DE1807185B2 - Verfahren zur Herstellung von proteolytische Enzyme enthaltenden Aufbereitungen und deren Verwendung - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von proteolytische Enzyme enthaltenden Aufbereitungen und deren VerwendungInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer proteolytischer Enzymaufbereitungen,
die für gewisse industrielle Zwecke, wo es auf eine ausgeprägte proteolytische Aktivität bei sehr hohen
pH-Werten ankommt, einsetzbar sein sollen.
Es ist bekannt, daß ein Anzahl von Bakterien während
ihres Stoffwechseis proteolytische Enzyme erzeugen und daß einige dieser Bakterien in industriellem
Umfange kultiviert worden sind zum Zwecke der Gewinnung der erzeugten proteolytischen Enzyme. Die
derart hergestellten Enzymaufbereitungen zeigen indessen eine optimale proteolytische Aktivität bei einem
pH-Wert unterhalb 9, wenn diese Aktivität nach der bekannten Anson-Hämoglobinmethode in Anwesenheit
von Harnstoff (Journal of General Physiology, 22,79-89 (1939)) gemessen wird. Für viele industrielle Zwecke
wird aber gewünscht, daß die optimale proteolytische Aktivität bei höheren pH-Werten (10—12) liegt
In der holländischen Zeitschrift »Antonie von Leeuwenhoek«, 1,141-147(1934) hat A. V e d d e r seine
Versuche zur Isolierung gewisser Bakterien aus dem Fäzes beschrieben. Durch eine Anreicherung in
alkalischem Peptonwasser und Kultivierung auf »Glykokoll Platten«, welche Hämoglobin, KOH, Glykokoll
und Peptonagar enthalten oder noch besser auf »Karbonat Platten« (diese Platten sind von V e d d e r
so genannt worden), welche Hämoglobin, K2CO3, KHCO3 und Peptonagar enthalten, gelang es V e d d e r,
16 Stämme eine Bakteriums zu isolieren, das zur Gattung Bacillus gehört und nach V e d d e r als einer
neuen Spezies zugehörend angesehen werden kann, die er Bacillus alcalophilus nannte, weil diese Spezies nur
bei pH-Werten oberhalb 7, vorzugsweise im Bereich von 8,6 bis 10 wächst Im Zusammenhang mit der
Beschreibung von Bacillus alcalophilus wurde von
V e d d e r darauf hingewiesen, daß die zu dieser Spezies bo
gehörenden Bakterien in stark alkalischem Milieu Eiweiß (Gelatine, Hämoglobin) spalten. Die Spezies
Bacillus alcalophilus wurde in die 6. Ausgabe von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, jedoch
nicht in die 7. Ausgabe aufgenommen.
Ein Stamm von Bacillus alcalophilus wurde von
V e d d e r beim National Collection of Type Cultures in London unter der NCTC-Nummer 4553 hinterlegt, und
dieser Stamm wurde später 1956 unter der NCIB-Nummer
8772 hinterlegt, wo der Stamm durch ein Versehen als ein Bacillus Subtilis angesehen wurde.
Es wurde nun gefunden, daß die Stämme von Bacillus
alcalophilus unter bestimmten Züchtungsbedingungen während ihres Stoffwechsels neue proteolytische
Enzyme extrazellular erzeugen, die eine ausgeprägte Aktivität bei hohen Alkalitätsgraden (pH 10-12)
zeigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von Bacillus alcalophilus
unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert wird, das assilimierbare Kohlenstoff- und
Stickstoffquellen enthält, wobei der pH-Wert des Nährmediums auf einen Wert zwischen 7,5 und 11
eingestellt wird, und daß anschließend die während der
Kultivierung extrazellular erzeugte proteolytische Enzymaufberekung
abgetrennt wird. Dabei wird die Kultivierung vorzugsweise unter submersen Bedingungen
durchgeführt
Das Nährmedium ist nach den hierfür bekannten Grundsätzen zusammengesetzt Geeignete assimilierbare
Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie z. B. Saccharose, Glukose, Stärke, Getreidekörner, Malz,
Reis, Zuckerhirse usw. Die Kohlehydratkonzentration kann in weiten Grenzen variieren, z. B. nach oben bis zu
25% und nach unten bis 1 —5%. Im allgemeinen erweist sich eine Konzentration von 8—10% als zweckmäßig,
wobei der Prozentsatz auf Dextrose bezogen ist Es wurde festgestellt, daß die Anwesenheit von Kohlehydraten
im Nährmedium den Anlaß zur Bildung von sauer reagierenden Verbindungen gibt, was sich in einer
Abnahme des pH-Wertes während der Kultivierung äußerst Da es wesentlich ist, einen pH-Wert im
obenerwähnten Nährmedium im Bereich von 7,5—11, vorzugsweise S—10, aufrechtzuerhalten, sollen während
des Züchtens Maßnahmen dagegen getroffen werden, daß der pH-Wert während der Kultivierung während
einer nennenswerten Zeitdauer auf einen unterhalb des vorgenannten Bereichs liegenden Wert abfällt Um den
pH-Wert innerhalb des gewünschten Bereichs zu halten, kann eine begrenzte Menge an Kohlehydraten zusammen
mit einer Puffersubstanz verwendet werden, die in der Lage ist, den gewünschten pH-Wert einzustellen.
Karbonate und insbesondere Sesquikarbonate in einer Konzentration bis zu 0,2 M im Medium können einen
pH-Wert von etwa 9,3 bis 10,5 herbeiführen.
Es können natürlich auch andere Puffersysteme, wie z. B. Phosphatpuffer, eingesetzt, werden.
Es ist auch möglich, das Züchten mit einem niedrigen Kohlehydratgehalt zu beginnen und während des
ZUchtens nach und nach kleine Mengen an Kohlehydrat zuzusetzen.
Eine dritte Möglichkeit besteht in der Anwendung einer automatischen pH-Kontrolle durch Zusatz von
verschiedenen basisch reagierenden Substanzen, wie sie auf diesem Gebiet verwendet werden.
Die Verwendung von Karbonaten und Sesquikarbonaten als pH regelnde Substanzen erweist sich als sehr
zweckmäßig. Es ist überraschend, daß es während des Züchtens in einem industriellen Umfange möglich ist,
diese Substanzen in den vorerwähnten Konzentrationen einzusetzen.
Bei der Stickstoffquelle des Nährmediums kann es sich um eine solche von anorganischer und/oder
organischer Natur handeln. Geeignete anorganische Stickstoffquellen sind Nitrate und Ammoniumsalze.
Unter den organischen Stickstoffquellen gibt es eine
ganze Anzahl, die als für Fermentationsprozesse und für
das Züchten von Bakterien geeignet bekannt sind. In diesem Zusammenhang sei beispielsweise auf Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Kasein,
eine Aufschlämmung von gequollenem Mais, Hefeextrakte, Harnstoff, Albumin usw. hingewiesen.
Außerdem sollte das Nährmedium die üblichen Spurensubstanzen enthalten.
Die Temperatur, bei der das Züchten durchgeführt wird, liegt normalerweise in demselben Bereich wie
beim bekannten Züchten von bekannten Spezies der Gattung Bacillus. Im allgemeinen sind Temperaturen
zwischen 25 und 40° C zweckentsprechend. Vorzugsweise liegt die Temperatur zwischen 30 und 37° C
Da das Züchten unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden muß, ist es bei Einsatz von Fermentationstanks notwendig, eine künstliche Belüftung vorzusehen.
Die Luftmenge entspricht derjenigen bei den bekannten Züchtungen.
Im allgemeinen werden maximale Ausbeuten der proteolytischen Enzyme nach einer Züchtungszeit von 1
bis 5 Tagen erhalten.
Die Züchtungsversuche sind sowohl in Schüttelflaschen als auch in Fermentationseinrichtungen von
Versuchsanlagen mit künstlicher Belüftung durchgeführt worden. Die erhaltenen Ausbeuten wurden nach
der genannten Ansonhämoglobinmethode bestimmt In
dieser Beschreibung bedeutet eine Anson-Einheit die Menge an proteolytischem Enzym, welche Hämoglobin
bei einem pH-Wert von 10,1 und einer Temperatur von 25° C während einer Reaktionszeit von 10 Minuten mit
einer solchen Anfangsgeschwindigkeit aufschließt, daß pro Minute eine solche Menge an Spaltprodukten
gebildet wird, die mit Trichloressigsäure nicht ausgefällt
werden kann und wobei diese Spaltprodukte mit Phenolreagenz dieselbe Farbe ergeben wie ein Milliäquivalent von Tyrosin.
Für das Züchten wurden die folgenden beiden Medien eingesetzt:
1) Medium BPFA folgender Zusammensetzung:
Na2HPO4 · 12 H2O
50 g pro Liter Leitungswasser
50 g pro Liter Leitungswasser
50 g pro Liter Leitungswasser
20 g pro Liter Leitungswasser
10 g pro Liter Leitungswasser
9 g pro Liter Leitungswasser
2) Medium BSX folgender Zusammensetzung:
Diese beiden Medien wurden auf den gewünschten pH-Wert durch Zugabe von Sesquikarbonat oder Soda
unter sterilen Bedingungen eingestellt
Für die mit Schüttelflaschen durchgeführten Versuche wurden 500 mm Schüttelflaschen eingesetzt, wobei
jede Flasche 100 ml des Nährmediums BPFA und BSX enthielt, das vorher im Autoklaven während 90 Minuten
bei 1200C sterilisiert und hiernach durch Zugabe von Natriumkarbonat oder Natriumsesquikarbonat in einer
Konzentration von 0,2 M bzw. 0,1 M auf einen pH-Wert
zwischen 9,3 und 103 eingestellt wurde. Für jedes
Bakterium wurden vier Flaschen verwendet Die von den Kulturmedien für die Bestimmung des Enzymgehalts in Ansoneinheiten benötigten Proben wurden nach
einer Kultivierung von 3, 4, 5 und 6 Tagen abgezogen.
Die Flaschen wurden während des Züchtens auf einem rotierenden Tisch mit 220 U/Min, abgestellt und die
Temperatur lag bei 30° C
Die in Ansoneinheiten pro kg Nährmedium gemessene maximale proteolytische Aktivität geht aus der
nachstehenden Tabelle I hervor:
Tabele I
Bacillus | Nähr | Maximale | End- |
Alcalophilus | medium | proteolytische | pll-Wert |
Aktivität | |||
Ansoneinheiten | |||
pro kg | |||
NCIB 8772 | BPFA | 14 | 7,7 |
25 | 7,7 | ||
BSX | 6 | 8,8 | |
2,5 | 8,2 | ||
NCTC 45 53 | BPFA | 16 | 7,9 |
13 | 7,6 |
Bei einer fraktionierten Fällung mit Äthylalkohol wurden pulverförmige Aufbereitungen erhalten. Wie
hierbei verfahren wurde, ergibt sich aus der nachfolgenden Tabelle II:
Tabelle II | NCIB 8772 | NCTC 4553 | |
Bacillus Alcalophilus | |||
35 | A usgangsmaterial | 0,10 | 0,25 |
Kulturbrühe in kg | 7,6 | 12 | |
Ansoneinheiten pro kg | 0,76 | 3 | |
Ansoneinheiten | |||
40 | insgesamt | ||
1. Fällung | 3 | 0,75 | |
g Kieselgur | 150 | 385 | |
ml C2HsOH | |||
45 | 2. Fällung | 2,5 | 3 |
g Kieselgur | 370 | 770 | |
ml C2H5OH | |||
Ausbeute | 4,4 | 5,3 | |
50 | Pulver in g | 0,14 | 0,3 |
Ansoneinheit pro g | |||
(gemessen bei pH 10,1) | 0,62 | 1,6 | |
Ansoneinheit insgesamt | 81 | 53 | |
% | |||
Der Stamm NClB 8772 wurde ebenfalls in 5501 Tanks
aus rostfreiem Stahl unter submersen Bedingungen und bei künstlicher Belüftung und Verwendung von 2501 des
vorerwähnten BPFA-Nährmediums gezüchtet Der pH-Wert des Mediums wurde durch sterile Zugabe von
151 einer 2 M Sodalösung auf 10,2 eingestellt Während des Züchtens betrug die Temperatur 3O0C, die
Geschwindigkeit des Rührers 570 Drehungen pro Minute und die Belüftung 0,25 m3 Luft pro Minute. Nach
einer Züchtungszeit von HO Stunden lag der pH-Wert ,der Brühe bei 8,9 und die proteolytische Aktivität betrug
17 Ansoneinheiten pro kg, gemessen bei pH 10,1.
Die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten Enzymaufbereitungen wurden in bezug
auf die prcteolytische Aktivität gegenüber Hämoglobin bei verschiedenen pH-Werten und verschiedenen
Temperaturen untersucht Die Aktivität wurde bei pH 7, 7,5, 8, 9, 10, 11 und 12 bei 25D gemessen und in dem
Prozentsatz der maximalen Aktivität ausgedrückt Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle III
zusammengestellt:
pH-Wert
7 7,5 8
10 11 12
NCIB 8772
NCTC 4553
25 37 50 60 66
75
NCTC 4553
% Aktivität bei
bei pH 10,1
10
15
50 75 85 100
33 54 67 71 85 100 44 70 80 100
34 52 M 72 79 100
Die Aktivität wurde ebenfalls bei einem konstanten pH-Wert von 10,1 und unterschiedlichen Temperaturen,
nämlich 25°, 37°, 50°, 60°, 66° und 75° C gemessen. Die bei diesen Messungen erhaltenen Ergebnisse sind in der
nachfolgenden Tabelle IV zusammengestellt:
30
14 32 65 100 26 2 3>
Im allgemeinen werden die durch die Erfindung erhältlichen neuen Enzyme in kleinen Mengen eingesetzt Im Hinblick hierauf besitzen die Enzymaufbereitungen im Rahmen der Erfindungsdefinition für
industrielle Zwecke normalerweise einen Enzymgehalt von nicht mehr als etwa 10Gew.-%. In einigen Fällen
kann jedoch der Enzymgehalt beträchtlich höher sein. 4 ■-,
Die nach der Erfindung erhaltenen Enzymaufbereitungen werden als Bestandteil von Detergenzien
(Waschmittel, Geschirrspülmittel) eingesetzt
Das in der oben beschriebenen Weise vom Stamm 8 772 erhaltene Enzympulver wurde bei Waschversuchen eingesetzt, die unter Verwendung von EMPA-Teststreifen oder -stücken No. 116 durchgeführt
wurden, die mit Blut, Milch und RuB beschmutzt waren.
Das verwendete Detergenz hatte die folgende Zusammensetzung:
CMC (45%) 2 g
Der Waschversuch wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Einheiten 10°
Versuchsdauer | 30 Minuten |
pH-Wert | etwa 10 |
Konzentration des | |
Detergenz | 4,8 g/l der Waschlö |
sung | |
Proteolytische Aktivität | |
gemessen bei pH 7,5 | 0,04 Ansoneinheiten |
pro liter | |
Waschlösung | |
WaschtemDeratur | 60 und 700C |
b0
Der Waschprozeß wurde bei 6O0C wie folgt
durchgeführt:
Mit einer Pipette wurden 20 ml einer aus dem vorerwähnten Enzympulver hergestellten Lösung, die
eine Temperatur von 200C, einen pH-Wert von 11,2 und
eine proteolytische Aktivität von 0,24 Ansoneinheiten pro Liter besaß, in ein 200 ml Becherglas gegeben.
Gleich zu Beginn, also zum Zeitpunkt 0, wurden 100 ml der Detergenzlösung zugesetzt, die auf einen pH-Wert
von 113 und auf eine Temperatur von 68°C eingestellt
war. Die Mischung wurde sofort in eine langhalsige Erlenmeyer-Flasche mit einem Fassungsvermögen von
200 ml überführt, die auf einem Schütteltisch abgestellt und in Wasser von 6O0C eingetaucht war. Die
Erleimeyer-Flasche enthielt schon vorher 6 EM PA-Streifen 116, die insgesamt 3,0 g wogen. Das Schütteln
wurde während des 30minütigen Waschvorganges fortgesetzt Dann wurde die Waschlösung abgetrennt
und der pH-Wert nach dem Abkühlen gemessen. Die Teststreifen wurden abgespült und zwischen den
Fingern unter der Wasserleitung entnommenem heißen Wasser gerieben. Sämtliche Teststreifen wurden in
einem Beckmann-Spektrophotometer bei 460 πιμ Remissionsmessungen unterworfen.
Bei den bei 700C durchgeführten Untersuchungen
hatte die Detergenzlösung eine Temperatur von 8O0C
Neben diesen Versuchen wurden noch Kontrollversuche durchgeführt, bei denen die Enzymlösung durch
Wasser ersetzt wurde.
Darüber hinaus wurden alle Versuche auch mit einem Zusatz von 1 g Perborat (NaBO3, 4 H2O) pro Liter
Waschlösung ausgeführt
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle V zusammengestellt:
Tabelle V |
Ohne
60 C |
Perborat
70C |
Mit
Perborat 60 C |
54,7
46,7 |
49,2
46,2 |
41,5
31,5 |
|
Enzympulver
NClB 8772 Kontrolle ohne Enzym |
|||
Die Remissionswerte stellen Durchschnittszahlen der bei jedem der sechs Teststreifen jedes Versuchs
durchgeführten Messungen dar.
Die mit den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Enzymaufbereitungen erzielbaren Wirkungen waren selbst unter Berücksichtigung des früheren
Hinweises von A. V e d d e r, daß Bacillus alcalophilus in
stark alkalischem Milieu Eiweiß (Gelatine, Hämoglobin) spaltet, nicht voraussehbar. Abgesehen davon, daß es
am Prioritätstag zum allgemeinen Wissens- und Erfahrungsstand gehörte, daß Gelatine und Hämoglobin
unter bestimmten, nicht-enzymatischen Bedingungen abgebaut werden, z. B. durch Alkalien, wie sie oft
während des Wachstums von Mikroorganismen erzeugt werden (vgl. »Manual of Microbiological Methods by
the Society of American Bacteriologists«, McGraw Hill, New York, 1967 insbes. S. 158/159; »Topley and
Wilson's Principles of Bacteriology and Immunity«, 5. Ausgabe insbes. S. 652/653) oder im Falle von
Hämoglobin durch die von allen Bacillus-Arten erzeugte Milchsäure, konnte durch Untersuchungen
nachgewiesen werden, daß unter den von A. V e d d e r angewandten Bedingungen eine starke proteolytische
Wirkung auch solcher Enzyme zu beobachten ist, deren Akuivitätsoptimum irn saueren, neutralen oder schwach
alkalischen Bereich liegt. Somit konnte der Fachmann aus dem Hinweis von V e d d e r auf eine Spaltungswirkung
von Bacillus alcalophilus in stark alkalischem Milieu auf Eiweiß nicht folgern, daß durch diese Species
extrazellular eine Protease erzeugt wird, die sich von bekannten Proteasen dadurch unterscheidet, daß ihr
Aktivitätsoptimum sehr viel weiter im alkalischen Bereich (oberhalb pH 10) liegt und auch noch bei sehr
hohen pH-Werten ausreichen stabil ist. Nach solchen Proteasen bestand am Prioritätstag bereits seit längerer
ίο Zeit ein starkes Bedürfnis, nachdem seit den 50er Jahren
eine sehr starke Forschungsaktivität zur Entwicklung von Waschmitteln auf Enzymbasis eingesetzt hat. Bei
der Verwendung der bekannten alkalischen Proteasen in Detergenzien war jedoch die Stabilität und Aktivität
υ der Enzyme bei hohen pH-Werten (oberhalb 10)
unbefriedigend.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung proteolytischer Enzymaufbereitungen, dadurch gekennzeichnet,
daß ein Stamm von Bacillus alcalophilus unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium
kultiviert wird, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, wobei der pH-Wert
des Nährmediums auf einen Wert zwischen 7,5 und 11 eingestellt wird, und daß anschließend die
während der Kultivierung extrazellular erzeugte proteolytische Enzymaufbereitung abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung unter submersen
Bedingungen durchgeführt wird.
3. Verwendung einer nach dem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche erhaltenen
Enzymaufbereitung in Waschmitteln und Geschirrspülmitteln.
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