DE69121870T2

DE69121870T2 - Mutanter Stamm von Xanthomonas Campestris, Verfahren zur Herstellung von Xanthan und nichtviskoser Xanthan

Info

Publication number: DE69121870T2
Application number: DE69121870T
Authority: DE
Inventors: Marc Salome
Original assignee: Societe National Elf Aquitaine; Systems Bio Industries
Current assignee: Societe National Elf Aquitaine; Degussa Health and Nutrition Holding France SAS
Priority date: 1990-12-28
Filing date: 1991-12-27
Publication date: 1997-03-20
Anticipated expiration: 2011-12-28
Also published as: DE69121870D1; US5401644A; FR2671097B1; EP0493264B1; JPH0638738A; ATE142254T1; EP0493264A1; US5536651A; FR2671097A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mutantenstamm von Xanthomonas campestris, ein Verfahren zur Fermentation dieses Mikroorganismus, wobei Xanthan erhalten wird, und ein nichtviskoses Xanthan, das durch dieses Verfahren hergestellt werden kann.
Die Viskosität wässeriger Xanthan-Lösungen führte zur Verwendung dieses Polysaccharids als Verdickungsmittel und Stabilisator von Suspensionen in den Nahrungsmittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrien, in Farben und Tinten sowie zur unterstützten Rückgewinnung von Erdöl.
Xanthan ist ein Polymer, dessen Hauptkette, welche dieselbe Struktur aufweist wie jene von Cellulose, durch Acetat- oder Pyruvat-Gruppen substituierte Trisaccharid-Seitenketten trägt. Es ist bekannt, daß in Abhängigkeit von den Produktionsstämmen und Kulturbedingungen das erzeugte Polysaccharid mehr oder weniger modifizierte Seitenketten und eine variable, jedoch immer sehr hohe mittlere Molmasse aufweisen kann. Dies kann zu Variationen seiner physikalischen Eigenschaften, insbesondere seiner Viskosität führen; dennoch wurde noch nie ein Polysaccharid mit der Struktur von Xanthan isoliert, dessen Viskosität wässeriger Lösungen praktisch Null ist.
In der US-4 377 637-A wurde bereits ein Verfahren zur Herstellung von Xanthan mit verminderter Viskosität beschrieben. Diese Verringerung der Viskosität, die bei einem relativ geringen Prozentsatz bleibt, wird durch den Einfluß von Sulfatanionen erhalten.
Nun wurde gefunden, daß ein Xanthomonas campestris-Stamm unter guten Produktivitätsbedingungen ein Xanthan mit sehr niedriger Viskosität ergibt.
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung den Xanthomonas campestris-Stamm, der gemäß dem Budapest-Übereinkommen bei der Collection Nationale de Gulture de Microorganismes (CNCM), Frankreich, am 15. Juni 1990 unter der Nr. I-956 hinterlegt wurde.
Dieser Mutantenstamm wurde auf einem flüssigen Medium selektiert, das Mineralstickstoff als einzige Stickstoffquelle sowie Glycerin als einzige Kohlenstoffquelle enthielt. Er kann in einem synthetischen flüssigen Medium sowie auf einem festen Medium kultiviert werden.
Der Mikroorganismus zeigt sich in Form von Stäbchen, und seine gelben und mukösen Kolonien auf einem festen Medium in Anwesenheit von Glucose unterscheiden sich nicht von jenen des ursprünglichen Stamms NRRL B-1459.
Der Mutantenstamm unterscheidet sich durch sein rasches Wachstum auf Glycerin als einzige Kohlenstoffquelle vom ursprünglichen Stamm NRRL B-1459 und vom Stamm ATCC 31600, der auf eine synthetischen Medium wachsen kann; er ist resistent gegen Streptomycin und Nalidixinsäure, und assimiliert Lactose nicht.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Fermentation dieses Mikroorganismus zur Herstellung von klassischem und nicht-viskosem Xanthan.
Dieses Verfahren zum Erhalten von Xanthan umfaßt eine Produktionsphase, die in Anwesenheit von Calcium und alkalischem Hexametaphosphat, vorzugsweise Natriumhexametaphosphat, ablaufen muß.
Das für die Wachstumsphase des Mutantenstamms - die Multiplikationsphase des Mikroorganismus - bestimmte Medium umfaßt vorzugsweise Glycerin als einzige Kohlenstoffquelle; die anderen Komponenten des Mediums sind die üblicherweise in Xanthomonas- Fermentationen angetroffenen, wie vom Fachmann mit Hilfe einiger Vorversuche ausgewählt, um ein optimales Wachstum zu erhalten. Daher werden zu einer Stickstoffquelle, die mineralisch sein kann, als Ammoniumsalz, oder auch Komplex, Salze zugesetzt, die Phosphat, Magnesium, Kalium, Schwefel sowie Eisen, Calcium und Spurenelemente zuführen.
Auf diese Weise kann in das Medium eine Puffer-Mischung eingebracht werden, die den pH auf etwa 7 einstellt, beispielsweise auf der Basis von 3-Morpholinpropansulfonsäure.
Das Glycerin wird rasch vom Mutantenstamm assimiliert, das in Anwesenheit einer Aminosäure-Mischung darin eingeschlossen ist. In Abwesenheit einer anderen Kohlenstoffquelle wird die unnütze und störende Produktion von Xanthan während dieser ersten Phase unterdrückt.
Eine zweckmäßige Stickstoffquelle besteht aus einer Mischung von Caseinhydrolysat, Glutaminsäure und Hefe-Extrakt. Außerdem begünstigt die Anwesenheit von Bor unter den Spurenelementen das Wachstum des Mikroorganismus. Das Verdünnungsmittel des Wachstumsmediums ist Wasser, das entionisiert ist, um die eingebrachten Ionen nicht zu beeinflussen.
Das Medium, das für die Produktionsphase von klassischem oder nicht-viskosem Xanthan durch den Stamm der Erfindung bestimmt ist, umfaßt: eine klassische Kohlenstoffquelle, die mit einem gewöhnlichen Stamm zur Produktion von viskosem Xanthan führt, wie ein Zucker; eine oder mehrere Stickstoffquellen; Salze, welche die in Fermentationen dieses Typs üblichen Ionen einführen, wie Phosphat, Magnesium, Kalium, Schwefel sowie Eisen und Calcium und eine Lösung von Spurenelementen.
Außerdem, und dies ist ein Merkmal der Erfindung, enthält das Produktionsmedium ein alkalisches Hexametaphosphat in einer Ausgangskonzentrationen zwischen 50 und 500 mg/l und vorzugsweise zwischen 200 und 300 mg/l, wodurch das Vorliegen von 1 mg bis 15 mg Ca&spplus;&spplus;/l erforderlich ist.
Das alkalische Hexametaphosphat ist vorteilhaft Natriumhexametaphosphat.
Das Verdünnungsmittel des Produktionsmediums ist entionisiertes Wasser.
Als Kohlenstoffquelle wird Fructose und besser Glucose bevorzugt; und als Stickstoffquelle Lysin, allein oder in Mischung mit einem Caseinhydrolysat.
Zur erfindungsgemäßen Herstellung eines nicht-viskosen Xanthans muß das Medium während der gesamten Fermentation nichtviskos, leicht zu rühren und zu belüften bleiben, und die Fermentation muß angehalten werden, sobald die Viskosität des Mediums zuzunehmen beginnt; wenn sie fortgesetzt wird, erscheint tatsächlich nach und nach Xanthan mit normaler Viskosität im Medium, und nach einer verlängerten Fermentation kann nur Xanthan mit normaler Viskosität erhalten werden. Sobald die Viskosität zuzunehmen beginnt, ermöglicht jedoch der Zusatz von alkalischem Hexametaphosphat bei 50 bis 200 mg/l Medium, und vorzugsweise etwa 100 mg/l, die Zunahme der Viskosität anzuhalten und die Produktion des nicht-viskosen Xanthans zu verlängern.
Das zugesetzte Hexametaphosphat ist hier auch vorzugsweise Natriumhexametaphosphat.
Allgemein beträgt die Fermentationsdauer durchschnittlich 30 Stunden, bevor das Auftreten einer Viskosität in der Fermentationsflüssigkeit festgestellt wird, sie kann jedoch 10 Stunden lang fortgesetzt werden, wobei vorteilhaft Hexametaphosphat dem Medium zugesetzt wird.
Die Fermentation kann zu jedem Zeitpunkt vor dem Auftreten der Viskosität angehalten werden, es wird jedoch vorzugsweise gewartet, bis die gesamte Kohlenstoffquelle praktisch aufgebraucht ist.
Da das Medium am Ende der Fermentation nicht viskos ist, wird die Trennung der Zellkörper und gegebenenfalls vorliegenden unlöslichen Stoffe leicht durch Zentrifugation, Mikrofiltration oder Ultrafiltration durchgeführt; im letzteren Fall können die Zellen rückgeführt und die Fermentation wiederaufgenommen werden, nach dem einfachen Zusatz der notwendigen Bestandteile des Produktionsmediums zum Medium, wo sie in Suspension geblieben sind.
Die so erhaltenen Polysaccharid-Lösungen sind klar und können für bestimmte Anwendungen wie sie sind verwendet werden.
Das Polysaccharid kann auch vor oder nach der Abtrennung der unlöslichen Stoffe durch Ausfällung gemäß einem bekannten Verfahren isoliert werden: dem Medium wird ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel zugesetzt, in dem das Polysaccharid unlöslich ist, wie Aceton, Ethanol oder vorzugsweise Isopropanol; wie bei einer klassischem Fermentation verbessert das Vorliegen schwacher Konzentrationen von alkalischen oder erdalkalischen Ionen, und insbesondere Calcium, im Medium zwischen 50 und 100 mM die Ausfällung.
Für bestimmte Anwendungen, beispielsweise kosmetische, kann es wünschenswert sein, ein Xanthan zu isolieren, das nicht durch Lipopolysaccharide verunreinigt ist, deren pyrogene Wirksamkeit wohlbekannt ist. Weiters ist bekannt, daß, da Xanthomonas gramnegative Bakterien sind, bedeutetende Mengen an Lipopolysacchariden in das Fermentationsmedium freigesetzt werden; sie könnten durch Ausfällung vor jener des Polysaccharids gemäß bekannten Techniken eliminiert werden, wie durch den Zusatz erdalkalischer Ionen zum basischen Medium.
Zur erfindungsgemäßen Herstellung von viskosem klassischen Xanthan wird der erfindungsgemäße Xanthomonas-Stamm in einem Medium produziert, das ein alkalisches Hexametaphospaht in einer Konzentration zwischen 50 mg/l und 500 mg/l, vorzugsweise zwischen 200 und 300 mg/l, und Calciumionen bei 1 bis 15 mg Ca&spplus;&spplus;/l enthält, und die Fermentation wird verlängert, bis die Viskosität des Mediums mit jener eines üblichen Produktionsmediums vergleichbar ist, bevor das Xanthan gemäß klassischen Verfahren isoliert wird. In diesem Zusammenhang der Produktion von viskosem Xanthan kann die Fermentation auch in einem nicht-viskosen Medium verlängert werden, indem, sobald die Viskosität zuzunehmen beginnt, alkalisches Hexametaphosphat bei 50 bis 200 mg/l Medium und vorzugsweise etwa 100 mg/l zugesetzt wird. Auf diese Weise wird das Auftreten des viskosen Xanthans unterschieden.
Ein derartiges Verfahren ist insofern vorteilhaft, als das Produktionsmedium während einer eindeutig kürzeren Zeit als bei einer klassischen Fermentation mit derselben Produktivität viskos ist. Daher wird der Energieverbrauch beim Rühren eindeutig verringert.
Das Produktionsmedium zum Erhalten von viskosem oder nichtviskosem Xanthan hat dieselben Charakteristika, nämlich das Vorliegen von einem alkalischen Hexametaphosphat - vorzugsweise Natriumhexametaphosphat - und Calciumionen.
Gemäß einem abschließenden Aspekt betrifft die Erfindung ein neues, nicht-viskoses Xanthan. Dieses nicht-viskose Xanthan kann durch das oben beschriebene Verfahren erhalten werden, ein Verfahren, bei welchem als Merkmal der Xanthomonas campestris- Stamm CNCM I-956 in einem alkalisches Hexametaphosphat umfassenden Medium verwendet wird, und welches geeignet unterbrochen wird.
Nicht-viskoses Xanthan bedeutet ein Produkt, dessen wässerige Lösungen bei einer Konzentration von 10 g/l, die etwa 1 % (M/V) KCl enthalten, eine Viskosität von weniger als 700 mPa.s und besser 250 mPa.s aufweisen, gemessen mit einem Brookfield- Viskosimeter bei 25ºC mit Mobil-LVT, das mit einer sich bei 60 UpM drehenden Nadel 1 oder 2 versehen ist, während sie für bekannte Xanthane zwischen 1200 und 1500 mPa.s liegt. Diese Viskositätsmessung wird klassisch in Anwesenheit von KCl durchgeführt, um ein Ergebnis unabhängig von der Menge an Ionen zu erhalten, die in das Wasser mit dem zu untersuchenden Xanthan eingebracht werden können.
Dieses nicht-viskose Xanthan hat eine identische chemische Zusammensetzung mit bekannten Xanthanen, insbesondere hinsichtlich der Acetat- und Pyruvat-Gruppen; im Gegensatz dazu ist die mittlere Molmasse des Polymers niedriger als jene von viskosen Xanthanen.
Durch eine Technik, welche die Ausschlußchromatographie und Kleinwinkel-Laserlichtdiffusion koppelt und beispielsweise in Carbohydrate Polymers 6, S. 477-492 (1986), beschrieben ist, wurde bestimmt, daß die Molmassen der kommerziellen Xanthane 2 x 10&sup6; oder mehr betrugen, während die mittlere Molmasse des erfindungsgemäßen Polysaccharids in der Größenordnung von 6 bis 7 x 10&sup7; liegt.
Die Lösungen bei einer Konzentration von 1 bis 20 g/l nicht-viskosem Xanthan gemäß der Erfindung werden durch Erhitzen auf zwischen 80 und 120ºC während 5 bis 30 Minuten nicht viskos.
Ein nicht-viskoses Xanthan mit diesen Strukturmerkmalen wurde noch nie beschrieben, und die Erfindung ist nicht auf das vom Stamm CNCM I-956 produzierte Polysaccharid beschränkt; sie betrifft auch nicht-viskose Polysaccharide, welche die chemische Struktur von Xanthan aufweisen und von einem anderen Mutantenstamm von Xanthomonas campestris oder von einem Mikroorganismus einer anderen Art oder Gattung produziert werden können, der gegebenenfalls durch Gentechnik erhalten werden oder auch durch chemische Synthese oder Hemisynthese hergestellt werden kann.
Das erfindungsgemäße nicht-viskose Xanthan kann allein wegen seines Suspendiervermögens verwendet werden, jedoch auch für klassische Anwendungen von üblichem Xanthan, bei denen Viskositäts- oder Verdickungseigenschaften verwendet werden, es kann in variablen Mengen mit einem üblichen viskosen Xanthan gemischt werden, um Zusammensetzungen von Xanthan mit einer dazwischenliegenden Viskosität, reproduzierbaren Eigenschaften und dennoch den interessanten rheologischen Eigenschaften von Xanthan zu erhalten, d.h. der Unabhängigkeit der Viskosität seiner Lösungen über einen breiten Temperatur- und pH-Bereich und seiner Pseudoplastizität; diese Mischung finden die gleichen Anwendungen als Verdickungs- und Suspendiermittel wie klassisches Xanthan, da nicht-viskoses Xanthan seine Solubilitätseigenschaften beibehält.
Diese Zusammensetzungen von Xanthan, wie erfindungsgemäßem nicht-viskosen Xanthan, können mit anderen Hydrokolloiden assoziiert werden, wie Carrageenanen, Pektinen, Gelatinen, Alginaten und Johannisbrot, in üblichen Anwendungen, insbesondere in der Nahrungsmittelindustrie.
Außerdem kann das nicht-viskose Xanthan wegen seines Filmbildnervermögens, insbesondere im Backgewerbe, verwendet werden.
Schließlich kann das erfindungsgemäße nicht-viskose Xanthan leichter chemischen Reaktionen unterworfen werden als ein viskoses Xanthan, um durch Aufpfropfen oder Vernetzen nützliche Produkte zu bilden.
Im folgenden werden Beispiele zur Durchführung der Erfindung beschrieben.

Beispiel 1: Erhalten von nicht-viskosem Xanthan in einem Labor- Fermenter

Der Mutantenstamm Xanthomonas campestris CNCM I-956 kann auf klassische Weise lyophilisiert oder in einem Gefrierröhrchen bei -80ºC in einem 20 % wässerigen Glycerin-Medium konserviert werden.

a) Wachstumsphase

Das Wachstumsmedium wird vorher hergestellt:
In 800 ml entionisiertem Wasser werden gelöst:
0,125 g FeSO&sub4;.7H&sub2;O; 0,015 g CaCl&sub2;.2H&sub2;O; 0,300 g MgSO&sub4;.7H&sub2;O; 0,040 g K&sub2;SO&sub4;; 0,125 g NaCl; 3,0 g Glutaminsäure; 1,0 g Hefe- Extrakt; 7,5 g Caseinhydrolysat; und 1 ml einer Lösung von Spurenelementen wird zugesetzt.
Das Caseinhydrolysat ist beispielsweise das von HUMKO SHEFFIELD (USA) unter dem Namen "Hy-Case, salt free" vertriebene; die Lösung von Spurenelementen wird hergestellt, indem in 900 ml entionisiertem Wasser gelöst werden: 10 g MnCl&sub2;, 2 g ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 25 mg CuSO&sub4;.5H&sub2;O, 2 g CoCl&sub2;.6H&sub2;O, 0,5 g H&sub3;BO&sub3;; 180 mg KI, 1,9 g Na&sub2;MoO&sub4;.2H&sub2;O, 2,4 g AlCl&sub3;.6H&sub2;O, 50 mg KCr(SO&sub4;)&sub2;.12H&sub2;O und 26 mg NiSO&sub4;.6H&sub2;O; 100 ml konzentrierte Salzsäure werden zugesetzt und 30 min lang bei 120ºC in einen Autolaven gegben.
Der pH der Lösung wird durch den Zusatz einer wässerigen KOH-Lösung (d = 1,38) auf 7,4 geführt, bevor sie 45 min lang bei 120ºC gehalten wird. Dann werden 100 ml einer wässerigen filtrierten Lösung von 18,4 g Glycerin und 1,5 g K&sub2;HOPO&sub4; zugesetzt.
Eine Vorkultur lyophilisierter Stämme wird in einer bei 30ºC gerührten Phiole in diesem Medium angelegt, dann werden 150 ml Vorkultur in 1,35 l Medium in den bei zwischen 28ºC und 32ºC gehaltenen Fermenter eingebracht; der pH wird durch den Zusatz von NaOH oder HCl bei 7,4 gehalten, und das Medium wird durch das Einführen frischer Luft unter einem geringen Druck belüftet.
Die Kultur wird fortgesetzt, bis etwa 8 g Biomasse pro l erhalten werden.

b) Produktionsphase

Das Produktionsmedium besteht in 800 ml entionisiertem Wasser aus einer Lösung von: 1,13 g Casein, 50 mg MgSO&sub4;.7H&sub2;O; 85 mg MgCl&sub2;.6H&sub2;O; 27 mg CaCl&sub2;.2H&sub2;O; 1 g Lysin, deren pH durch den Zusatz von KOH vor der Sterilisation auf 7 geführt wird; sie wird mit einer Lösung von 4 g K&sub2;HPO&sub4;, 250 mg Natriumhexametaphosphat und 45 g Glucose in 100 ml entionisiertem Wasser gemischt.
150 ml der Flüssigkeit, die am Ende der Wachstumsphase erhalten wird, werden in 1,35 l Produktionsmedium eingebracht; während der Fermentation wird die Temperatur zwischen 28ºC und 32ºC gehalten, der pH bei 7; die Glucose-Konzentration hat einen Wert von mehr als 10 g/l, und das Medium wird durch das Einführen frischer Luft unter einem geringen Druck belüftet.

c) Isolierung von nicht-viskosem Xanthan

Bei 80ºC werden 4 g Fermentationsflüssigkeit mit 30 ml Wasser gemischt, dann werden 90 ml Isopropanol zugesetzt; nach Ruhen der Mischung wird der Feststoff 15 h lang bei 55ºC filtriert und getrocknet.
In Tabelle I sind die Masse von so isoliertem Xanthan pro Kilo Medium sowie die Viskosität des Fermentationsmediums, aus dem es extrahiert wurde, angegeben.
Die Viskositätsmessungen wurden bei 25ºC mit einem Brookfield-Viskosimeter, ausgestattet mit Mobil-LVT, mit einer sich bei 30 UpM drehenden Nadel 2 oder 3 durchgeführt. Tabelle I

d) Trennung der Zellen

2 g des gemäß c) erhaltenen Feststoffs werden in 100 ml Wasser suspendiert, und die Mischung wird 30 min lang bei 12 000 g zentrifugiert. Der Zentrifugationsrückstand wird abgetrennt und das Xanthan durch den Zusatz von Isopropanol in einer klaren Lösung ausgefällt.

Beispiel 2:

In einer anderen Fermentation beträgt nach 24 h Produktion die Viskosität der Flüssigkeit 10 mPa.s und die Masse von Xanthan 13,75 g/kg Flüssigkeit; dann werden der Flüssigkeit 100 mg/l Natriumhexametaphosphat zugesetzt. Unter diesen Bedingungen beträgt die Viskosität nach 40 h 20 mPa.s und die Masse von Xanthan 20,40 g/kg.

Claims

1. Xanthomonas campestris-Stamm, hinterlegt bei der CNCM unter der Nr. I-956.

2. Verfahren zum Erhalten von Xanthan, dadurch gekennzeichnet, daß der Xanthomonas campestris-Stamm CNCM I-956 in einem Nährstoffmedium, das 50 bis 500 mg/l eines alkalischen Hexametaphosphats und 1 bis 15 mg/l Calciumionen enthält, kultiviert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Wachstumsphase des Mikroorganismus in einem Medium, das Glycerin als einzige Kohlenstoffquelle enthält, stattfindet.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß Natriumhexametaphosphat verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4 zum Erhalten eines Xanthans, dessen Viskosität wässeriger Lösungen bei 10 g/l, bei 25ºC, weniger als 700 mPa.s beträgt, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation angehalten wird, wenn die Viskosität des Mediums zunimmt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in die Fermentationsflüssigkeit 50 bis 200 mg alkalisches Hexametaphosphat pro 1 Medium eingebracht werden, wenn die Viskosität des Fermentationsmediums steigt.

7. Xanthan, welches durch das Verfahren nach Anspruch 5 oder 6 erhältlich ist, dessen Viskosität wässeriger Lösungen bei 10 g/l, bei 25ºC, weniger als 700 mPa.s beträgt.

8. Xanthan, welches durch das Verfahren nach Anspruch 5 oder 6 erhältlich ist, dessen Viskosität wässeriger Lösungen bei 10 g/l, bei 25ºC, weniger als 250 mPa.s beträgt.