Bedingungen. d) Zentrifugieren der
reifen Maische.
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e) Herstellung der Bakterienpräparate.
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Zu diesen Teilmaßnahmen des Herstellungsverfahrens wird im einzelnen
folgendes bemerkt: Zu a). Zur Herstellung des Nährmediums zur Kultivierung der Kulturen
wird Agar nach Ashby verwendet, und zwar derart, daß in 500 ml Wasser 5 g Mannit,
0,1 g -.,\lonokaliumphosphat, 0,1g kristallisiertes llagriesiumsulfat, 0,1 g Natriumchlorid
und 0,05 g Calciumsulfat gelöst werden. Nach anschließender Filtrierung werden 1
ml einer Spurelementlösung, 2,5 g gefälltes Calciumcarbonat und 7,8 g Agar zugesetzt
und der pH-Wert auf 6,5 eingestellt.
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Zum Schütteln der Kultur wird eine modifizierte Nährlösung nach F
j o d o r o v folgender Zusammensetzung benutzt: 20 g ?@lannit, 0,3 g Dikaliumphosphat,
0.2 g 11lonocalciuinphosphat, 0,2 g Kaliumsulfat, 0,3 g Magnesiumsulfat, 0,5 g Natriumchlorid,
0,1 g Ferrichlorid, 5 g Calciumcarbonat, 1 ml Spurelementlösung und 1000 ml gewöhnliches
Wasser, pH-Wert 7,0.
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Die Ansatzmaische wird erfindungsgemäß auf bereits zusammengestellten
Substraten hergestellt. Hierzu werden bei der Glukoseherstellung anfallende Abfälle
benutzt. Es können jedoch mit Vorteil auch andere kohlenstoffhaltige, stickstofffreie
oder geringe Stickstoffmengen enthaltende Abfälle zur Anwendung gelangen, wie Abfallstärke,
Stärkeabfall, Sirupe, diese Stoffe enthaltende Abwässer usw. Für die Ansatzmaischen
wird ein Boden verwendet, enthaltend 15 g bei der Glukoseherstellung anfallende
Abfälle, 0,3 g Dikaliumphosphat, 0,2g Monokaliumphosphat, 0,2 g .L#Iagnesiumsulfat,
0,2 g Natriumchlorid, 0.1 g Calciumsulfat, 1 ml Spurelementlösung, 4 g Calciumcarbonat
und 1000 ml Wasser, p11-Wert 6,8 bis 7,0. Die genannten Substrate werden zwei- bis
dreimal in einem Dampfkessel oder einem Autoklav sterilisiert. Die Zusammensetzung
des Mediums für die Hauptgärung ist die gleiche wie für die Ansatzmaischen. Von
den Glukoseherstellungsabfällen oder von den übrigen obengenannten Rohstoffen werden
auf 1 1 10 bis 20 g zugesetzt, und der p11-Wert wird durch Zusatz von Magnesium-
oder Calciumcarbonat eingestellt.
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Zu b). Die Kultivierung und Gewinnung der Reinkulturen erfolgt auf
Schräg-Agarböden in Probegläsern nach Ashby. Die Inkubationsdauer beträgt bei 30°
C 6 bis 7 Tage. Die gut inkubierte Kultur wird steril in Suspensionen in sterilem
Wasser in Fjodorov-Substrat enthaltende Siedekolben gebracht, und unter ständigem
Schütteln wird bei einer Temperatur von 30° C 48 bis 72 Stunden kultiviert. Hierauf
wird der gesamte Inhalt in einen Kolben mit dem aus dem Glukoseherstellungsabfall
aufgebauten Medium steril übergeführt. Der Kolben ist mit einer Lüftungsfritte und
einem Luftfilter versehen. Nach dem Inokulieren wird während der ersten 24 Stunden
mäßig, sodann intensiv gelüftet. Die Kultivierungsdauer beträgt bei einer Temperatur
von 26 bis 28° C 48 bis 72 Stunden. Entsprechend dem Umfang der Erzeugung werden
sodann verschiedene Entwicklungsstufen derartiger Wirkung eingeschaltet, daß das
Verhältnis der Ansatzinaische nicht weniger als 1:10, optimalerweise 1:5 beträgt.
Andererseits kann die Ansatzmaische in Form von bei der Hauptgärung gewonnener und
von der vergorenen Maische durch Abschleudern, Auswaschen und neuerliches Eindicken
abgetrennter Bakterienmasse zugesetzt werden.
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Zu c). Die Hauptgärung kann ohne oder mit Zufluß erfolgen und wird
in hohen gläsernen oder nichtrostenden, mit keramischer Lüftung und Temperaturregelung
versehenen Behältern durchgeführt. Die dem gärenden Mittel zugesetzte Zuckermenge
soll zweckmäßig 21/o nicht überschreiten. Sehr wichtig ist der Zusatz sterilen Carboraffins
gemeinsam mit der zugesetzten Ansatzmaische. Außer Carboraffin können auch andere,
adsorptive Eigenschaften aufweisende Stoffe, wieKnochenmehl, Kaolin, Erden, Kieselsäuregel
und ähnliche, entsprechend dem Verwendungszweck des Endproduktes zur Anwendung gelangen.
Carboraffin wird in h-Iengen von 0,3 bis 0,5 g auf 1 1 Nährmedium zugesetzt, es
bezweckt die Beseitigung der Metabolite und die Erhöhung des Lüftungseffektes. Die
Metabolite ermöglichen nämlich eine Vermehrung der infizierenden Mikroorganismen
und erniedrigen die Qualität des Präparates. Dabei erniedrigen sie den Kohlenstoffgehalt
und dies bedeutet Zuckerverluste und eine Ergiebigkeitserniedrigung der Zellenmasse.
Durch die Adsorption der Metabolite durch das Carboraffin wird die Infektionsgefahr
beschränkt und ein Arbeiten unter weniger sterilen Bedingungen ermöglicht.
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Während des Gärungsverlaufes wird der pH-Wert kontrolliert und auf
7,0 gehalten und die Temperatur auf 26 bis 28° C. Die Dauer der Kultivierung beträgt
3 bis 4 Tage. Zu Ende der Gärung wird der Restzuckergehalt bestimmt, welcher nicht
mehr als 0,1°/o betragen soll, weiter die Menge der Zellenmasse und die Fixierung
des Stickstoffs, welche sich zwischen 12 bis 18 mg des Gesamtstickstoffs auf 1 g
vergorener Glukose bewegt.
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Zu d). Das Abschleudern der reifen Maische kann auf angepaßten, mit
Düsen vom Durchmesser 0,2 bis 0,5 mm versehenen Hefefabrikzentrifugen bei 7000 bis
8000 Umdr./Min. erfolgen. Es ist sehr wichtig, die Leistung der Zentrifuge einzustellen,
d. h. das Verhältnis der abgeschleuderten Bakterienmilch und der Maische festzusetzen.
Nach der ersten Separation wird die abgeschleuderte Milch ein- bis zweimal unter
denselben Bedingungen neuerlich eingedickt. Die zentrifugierte Maische wird mikroskopisch
kontrolliert. Die auf die Dichte 8 bis 12° Blg eingedickte Milch wird im Verhältnis
1:1 mit reinem Wasser verdünnt, gewaschen und wiederum durch Separation auf die
geeignete Konzentration gebracht. Auf diese Weise wird zu 90"/o eine eventuelle
bakterielle Infektion ausgeschlossen, denn die infizierenden Bakterien sind
spezifisch
leichter. Außerdem werden auch die schwachen und toten Azotobakterzellen beseitigt,
so daß das gewonnene Konzentrat nur vitale und gesunde Individuen enthält.
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Das gewonnene Bakterienmilchkonzentrat kann, weiter aufgearbeitet,
z. B. als Ansatzmaische für einen weiteren Hauptgärungsprozeß verwendet werden,
wodurch die Gärung schneller und wirtschaftlicher verläuft, oder es kann im Vakuum
getrocknet und aus ihm ein verfütterbares Eiweißkonzentrat hergestellt werden. Weiter
kann es in sterile Böden eingebracht und zur Bakterisierung verwendet, gegebenenfalls
lyphilisiert oder in hochprozentigen Zuckerlösungen od. ä. aufbewahrt werden.
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Das Bakterienkonzentrat stellt mit Rücksicht auf seinen hohen Gehalt
an essentiellen und Wachstum fördernden Aminosäuren (es enthält Cystin, Cystein,
Lysin, Arginin, Histidin, Asparagin, Serin, Glycin, Threonin, Alanin, Prolin, Valin,
Phenylalamin und Leucin) ein ausgezeichnetes eiweißhaltiges, eine Reihe von das
Wachstum fördernden Faktoren enthaltendes Futtermittel dar.
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Zu e). Die Herstellung der Bakterienpräparate erfolgt in der Weise,
daß das Bakterienkonzentrat im Verhältnis 1:20 bis 1:100 mit steriler Humuserde,
Kaolin oder Erden vermischt und bis zum Verbrauch bei normaler Temperatur aufbewahrt
wird. Ausführungsbeispiel Die Maische wird aus 65 kg Glukoseherstellungsabfällen,
2 kg Monokaliumphosphat, 1,2 kg Dikaliumphosphat, 1,30 kg krist. Magnesiumsulfat,
1,30- kg Natriumchlorid, 10 g Natriummolybdat und 0,6 kg Calciumsulfat hergestellt.
Das erwähnte Gemenge wird in 10 hl Wasser gelöst und 15 bis 20 Minuten gekocht.
Die Glukoseherstellungsabfälle, enthaltend 94,8% Trockensubstanz, haben folgende
Zusammensetzung: 74,4% Glukose, 18,5% Dextrine, 0,39% Asche, 0.032% Stickstoff und
1,5% Karamellstoffe.
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Diese Maische wird in den Gärbottich übergeleitet und mit sterilem
oder einwandfreiem Brunnenwasser auf 65 hl verdünnt und es werden 9,0 kg steriles
Magnesiumcarbonat und 3 kg steriles Carboraffin zugesetzt. Die Maische wird verrührt,
auf eine Temperatur von 25° C gebracht und mit 20 1 frisch abgeschleuderter, zweimal
gewaschener Milch einer Azotobakterkultur inokuliert und unter Verwendung keramischer
Kerzen bei einem Luftverbrauch von 20 bis 30 I/Min. auf 1 hl Maische gelüftet. Die
eingeblasene Luft wird zum Auffangen von Keimen über ein Wattefilter geleitet. Nach
36 bis 40 Stunden, wenn die Glukose beinahe aufgebraucht ist, werden 4,8 hl einer
abgekochten (Kochdauer 20 Minuten) und auf 25° C abgekühlten Lösung von Glukoseherstellungsabfällen
und Nährstoffen zugeführt, welche 130 kg Glukoseherstellungsabfälle, 2 kg Monokaliumphosphat,
0,8 kg Dikaliumphosphat, 1 kg Natriumchlorid, 0,1 kg Calciumsulfat und 2 g Natriummolybdat
enthält.
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Gleichzeitig werden entsprechend dem p$ Wert 4 bis 9 kg Magnesiumcarbonat
und 2 kg Carboraffin zugesetzt. Die Lüftung wird auf der gleichen Höhe gehalten.
Während der Gärung wird eine Temperatur von 25 bis 30° C und ein pH-Wert von 6,5
bis 7,0 aufrechterhalten und mit Hilfe einer kleinen Menge Entschäumungsfett entschäumt.
Nach weiteren 36 bis 48 Stunden ist die Maische durchgegoren und weist eine restliche
Glukosemenge von 0,08 bis 0,151% und eine Fixierung des Gesamtstickstoffes von 14
bis 18 mg Stickstoff auf 1 g verbrauchter Glukose auf. Die reife Maische wird der
ersten Separationsstufe zugeführt. Die erste Bakterienmilch wird im Verhältnis 1:1
bis 1:2 mit einwandfreiem Brunnenwasser verdünnt, gewaschen und neuerlich separiert.
Dieser Vorgang wird wiederholt. Die endgültige Bakterienmilch,welche eine Dichte
von etwa 11° aufweist, wird sodann in einem Vakuumtrockner getrocknet und als Futtermittel
verwertet oder zur Bakterisierung von Böden (in einer Menge von 5 ml auf 500 g sterilen
Bodens) verwendet. Auf diese Weise gelangt man zu einem zur Bakterisierung des Bodens
außerordentlich geeigneten Präparat, welches einen um ein Vielfaches höheren Gehalt
an Azotobakterbakterien aufweist als die bisher in Verwendung stehenden Präparate.
Aus der genannten Menge von Glukoseherstellungsabfällen gewinnt man praktisch 35
bis 40 kg Azotobaktertrockensubstanzen.