DE2723165B2

DE2723165B2 - Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharide

Info

Publication number: DE2723165B2
Application number: DE2723165A
Authority: DE
Inventors: Lynda Deavin; Renton Clive Righelato
Original assignee: Tate and Lyle PLC
Current assignee: Tate and Lyle PLC
Priority date: 1976-05-28
Filing date: 1977-05-23
Publication date: 1979-02-15
Also published as: IT1083006B; BE855084A; US4130461A; DE2723165C3; LU77431A1; FR2352879A1; GB1513104A; NO771842L; JPS52145595A; CA1087123A; IL52145A0; AU2550777A; DE2723165A1; JPS5530360B2; NL7705897A; FR2352879B1; SE7706260L; DK235277A; FI771704A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines alginatartigen Polysaccharids durch Kultivieren von Bakterien der Spezies Azobacter vinelandii.

Alginsäure, eine hydrophile kolloidale Kohlenwasserstoffsäure, besteht aus einem unterschiedlichen Block-Copolymeren zusammengesetzt aus D-Mannuronsäureeinheiten und L-Guluronsäureeinheiten. Obwohl Alginsäure selbst praktisch unlöslich in Wasser ist, kann sie durch Neutralisation mit einem geeigneten Alkali leicht löslich gemacht werden. Eine der besonderen Eigenschaften von Alginatlösungen ist deren hohe Viskosität bei sehr niedrigen Konzentrationen; wobei bei Zugabe von gewissen zweiwertigen Ionen, wie Kalzium oder Magnesium zu Lösungen von Alginaten, eine Gelierung eingeleitet wird. Die ungewöhnlichen physikalischen Eigenschaften von Alginsäure und Alginaten ermöglichen einen weiten technischen Anwendungsbereich als Emulgatoren, Stabilisatoren und Verdickungsmittel. Sie können beispielsweise in der Nahrungsmittelindustrie als Emulsionsstabilisatoren für Eiscreme verwendet werden, als Gelierungsmittel für Milchpudding und als Verdickungsmittel für Soßen, sowie als Schaumstabilisatoren für Bier; pharmazeutisch können sie als Emulgatoren und Granuliermittel für Tabletten, als Suspensionsmittel für Salben und als absorbierbare Gele für chirurgische Verbände verwendet werden. In der Papier- und Textilverarbeitung werden sie als Leime, für Beschichtungsmassen, Überzugsmassen, Farbstoffe und Druckfarben verwendet und in der Landwirtschaft können sie als Bodenverbesserer eingesetzt werden.

Alginate und Alginsäuren werden technisch durch Extraktion gewisser Spezies von braunem Seetang, beispielsweise Laminaria digitata und Ascophyllum nodosum gewonnen, wobei sie einen erheblichen Anteil der Zellwandungen bilden.

Dieses übliche Extraktionsverfahren von Seetang weist den Nachteil auf, daß man auf den Nachschub von Alginat enthaltendem Seetang als Ausgangsmaterial angewiesen ist Das Verfahren läßt sich aucii nur schwierig durchführen wegen der Mengen an zu verarbeitendem Seetang und eine erhebliche weitere Reinigung wird manchmal erforderlich, insbesondere wenn ein Material für Nahrungsmittel und pharmazeutische Anwendungen benötigt wird.

Aufgrund dieser Schwierigkeiten sind in den vergangenen Jahren alginatähnDche Polysaccharide hergestellt worden durch Kultivierung von verschiedenen Spezies von Azotobacter insbesondere Azotobacter vinelandii. Die Alginsäure die durch diese Mikroorganismen gebildet wird, ist strukturell ähnlich der aus Seetang gewonnenen, mit der Ausnahme, daß sie zum Teil acetyliert ist

Es ist bekannt daß die Herstellung von Polysacchariden unter Verwendung eines Stammes von Azotobacter vinelandii kritisch abhängig von einer Zahl von Faktoren ist insbesondere von dem pH des Mediums und auch von der Menge des Phosphats in dem Medium.

In der GB-PS 13 31 771 wird ein Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden beschrieben, das aus einem partiell acetylierten variablen Block-Copolymer von 1 —4-verbundenen D-Mannuronsäure- und L-GuIuronsäure-ReFten besteht bei dem ein Mikroorganismus der Spezies Azotobacter vinelandii unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium enthaltend wenigstens ein Monosaccharid und/oder Disaccharid als Kohlenstoffquelle und enthaltend als wesentliche Bestandteile Quellen von Molybdän, Eisen, Phosphat Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat, unter kontrollierten pH-Bedingungen, so daß ein pH im Bereich von 6,5 bis 8,5 für wenigstens die erste Hälfte der Fermentationsperiode und im Bereich von 4,5 bis 8,5 für den Rest der Fermentationsperiode sofern eine solche vorliegt kultiviert wird, bis eine wesentliche Bildung des Polysaccharids stattgefunden hat worauf das gebildete Polysaccharid isoliert wird. Die in diesem Verfahren angewendete Kultivierungsmethode kann absatzweise oder kontinuierlich sein.

In der Beschreibung wird betont, daß die Menge an Phosphat in dem Wachstumsmedium eine wesentliche Rolle hinsichtlich der Ausbeute an Polysaccharid spielt Es wird in der dortigen Beschreibung vorgeschlagen, daß niedrige Phosphatmengen die Ausbeute erhöhen und es wird eine Phosphatkonzentration von 0,015 bis 1,4 mMol, vorzugsweise 0,2 bis 0,7 mMol vorgeschlagen. Unter diesen Bedingungen werden Polysaccharidkonzentrationen von etwa 2,5 bis 3,0 g/l erhalten.

In der GB-PS 13 34 413 wird eine besondere Auswahl der Bedingungen zur Erzielung besonders guter Ausbeuten an Polysacchariden beschrieben. In dieser Patentschrift wird ein ähnliches Verfahren wie in der vorerwähnten Patentschrift beschrieben und beansprucht, aber die Konzentration an Phosphat in dem Medium ist auf 0,1 bis 0,8 mMol begrenzt und während der Kultivierung wird der pH des Mediums im Bereich

von 7,0 bis 8,2 gehaben. Unter diesen Bedingungen können Pplysaccharidkonzentrationen von 3 bis 3,5 g/l erhalten werden.

In der GB-RS 1394413 wird wiederum betont, daß die besten Ergebnisse bei niedrigen Phosphatkonzentrationen erzielt werden.

Es wurde nun gefunden, daß bei einem kontinuierlichen Fennentationsverfahren dieser Art die tatsächliche Konzentration an Phosphat in dem Medium unter bestimmten Bedingungen erheblich höher sein kann als in den früheren Patentschriften betont wurde.

Unter kontinuierlichen Fennentierungsbedingungen ist es ein wesentliches Erfordernis, daß die Kultur unter begrenzten Phosphatbedingungen durchgeführt wird. Das heißt, daß es die Menge an Phosphat in dem Medium ist, welche der bestimmende Faktor für die Konzentration des Mikroorganismus wird.

Dabei ist zu beachten, daß die Konzentration an Zellen des in dem Ferment vorhandenen Mikroorganismus eine Funktion der Konzentration des Phosphates ist, welche Grenzbedingungen bei einer kontinuierlichen Kultur ergibt Je höher die Phosphatkonzentration, um so höher ist die Konzentration an vorhandenen Zellen bei Grenzbedingungen. Unter der Voraussetzung, daß dieses Prinzip angewendet wird, ist es möglich, phosphatbegrenzte Bedingungen bei kontinuierlichen Kulturen zu erzeugen, bei Phosphatmengen, die erheblich im Überschuß über denen liegen, die in den früheren Patentschriften offenbart wurden und wobei man viel höhere Polysaccharidkonzentrationen, beispielsweise bis zu 27 g/l Polysaccharide erzielt, insbesondere wenn man niedrigere Verdünnungsgrade anwendet

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids aus einem partiell acetylierten variablen Block-Copolymeren aus 1 —4-verbundenen D-Mannuron- und L-Guluronsäure-Resten zur Verfügung gestellt bei dem ein Bakterium der Spezies Azotobacter vinelandii unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, enthaltend als wesentlichen Bestandteil wenigstens ein Monosaccharid oder ein Disaccharid als Kohlenstoffquelle und Quellen von Phosphat Molybdän, Eisen, Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat, kontinuierlich kultiviert wird, wobei das wäßrige Kulturmedium eine bestimmte Menge an Stickstoff und/oder Stickstoff enthaltendem Belüftungsgas enthält und die Konzentration des Phosphates in dem Medium begrenzend wirkt auf die Konzentration der Bakterien und wenigstens 1,0 mMoI beträgt, und wobei während der Kultivierung der pH des Mediums im Bereich von 6,0 bis 8,2 gehalten wird.

Jeder Stamm von Azotobacter vinelandii kann beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Besonders wertvolle Stämme, weiche besonders gute Ausbeuten an dem Polysaccharid ergeben sind die in den beiden früheren Patentschriften erwähnten, welche die Kultur-Sammelnr. NCIB 9068 und NCIB 8799 tragen, sowie der Stamm, welcher die Kultur-Sammelnr. NCIB 8660 trägt Diese Stämme sind erhältlich vom National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen, Schottland, und werden in dem Sammlungskatalog beschrieben.

Die Phosphatmenge, die in dem Medium verwendet wird, variiert in Abhängigkeit von der Zellkonzentration in dem Fermentationsgefäß: je höher die Zellkonzentration, um so höher ist die Phosphatmenge, die limitierend ist Es wurde beispielsweise gefunden, daß bei Verwendung eines chemisch definierten Mediums der Art, wie es in Beispiel 1 der GB-PS 13 31771 beschrieben wird, einer Phosphatkonzentration von 1,0 mMoI und einer Verdünnungsgeschwindig keit von 0,15 l/h wirksam limitierend ist bei einer Zellkonzentration von etwa 23 g/L

Eine Phosphatkonzentration von 2,0 mMol ist wirksam limitierend bei einer Zellkonzentration von etwa 4 g/l, während eine Phosphatkonzentration, die so hoch wie 2,OmMoI ist wirksam limitierend bei einer Zellkonzentration von etwa 4,7 g/l ist Bei niedrigeren Verdünnungsgraden erhöht sich die Zellkonzentration, d.h. die gesamte Zellmasse bei einer speziellen

is limitierenden Phosphatkonzentration, wahrscheinlich durch eine Erhöhung des einzelnen Zellgewichtes. Somit ist bei einem Verdünnungsgrad von 0,05 l/h 3,0 mM Phosphat limitierend bei einer Zellkonzentration von etwa 14 g/l.

In jedem speziellen Fall kann ein Anzeichen dafür, ob die Phosphatkonzentration tatsächlich limitierend ist durch Erhöhung der Phosphatkonzentration und Beobachten der Auswirkung auf die Zellkonzentration erkannt werden. Wenn die Konzentration einer nicht limitierenden Komponente in dem Medium erhöht wird, wird keine erhebliche Veränderung der Zellkonzentration beobachtet; wird dagegen die Konzentration der limitierenden Komponente erhöht so spricht die Zellkonzentration sehr schnell durch eine Erhöhung an.

Beispielsweise bewirkt eine Erhöhung der limitierenden Phosphatkonzentration um das 2fache eine wenigstens

10%ige Erhöhung der Zellkonzentration innerhalb 5 Stunden.

Es wurde gefunden, daß unter üblichen kontinuierli-

chen Kultivierungsbedingungen, beispielsweise unter Verwendung eines Chemostats (siehe Herbert EIsworth und Teilung, 1956, Journal of General Microbiology, 14,601) besonders vorteilhafte Phosphatmengen im Bereich von 2,0 bis 3,0 mMol liegen, wobei man eine Zellkonzentration von etwa 4 bis etwa 4,7 g/l bei Verdünnungsgraden von 0,15 h-' oder etwa 14 g/l bei 0,05 h-' erzielt Bei Anwendung dieser Mengen wurde eine Folysaccharidkonzentration von bis zu etwa 27 g/l gefunden. Es kann keine obere Grenze der Phosphatkonzentration festgelegt werden, angenommen von der Grenze, die durch praktische Überlegungen diktiert wird, wie sie bei kontinuierlichen Fermentierungsverfahren wesentlich sind. In der erwähnten früheren Patentschrift wurde

so angezeigt daß ein weiterer Faktor wichtig ist bei der Bildung von Polysaccharid unter Verwendung von Azotobacter vinelandii, und zwar die Menge an Sauerstoff, welche dem Fermentationssystem zugeführt wird. Sauerstofflösungsmengen von etwa 5 bis 50, vorzugsweise etwa 8 bis etwa 20 mMol Sauerstoff pro 1 Kulturmedium pro Stunde werden wort erwähnt

Es wurde gefunden, daß die Wirksamkeit mit welcher das angewendete Monosaccharid oder Disaccharid in ein Polysaccharid umgewandelt wird, in Beziehung steht zu der Menge der Sauerstoffzufuhr. Bei kontinuierlichen Kultivierungsbedingungen trifft dasselbe für Sauerstoff zu, was auch für Phosphat zutrifft nämlich daß eine Beziehung zwischen dem Sauerstoffgehalt und der Zellkonzentration besteht die wesentlich ist und nicht die Sauerstoffkonzentration im Medium als solche. Es wurde festgestellt daß zwar eine Sauerstoffzufuhr von etwa 50 mMol/g Zelle/h unter phosphatlimitierenden Bedingungen eine Saccharoseumwandlung von etwa

9% ergibt, daß aber eine Sauerstoffzufuhr von etwa 7 bis etwa 22 mMol/g Zelle/h eine Saccharoseumwandlung von über 40% ergibt Eine Sauerstoffzufuhr von 20,5mMol/g Zelle/h hat eine Saccharoseumwandlung von etwa 49% ergeben.

Die tatsächliche Sauerstoffaufnahrie in mMol/l/h entsprechend diesen Zahlen hängt selbstverständlich von der Zellkonzentration im Fermentationsgefäß ab. Die Aufnahme pro l/h liegt im allgemeinen in dem in den früheren Patentschriften beschriebenen Bereich, aber es muß betont werden, daß es die Beziehung zwischen Sauerstoffzufuhr und Zellkonzentration ist, die wesentlich ist

Eine Veränderung der Sauerstoffzufuhr zu der Kultur kann auf verschiedene Weise bewirkt werden. Zunächst kann die Konzentration an Sauerstoff in dem Gas, im allgemeinen Luft, welches in die Kultur während der Fermentierung eingeleitet wird, verändert werden, indem man die Luft mit Stickstoff oder einem Inertgas verdünnt oder indem man die Luft durch Extrasauerstoff anreichert Weiterhin kann man den Druck des in die Kultur eingeleiteten Gases verändern, so daß die Lösungsgeschwindigkeit variiert Drittens kann die Wirksamkeit, mit welcher der Sauerstoff in der Gasphase in die flüssige Phase überführt wird, verändert werden, indem man die Gas-Flüssigkeits-Mischeigenschaften verändert, was am einfachsten durch eine Veränderung der Geschwindigkeit und der Wirksamkeit des Rührers erfolgt Eine Kombination von zwei oder mehreren dieser Verfahren kann auch angewendet werden, um das korrekte Gleichgewicht zwischen Stickstoff und Sauerstoff sicherzustellen.

Um das Polysaccharid in hohen Mengen zu erzielen und eine gute Wirksamkeit hinsichtlich der Umwand-

Tabelle 1

Zusammensetzung des Wachstumsmediums

lung des Mono- oder Disaccharide zu erhalten, ist es erforderlich, die Wachstunisgeschwindigkeit der Bakterien zu überwachen und getrennt davon den Respirationsgrad, so daß die Zufuhr von Sauerstoff zu den Bakterien einerseits nicht begrenzt ist und andererseits nicht unnötig hoch ist Dabei muß betont werden, daß die Sauerstoffzufuhr nicht limitierend sein muß, weil dadurch die Bildung des Polysaccharids erniedrigt wird. Andererseits bewirken unnötig hohe Respirationsgrade, die durch einen hohen Sauerstoffgehalt sich ergeben, daß ein großer Anteil der Kohlehydratquelle zu Kohlendioxid oxidiert wird, wodurch eine niedrige Umwandlungswirksamkeit sich ergibt

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert

Beispiele 1 bis 4

Es wurden verschiedene Medien gemäß Tabelle 1 verwendet:

Die Medien wurden hergestellt und den Kulturen in zwei Ansätzen zugegeben: Ansatz (1) wurde autolclavisiert mit I kg/cm² während 1 Stunde in zwei Teilen, die nach dem Abkühlen aseptisch kombiniert wurden. Der eine Teil enthielt Saccharose, KH₂PO₄ und K₂HPO₄ in 141, der andere Teil enthielt MgSO₄ · NaCl und Spurenelemente mit Ausnahme von Kalzium und Eisen in 4 L Ansatz (2) enthielt CaCl₂ und FeCl₂ in 21; das CaCl₂ wurde in 1,91 autoklavisiert und das FeCl₂ wurde filtersterilisiert in 100 m! und dann zu der Masse des Ansatzes (2) gegeben. Ansätze (1) und (2) wurden zu dem Kulturmedium durch getrennte Leitungen zugeführt, wobei (1) mit der 9fachen Geschwindigkeit von (2) zugegeben wurde, so daß die Konzentration in der Kultur wie in Tabelle 1 angegeben, sich einstellte.

Bestandteil Konzentration (g/l) [millimolar] Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3 Beispiel 4 Beispiel S

Saccharose

KH₂PO₄

K₂HPO₄

MgSO₄7H₂O

Na₂MoO₄

CaCl₂2H₂O

FeCl₂4H₂O

H₃BO₄

CoSO₄7H₂O

MnCl₂4H₂O

ZnSO₄7H₂O

CuSO₄7H₂O

FeSO₄7H₂O

Vier kontinuierliche Kulturen vom Chemostat-Typ (Herbert et al, wie vorher erwähnt) unter Verwendung von Azotobacter vinelandii NCIB 9068 in einer kontinuierlichen Kulturvorrichtung mit einem Kulturvolumen von 1,01 wurden jeweils mit einem der sterilen Medien, wie in Tabelle 1 angegeben, versetzt, und zwar mit den dort angegebenen Phosphatkonzentrationen.

60	60	60	120	20
0,0321 0,12 J	^⁰⁶⁴} [2,0] 0,25 J	°'^O961[3,O] 0,38 J	ÖD¹³'⁰¹	0,0081 0,032 J
1,6	1,6	1,6	1,6	0,2
1,6	1,6	1,6	1,6	0,2
0,008	0,008	0,008	0,008	0,008
0,34	0,34	0,34	0,34	0,043
0,017	0,017	0,017	0,025	-
0,023	0,023	0,023	0,23	-
0,009	0,009	0,009	0,009	-
0,007	0,007	0,007	0,007	-
0,009	0,009	0,009	0,009	-
0,0008	0,0008	0,0008	0,0008	-

65 0,003

Die Ansätze (1) und (2) wurden den Kulturen in einer kombinierten Menge zugepumpt, wobei man die Verdünnungsgrade, die in Tabelle 2 angegeben werden, erhielt, und die Kulturbrühe floß über einen Standrohrüberlauf in ein Aufnahmegefäß. Die Temperatur wurde wie in Tabelle 2 angegeben, eingestellt
Der pH wurde auf 7,4 durch automatische Zugabe von

1 M NaOh eingestellt. Luft wurde in die Fermentationsvorrichtung in einer Menge von 1 l/Min, geperlt und die Rührgeschwindigkeit wurde so eingestellt, daß die Saueraufnahme im Bereich von 10 bis 30 mMol/g Zelle/h lag. Aus dem Fermentationsgefäß wurden täglich Proben entnommen und Untersuchungen der Zellmassen und der Polysaccharidkonzentrationen durchgeführt. Zu jeder 40 ml Probe wurden 0,8 ml 0,5 M EDTA und 0,8 ml 5 M NaCl gegeben. Die Proben wurden dann 40 Minuten mit 25 000 g zentrifugiert. Die in erhaltenen Zellkügelchen wurden in destilliertem Wasser wieder suspendiert, 40 Minuten mit 2SOOOg zentrifugiert und das Überstehende wurde dekantiert.

Tabelle 2

Polysaccharidbildung unter phosphatlimitierten Bedingungen Ein vorher gewogenes Rohr, enthaltend das Sediment, wurde 12 Stunden bei 105⁰C getrocknet und dann gewogen. Das Polysaccharid wurde von dem Überstehenden der ersten Zentrifugierung durch Zugabe von 3 Volumenteile Propan-2-ol ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und im Vakuum 24 Stunden bei 45°C getrocknet. Die Phosphatlimitierung wurde bei Phosphatkonzentrationen von 1,OmMoI bis 3,0 mMol erzielt. Besonders geeignete Konzentrationen an Polysacchariden wurden unter Verwendung von Medien, enthaltend 2,0 bis 3,0 mMol zugefügtem Phosphat, erhalten.

Beispiel	Phosphat	Verdünnungs	Kultivierungs	Zellkonzen	Polysaccharid-	Polysaccharid-
	konzentration	grad	temperatur	tration	konzentration	produktivität
					(p.c.)	= d.r. X p.c.
	(mM)	(η"¹)	(O	(g/l)	(g/l)	ig/l/h)
1	1	0,15	30	2,3	4,4	0,66
2	2	0,15	36	4,0	9,1	1,36
3	3	0,12	36	4,7	15,1	1,81
4	3	0,05	36	14	26,5	1,32

In allen Fällen wird gezeigt, daß die Phosphatkonzentration die Zellkonzentration limitiert, indem die Phosphatkonzentration auf das 2fache erhöht wird: innerhalb von 5 Stunden beobachtete man eine Erhöhung der Zellkonzentration von wenigstens 10%.

Beispiel 5

Auswirkung auf die Polysaccharidausbeute durch

verschiedene Belüftungsgeschwindigkeiten im
Kulturgefäß unter phosphatlimitierten Bedingungen

Azotobacter vinelandii NCIB 9068 wurde auf einer kontinuierlichen Kultur unter Verwendung eines wäßrigen Kulturmediums der Zusammensetzung der Tabelle 1 in einer gerührten Tankfermentiervorrichtung gezüchtet.

Zu dem Medium in der Fermentiervorrichtung wurde ein auf einem Agar-Nährboden gewachsener Impfstoff zugegeben und die Fermentierung wurde ansatzweise 24 Stunden bei 30° C bei einem pH von 7,5 vorgenommen. Eine kontinuierliche Mediumzufuhr wurde mit einem Verdünnungsgrad von 0,15h"¹ (d.h. 150 ml/h) zugegeben. Luft wurde zu der Kultur in einer

jo Menge von 1,7 I/Min, gegeben. Der Respirationsgrad des Organismus wurde durch Veränderung der Rührgeschwindigkeit eingestellt, wobei man die Kultur ein konstantes Stadium erreichen ließ. Jeweils wenn ein konstantes Stadium erreicht wurde, wurde die Polysac-

3) charidbildung gemessen, indem man mit Propan-2-ol einen Niederschlag bildete und anschließend das Trockengewicht feststellte, das Zellprodukt wurde durch Bestimmung des Trockengewichtes gemessen und die rückständige Saccharose wurde durch g. 1. c.

bestimmt Die Sauerstoffaufnahme wurde gemessen unter Verwendung eines paramagnetischen Sauerstoffanalysators und die CO2-Entwicklung unter Verwendung eines Infrarot-C02-Analysators.
Immer wenn ein konstantes Stadium erreicht war, wurden zu dem Kulturgefäß 2 ml sterile Phosphatlösung (0,125M) zugegeben. In jedem Fall erhöhte sich die Konzentration an Bakterien, wodurch angezeigt wird, daß die Zellkonzentration durch die Phosphatkonzentration limitiert worden ist. Die Ergebnisse sind in

w Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Auswirkung des Respirationsgrades auf die Wirksamkeit der Saccharoseumwandlung in ein Polysaccharid

Sauerstoff	Zeil konzentration	Polysaccharid-	Verwendete	Umwandlung von	Rührge
aufnahme		konzentration	Saccharose	Saccharose in	schwindigkeit
				Polysaccharid
(mmol/g Zelle/h)	(g/l)	(g/l)	(g/l)		(UpM)

7,0
12,4
20,5
28,2
51,0

0,5

0,42

0,44

0,69

0,70
0,84
1,09
1,16
0,89

1,65

1,8

2,2

4,7

9,9

42%
47%
49%
25%
9%

400
500
600
700
870

Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, daß die Ausbeute an Polysaccharid aus Saccharose von 9% bei höheren Belüftungsgraden (und infolgedessen höheren Respirationsgraden) auf 47 bis 49% erhöht werden kann bei Sauerstoff aufnahmen zwischen 12 und 20mMol/g Zelle/h.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids aus einem partiell ace,ylierten variablen Block-Copolymer aus 1—4-verbundenen D-Mannuron- und L-Guluronsäure-Resten, bei dem ein Bakterium der Spezies Azotobacter vinelandii kontinuierlich unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium kultiviert wird, wobei das Kulturmedium als wesentliche Bestandteile wenigstens ein Monosaccharid oder Disaccharid als Kohlenstoffquelle und Quellen von Phosphat, Molybdän, Eisen, Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat enthält, und das Medium eine bestimmte Quelle an Stickstoff is und/oder ein Belüftungsgas enthaltend Stickstoff, enthält und der pH des Mediums im Bereich zwischen 6,0 und 8,2 gehalten wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Phosphat in dem Medium limitierend auf die Konzentration des Bakteriums ist und wenigstens 1,OmMoI beträgt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als A. vinelandii ein Stamm NCIB 9068, 8789 oder 8660 verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Phosphatkonzentration in dem Medium 2,0 bis 3,0 mMol beträgt

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß die Sauerstoffaufnahme durch die Kultur auf ein Niveau beschränkt wird, das eine optimale Umwandlung des Monosaccharide oder Disaccharids in das Polysaccharid ergibt

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet daß die Sauerstoffaufnahme auf eine Menge von etwa 7 bis 22 mMol/g Zelle/h beschränkt wird.