DE2131451C3 - Verfahren zur Herstellung von alkalischer Protease - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von alkalischer Protease. jo

Alkalische Protease ist eines der wertvollen Enzyme mit verschiedenen industriellen Verwendungszwecken, wie als Bestandteil von Haushaltwaschmitteln und zur Rückgewinnung von fotografischen Filmträgern. Zur Herstellung derartiger alkalischer Protease werden J5 herkömmliche Bakterien, die zur Genus Bacillus subtilis gehören, mittels Submerskultur gezüchtet, unlösliches Material wird von der erhaltenen Kultur durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt, und aus dem erhaltenen klaren Filtrat wird das Enzym in Pulverform erhalten, indem man die Arbeitsgänge des Aussalzens, der Fällung mit organischem Lösungsmittel und andere geeignete Reinigungsschritte kombiniert.

Die schwierigste Stufe bei dieser herkömmlichen Erzeugung sind die außerordentlichen Betriebsschwierigkeiten beim Filtrieren, Zentrifugieren und anderen Arbeitsgängen wegen der hohen Viskosität des Züchtungsmediums, in welchem viskose Substanzen als Nebenprodukte während der Herstellung der alkalischen Protease enthalten sind.

Außerdem wäre vom wirtschaftlichen Standpunkt aus die Möglichkeit der Erzeugung von Protease in größerer Menge durch Fermentation erwünscht.

Es wurde nun gefunden, wie alkalische Protease in größerer Menge durch Auswahl von Kombinationen natürlicher Substanzen und anorganischer Salze erzeugt werden kann.

Allgemein wird das Wachstum von Protease produzierenden Bakterien und die Produktivität an Protease durch Zugabe von Phosphat beschleunigt. Dabei w> ergeben sich jedoch als Nebenprodukte viskose Substanzen von hohem Molekulargewicht, die die Filtrierung und andere Arbeitsgänge extrem schwierig machen. Es wurde jedoch nun gefunden, daß bei Zusatz von wasserlöslichen Boraten, wie Borax, oder Borsäure in kleiner Menge zur Kultur die Bildung von viskosen Substanzen stark zurückgedrängt werden kann und gleichzeitig die Erzeugung von Protease begünstigt Beispiel !
Züchtung im Kolben

In 500-ml-Sakaguchi-Kolben wurden 4 g Stärke gegeben. Borat einerseits und zu Vergleichszwecken dibasisches Natriumphosphat andererseits wurde in wechselnden Mengen zugefügt In den Kolben wurden 50 ml entölter Sojabohnenextrakt, der getrennt hergestellt war (5% entölte Sojabohnen, 0,3% Natriumhydroxyd, eine Stunde lang gekocht) und eine kleine Menge Bakterienamylase gegeben.

Nach Sterilisieren im Autoklaven wurden die Kolben mit einem alkalische Protease produzierenden Stamm KZ, der zur Genus Bacillus subtilis gehört, beimpft Nach 72stündiger Schüttelkultur bei 37°C wurde der Kolbeninhalt untersucht. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Anorganisches Salz	Aktivität Viskosität	Beispiel 2
	an alka- der Kultur	Züchtung in der Fermentationsanlage
	lischer
	Protease
	(PEN/ml)
Ohne	5000 + + +
Borax 0,1%	6200 +
Borax 0,5%	6300 +
Borsäure 0,1%	5200 +
Borsäure 0,5%	5000 +
Dibasisches Natrium- 6500 + + + + +
phosphat, 1%

Das Kulturmedium enthielt 8% Stärke, 5% entölte Sojabohnen und 0,1% Kalziumchlorid. 25 m³ des

Mediums wurden in eine Fermentationsanlage von 50 m³ Fassungsvermögen eingebracht Es wurde eine Submerskultur bei 37° C für 40 Stunden unter Belüftung

und Bewegen durchgeführt Die erhaltene Kultur wurde mit folgenden Ergebnissen untersucht:

Ohne

Boraxzugabe

0,5%

Zugabe an dibasischem Natriumphosphat 1%

Alkalische Protease (PEN/ml) 3,750 4,580 4,760 Filtrationswirksamkeit (Filterpresse)

Zugabe an Filterhilfe 4% 1% 5%

Filtrationsgeschwindigkeit 5 l/m²/h 20 l/m²/h 21/mVh

Filtratausbeute 75% 92% 65%

Transparenz des Filtrats gut gut gut

Enzymausbeute im Filtrat 70 χ 109 pen 110x10» PEN 72 χ 10» PEN

Beispiel 3

Unter Verwendung eines 500 ml Sakaguchikolbens wurden nach der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 1 Borax und Borsäure untersucht Die Durchschnittsergebnisse von jeweils 5 Versuchen waren wie folgt:

	Ohne	pH des Mediums	- Protease Aktivität	Filtrierbarkeit*)
	Borax 0,2%		nach 72stündiger
	Borax 0,5%		Züchtung
	Borsäure 0,2%		(PEN/ml)
1.	Borsäure 0,5%	7,6	4000	3 ml
2.	7,6	560C	18 ml
3.	7,6	4800	29 ml
4.	7,6	5030	25 ml
5.	7,6	2160	30 ml

·) Die Filtrierbarkeit wurde als Filtratvolumen (ml) durch eine Prüfung unter Verwendung von Filterpapier ausgedrückt

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von alkalischer Protease durch Züchtung in einem übliche Kohlenstoffquellen und StHcstoffquellen sowie anorganische Salze enthaltenden Nahrmedium durch Submerskultur mittels alkalischer Protease produzierender Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Züchtungsmedium wasserlösliches Borat und/oder Borsäure zusetzt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Zusatz von Borsäure den pH-Wert des Züchtungsmediums auf 7 bis 8 einstellt

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Borat und/oder Borsäure in einer Menge von 0,1 bis 12% verwendet

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Borax in einer Menge von 0,1 bis 03% verwendet

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man 3orsäure in einer Menge von 0,2 bis 0,5% verwendet

wird. Dadurch wird bei der Produktion von alkalischer Protease die Filtrierungswirksamkeit stark verbessert und demgemäß kann die Enzymausbeute bei der Filtration stark erhöht werden. Der hier benutzte Ausdruck Borat umfaßt also — wie oben gezeigt — auch Borsäure.

Der Wirkungsmechanismus von Borat oder Borsäure ist nicht vollständig geklärt jedoch hat. als sicher zu gelten, daß Borat bzw. Borsäure die Bildung viskoser Substanzen von hohem Molekulargewicht inhibiert ohne nachteilige Wirkung auf die Herstellung von alkalischer Protease.

Bei der Durchführung der Erfindung kann die zugegebene Menge an Borat zum Züchtungsmedium in

is weitem Bereich schwanken, und zwar von 0,1 bis 12%, jedoch neigt im Falle von Borax eine Zugabe von mehr als 03% zu einer geringen Verzögerung in der Erzeugung des Enzyms. Im Falle von Borsäure ist nach der Zugabe zum Züchtungsmedium die Einstellung des pH-Wertes auf 7 bis 8 erforderlich. Die zugegebene Menge beträgt vorzugsweise 0,2 bis 03%- Bei einer Zugabe von mehr als 04% wird die Erzeugung des Enzyms etwas verlangsamt

Die anderen Bedingungen bezüglich Medium und Züchtung sind die gleichen wie sie für die bekannte Herstellung von alkalischer Protease üblich sind.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.