DE2723166C3

DE2723166C3 - Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharide

Info

Publication number: DE2723166C3
Application number: DE2723166A
Authority: DE
Inventors: Trevor Rodney Jarman; Renton Clive Righelato
Original assignee: Tate and Lyle PLC
Current assignee: Tate and Lyle PLC
Priority date: 1976-05-28
Filing date: 1977-05-23
Publication date: 1979-10-11
Also published as: GB1513061A; US4110162A; AU2550477A; LU77433A1; IT1083007B; FR2352880A1; FI771705A; IL52146A0; JPS52145596A; SE7706261L; BE855083A; NL7705898A; DE2723166B2; JPS5542839B2; CA1086671A; FR2352880B1; DE2723166A1; NO771843L; DK235377A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines alginatartigen Polysaccharids durch Kultivierung von Bakterien der Spezies Azotobacter vinelandii.

Alginsäure, eine hydrophile kolloidale Kohlenwasserstoffsäure, ist ein variables Block-Copolymeres, das sich aus D-Mannuronsäure- und L-Guluronsäure-Einheiten zusammensetzt Obwohl Alginsäure selbst praktisch unlöslich in Wasser ist, kann sie einfach durch Neutralisieren mit geeignetem Alkali löslich gemacht werden. Eine der besonderen Eigenschaften von Alginatlösungen ist deren hohe Viskosität bei niedrigen Konzentrationen, wobei, falls gewisse zweiwertige Ionen wie Kalzium oder Magnesium zugesetzt werden zu den Lösungen von Alginaten, eine Gelierung eingeleitet wird. Die besonderen physikalischen Eigenschaften von Alginsäure und Alginaten ermöglicht eine vielfältige industrielle Verwertung in Form von Emulgatoren, Stabilisatoren und Verdickungsmitteln.

Alginate und Aiginsäuren sind technisch durch Extraktion gewisser Spezies von braunem Seetang, beispielsweise Laminaria digitata und Ascophyllum nodosum, worin sie einen erheblichen Anteil an den Zellwandungen ausmachen, gewonnen worden. Diese üblichen Seetangextraktionsverfahren weisen aber den Nachteil auf, daß sie von einem Nachschub von Alginat enthaltendem Seetang als A'jsgangsmaierial abhängig sind. Das Verfahren ist schwierig durchzuführen wegen der Mengen an benötigtem Seetang, und eine erhebliche weitere Reinigung kann erforderlich sein, insbesondere für ein für Lebensmittelzwecke oder pharmazeutische Zwecke verwendetes Material.

Wegen dieser Schwierigkeiten wurden in den ¹ ei ij:-,,)-:i'n(vi J.niriTi ;;lfiiiatähnliche Polysaccharide (lurcl Kultivieren von verschiedenen Spezies von In der GB-PS 13 94 413 wird eine besondere Auswahl für diese Bedingungen angegeben, wobei man besonders gute Ausbeuten an Polysacchariden erhält In dieser Patentschrift wird ein ähnliches Verfahren wie in der vorerwähnten Patentschrift beschrieben und beansprucht, aber die Konzentration an Phosphat in dem Medium wird auf 0,1 bis 0,8 mMol begrenzt, und während der Kultivierung wird der pH des Mediums im Bereich von 7,0 bis 8,2 aufrecht gehalten.

In der GB-PS 13 94 413 wird wiederum betont, daß man die besten Ergebnisse mit niedrigen Phosphatkonzentrationen erzielt. Unter kontinuierlichen Kulturbedingungen begrenzt eine Komponente des Mediums immer das Wachstum der Mikroorganismen: alle anderen Nährstoffe werden im Überschuß zur Verfügung gestellt Bei niedrigen Phosphatmengen kann das Phosphat selbst das limitierende Substrat sein, in Abhängigkeit von der Zugängigkeit der anderen Nährstoffe.

Der Zucker, entweder ein Monosaccharid oder ein Disaccharid, der in dem Kulturmedium verwendet wird, ist die Quelle aus der das Polysaccharid aufgebaut wird. Deshalb wird üblicherweise sowohl bei einem absatzweisen wie bei einem kontinuierlichen Verfahren eine unbegrenzte Menge an Zucker zu dem Mikroorganismus gegeben, so daß man ein Maximum an Ausbeute an Polysaccharid erhält, und jede Kürzung an Zucker wird als nachteilig auf die Gesamtausbeute angesehen. Der Überschuß an Zucker, welcher nicht von den Mikroorganismen verbraucht wurde, bleibt in dem Kulturmedium nachdem die Zellen und das Polysaccharid entfernt worden sind. Dieses Verfahren ist natürlich verschwenderisch hinsichtlich der Zuckerquellen, aber verursacht auch erhebliche Verschmutzungsprobleme, wenn der Abfluß in Gewässern, wie Flüssen oder Seen assimiliert wird. Der Überschuß an Zucker bedingt in dem Abfluß einen hohen biologischen Sauerstoffbedarf (B. O. D.) und ergibt somit eine Epoxidierung des Wassers in

welches der Abfluß fließt, wodurch dann das tierische und pflanzliche Leben nachteilig beeinflußt werden. Jeder Versuch, die Menge an zugeführtem Zucker bei einem kontinuierlichen Fermentaü'onsverfahren dieser Art zu beschränken, stößt auf erhebliche Probleme, weil 5 das System unstabil wird und nur schwierig kontrolliert werden kann.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß bei einer tatsächlichen Beschränkung der Zuckerzufuhr zu einem kontinuierlichen Fermentationssystem derart, in daß der Zucker der wachstumsbeschränkende Bestandteil in dem Medium wird, eine gute Ausbeute an Polysaccharid erzielt wird und daß das System stabil und leicht zu kontrollieren ist, während der Abfluß im wesentlichen frei von Zucker ist und infolgedessen einen sehr viel niedrigeren B. O. D. hat.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids zur Verfugung gestellt, wobei das Polysaccharid aus einem partiell acetylierten variablen Block-Copolymeren von 1 —4-verbundenen D-Mannuronsäure- und L-Guluronsäure-Resten besieht, und das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Bakterium der Spezies Azotobacter vinelandii kontinuierlich unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium kultiviert, wobei das Kulturmedium als wesentlichen Bestandteil wenigstens ein Monosaccharid oder Disaccharid als Kohlenstoffquelle und Quellen von Phosphat Molybdän, Eisen, Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat enthält und wobei das Medium eine fixierte Quelle an jo Stickstoff und/oder Stickstoff enthaltendem Belüftungsgas enthält und die Konzentration der durch das Saccharid gegebenen Kohlenstoffquelle in dem Medium limitierend auf das Wachstum der 3akterien ist, wobei während der Kultivierung der pH in dem Medium im js Bereich zwischen 6,0 und 8,2 gehaltet wird.

Jeder Stamm von Azotobacter vinelandii kann beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Besonders wertvolle Stämme, welche besonders gute Ausbeuten an Polysaccharid ergeben, sind die, die jeweils in den beiden vorher genannten Patentschriften genannt worden sind und welche die Kultur-Sammelnr. NCIB 9068 und NCIB 8799 und die Kultur-Sammelnr. NCIB 8660 tragen. Diese Stämme sind vom National Collection of Industrial Bacteria, Tony Research Station, P.O. Box31, 135 Abbey Road, Aberdeen, Schottland, erhältlich und werden in dem Sammlungskatalog beschrieben.

Die Menge der in dem Medium verwendeten Kohlenstoffquelle aus Monosaccharid oder Disaccharid hängt von der Zellkonzentration in der Fermentationsvorrichtung ab: Je höher die Zellkonzentration um :so höher ist die Menge a;i Saccharid, welche limitierend ist Es wurde beispielsweise gefunden, daß bei einem chemisch definierten Medium der Art, wie es in Beispiel 1 der GB-PS 13 31771 beschrieben wird, eine Saccharosekonzentration von 24 mMol wirksam limitierend ist bei einer Zellkonzentration von etwa 1,3 g/l, wenn der Respirationsgrad annähernd 16 mMol Sauerstoff/g Zelle/h ist In ähnlicher Weise ist eine t>o Saccharosekonzentration von 240 mMol wirksam limitierend bei einer Zellkonzentration von etwa 13,6 g/l und einem Respirationsgrad von etwa 5 mMol Sauerstoff/g Zelle/h. Diese Ergebnisse können bei Verdünnungsgraden von 0,15 bzw. 0,05h-' erzielt werden. μ

In jedem speziellen Falle kann man erkennen, ob die Konzentration an Saccharose (oder eines anderen Mono- oder Disaccharide) tatsächlich limitierend i:>t.

indem man die Saccharosekonzentration erhöht und die Auswirkung auf die Zellkonzentration beobachtet Wird die Konzentration einer nichtlimitierenden Komponente in dem Medium erhöht, so beobachtet man keine merkliche Veränderung der Zellkonzentration; wird jedoch die Konzentration der limitierenden Komponente erhöht, so reagiert die Zellkonzentration sehr schnell durch eine Erhöhung.

Es wurde festgestellt, daß unter üblichen kontinuierlichen Kulturbedingungen, beispielsweise bei solcl en, bei denen ein Chemostat verwendet wird (siehe Herbert Elswoth und Telling, 1956, Journal of General Microbiology, 14,601), besonders vorteilhafte Saccharosemengen so hoch wie 240 mMol sein können, aber- es kann keine obere Grenze für die Saccharosekonzenlraiion festgestellt werden, mit Ausnahme der, die durch praktische Überlegungen hinsichtlich der Beeinflussung des kontinuierlichen Fermentationsverfahrens diktiert wird.

Wie immer die Menge an Saccharose in dem Medium auch ist, vorausgesetzt, daß sie echt das Wachstum von A. vinelandii limitiert, ergibt sich ein im wesentlichen von Restzucker freier Abfluß. Weiterhin wird die Zuckermenge in dem Kulturmedium selbst einfach bei einem stabilen Niveau kontrolliert, weil es tatsächlich der Mikroorganismus selbst ist, der hier als Kontrollmittel wirkt.

Von den verschiedenen Mono- und Disaccharide^ die als Kohlenstoffquelle bei der Herstellung von Polysacchariden mittels Azotobacter vinelandii geeignet sind, wurde Saccharose als bevorzugte Verbindung erkannt.

Abgesehen von der Anwendung der limitierenden Bedingung für die Kohlenstoffquelle aus dem Mono- oder Disaccharid, kann das Medium ansonsten jede der üblichen Komponenten enthalten, die bei der Herstellung von Polysacchariden aus Azotobacter vinelandii verwendet werden.

Es wurde jedoch festgestellt, daß die Menge an Sauerstoffzufuhr in bezug steht zu der Wirksamkeit, mit welcher die Kohlenstoffquelle aus dem Monosaccharid oder Disaccharid in ein Polysacchäi id umgewandelt wird. Bei kontinuierlichen Kulturbedingungen ist es die Beziehung der Sauerstoffmenge zu der Zellkonzenixation, welche kritisch ist und nicht die Sauerstoffkonzentration in dem Medium als solche. Hohe Sauerstoffmengen beschleunigen die Respiration des Mikroorganismus und verwandeln dadurch Saccharose (oder eine andere Kohlenstoffquelle) in Kohlendioxid. Andererseits beschränken Sauerstoff limitierende Bedingungen die Bildung des Polysaccharids. Eine sorgfältige Einstellung der Sauerstoffzufuhr kann jedoch eine Saccharoseumwandlungszahl von etwa 30% oder sogar über 40% ergeben, wodurch sich eine viel bessere Verwertung der Kohlenstoffquelle ergibt Typischerweise wird die Sauerstoffaufnahme auf 5 bis 20 mMol O₂/h/g Zelle beschrankt

Eine Veränderung der Sauerstoffzufuhr zu der Kultur kann auf verschiedene Weise erfolgen. Zunächst kann die Konzentration an Sauerstoff in dem Gas, gewöhnlich Luft, welches während der Fermentation durch die Kultur geleitet wird, verändert werden, indem man die Luft mit Stickstoff oder einem Inertgas verdünnt oder indem man die Luft mit Extrasauerstoff anreichert. Zweitens kann der Druck des durch die Kultur geleiteten Gases verändert werden, so daß der Auflösungigrad vermindert wird. Drittens kann die Wirksamkeit, mit welcher der Sauerstoff in der Gasphase in die wäßrige Phase überführt wird

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verändert werden, indem man die Gas-Flüssig-Mischeigenschaften verändert, was am einfachsten durch eine Veränderung der Rohrgeschwindigkeit und Wirksamkeit des Rührers erfolgt Eine Kombination von zwei oder mehr dieser Verfahren kann gleichfalls angewendet werden, um das richtige Gleichgewicht zwischen Stickstoff und Sauerstoff zu gewährleisten.

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher beschrieben.

Beispiel 1

Herstellung von Alginat

unter Kohlenstoff limitierenden Bedingungen

bei einer kontinuierlichen Kultur

Azotobacter vinelandii NCIV 9068 wurde kontinuierlich in einer kontinuierlichen Kultur des Chemostat-Typeü(Herbert Elsworth&Telling, 1956, Journal of General Microbiology, 14, 601) unter Verwendung von Azotobacter vinelandii NCIB 9068 in einer kontinuierlichen Kulturvorrichtung mit eir>em Kulturvolumen von 1,0 I, wobei die Menge an Phosphat in cHn angegebenen Konzentrationen abnahm, gezüchtet Das Medium wurde zu der Kultur mit 150 ml/h gepumpt, und die über ein Ablaß-Standrohr überfließende Kulturbrühe wurde in ein Aufnahmegefäß aufgenommen. Die Temperatur wurde auf 30⁰C eingestellt Der pH wurde durch automatische Zugabe von 1 M NaOH auf 7,4 kontrolliert. Luft wurde in die Fermentationsvorrichtung in einer Menge von 1 l/Min, durchperlen gelassen, und die Rührgeschwindigkeit wurde so eingestellt, daß die Sauerstoffaufnahme im Bereich von 10 bis 30 mMol/g Zelle/h lag. Täglich wurden Proben aus der Fermentiervorrichtung entnommen, und die Proben wurden untersucht hinsichtlich der Konzentration der Zellmasse und des Polysaccharide. Zu jeder 40 ml Probe wurden 0,8 ml 0,5 M EDTA und 0,8 ml 5 M NaCI gegeben. Die Proben wurden dann mit 25 000 g 40 Minuten zentrifugiert Die erhaltenen Zellkügelchen wurden in destil^|:ertem Wasser wieder suspendiert, 40 Minuten mit 25 000 g zentrifugiert und das Überstehende wurde dekantiert. In vorgewägten Röhrchen wurde das Sediment bei 105⁰C 12 Stunden getrocknet und dann gewägt. Das Polysaccharid wurde aus dem Überfließenden der ersten Zentrifugierung durch Zugabe von 3 Volumina Propan-2-ol ausgefällt Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, im Vakuum 24 Stunden bei 45°C getrocknet und dann gewägt

Das Kulturmedium, dessen endgültige Zusammensetzung in Tabelle 1 angegeben ist, wurde hergestellt und zu der Kultur in zwei Ansätzen gegeben. Ansatz (1) wurde 1 Stunde in T.wei Teilen bei 1 kg/cm² autoklavisiert und nach dem Kühlen aseptisch vereint Ein Teil enthielt Saccharose, KH₂PO₄ und K₂HPO₄ in 14 I, der andere Teil enthielt MgSO₄, NaCI und Spurenelemente mit Ausnahme von Ca und Fe in 4 1. Ansatz (2) enthielt CaCI₂ und FeCI₂ in 21; das CaCI₂ wurde in 131 autoklavisiert, und das FeCl₂ wurde filtersterilisiert und dann zu der Masse des Ansatzes (2) hinzugegeben. Ansätze (1) and (2) wurden der Kultur durch getrennte Leitungen zugegeben, wobei (1) in einer Menge von 135 ml/h und (2) in einer Menge von 15 ml/h zugegeben wurden.

Die Kohlenstofflimitierung wurde gezeigt, indem man die Saccharosekonzentration in dem Medium auf 40 g/l erhöhte. Innerhalb 5 Stunden stieg die Zellkonzcntration um mehr als 10% an. Die Menge an Saccharose wurde durch g. I. c. bestimmt.

Die Menge an gebildetem Polysaccharid pro g Zelle unter Kohlenstofflimitierung und die Menge an Resisaccharose werden in Tabelle 2 gezeigt. Die Restsaccharosemenge, die unter üblichen Bedingungen erhalten wird, bei denen die Saccharose nicht der begrenzende Nährstoff ist, kann so hoch wie 10 niMol oder 15 mMol sein, wie ein Vergleich zeigt.

Beispiel 2

to Verwendet man das in Tabelle 1 gezeigte Medium, bewirkte eine Zuckermenge die lOmal der von Beispiel 1 entsprach, eine Wachstumsbegrenzung bei einem Verdünnungsgrad von 0,05 h-¹. Die Restzuckermenge war zu vernachlässigen aber eine Polysaccharidkonzentration von 20 g/l wurde erhalten, entsprechend einer 25%igen Umwandlung.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung, wenn man die Sauerstoffaufnahme nicht begrenzt. Ein Respiratior.sgrad von 8OmMoI O₂ZhZg Zt-iie (im Gegensatz zu 16 bzw. 5,2 mMol O₂/h/g Zelle in den Beispielen 1 und 2) ergibt einen Abfall an Umwandlung um 14%.

Dieses Beispiel zeigt jedoch, daß d°r bei der Belüftung zugeführte Stickstoff zumindest zum Teil durch eine fixierte Stickstoffquelle ersetzt werden kann.

Tabelle 1	Zugegebene	Menge (g/i Kulturmedium)	Beispiel .1
Kulturmedium	Beispiel 1	Beispiel 2	4
Bestandteil	8	80	(-- 12mM)
	(= 24mM)	(- 24OmM)	0.032
Saccharose	0,064	0,096	0.12
	0,25	0.375	0,2
KH₂PO₄	1,6	1,6	0.2
K₂HPO₄	1,6	1,6	0.001
MgSO₄ ■ 7 H₂O	0,008	0,008	0.043
NaCl	0,34	0,34	0.002
Na₂MoO₄	0,017	0,25	2,9X10"'
CaCI₂-2 H₂O	23X10 ³	23x10 ■	1,2X10 ³
FeCl₂-2 H₂O	9X10 ³	9X10 ■'	0.09/10 ■
H₃BO₄	0,7X10 ^:'	0,7X10 '	1.2x10 ■
CoSO₄-7H₂O	9X10 ³	9X10 '	0,1 xiO -
MnCI₂-4H₂O	0,8X10 ³	0,8X10 -¹
ZnSO₄ ■ 7 H₂O
CuSO₄ -7 H₂O

(NH₄)₂SO₄

1.0

Tabelle 2

Alginatbildung unter kohlenstofTlimitierten Bedingungen bei einer kontinuierlichen Kultur

Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3

Konzentrationen 24 240 12

limitierendem
Substrat im Kulturmedium (mMj

Zellkonzentration 1,3 13,6 0.9

(g/l)

1ΐΜΐ·.ι.Ί/ιιημ

l(.!s|-iil I Beispiel .' HeKp

Rcspir;iti()Msgr;icl ld τ..¹ 2Κ

(niM ()./h/p /clic)

Polysaccharid- 2.2 20 ().5d

kon/cntration (g/1)

I Iniwandlunys- 2X 25 11

Wirksamkeit ("..)

(venvendeles Subslrat /Ii gebildetem I'nlvsaccharid)

Restsaecharose im (I.^ (I 0

Kulturmedium ImMi

I'olysacdiarid- 1.' 1.47 0,(,2

ausbeute

pro g /clic (g)

Vcrdi'innungsgrail 0.15 0.05 (1.15

Produktivität 0.33 1.0

-- Polysateharid-

kon/entration &

Verdünnungsgrad

(g/l/h)

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids aus einem partiell acetylierten variablen Block-Copolymeren von 1 —4-verbundenen D-Mannuronsäure- und L-Guluronsäure-Resten, bei dem ein Bakterium der Spezies Azotobacter vinelandii unter an aeroben Bedingungen kontinuierlich in einem wäßrigen Kulturmedium kultiviert wird, wobei das wäßrige Kulturmedium als wesentliche Bestandteile wenigstens eine Kohlenstoffquelle aus einem Monosaccharid oder Disaccharid enthält und Quellen von Phosphat, Molybdän, Eisen, Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat, wobei das Medium eine fixierte Quelle an Stickstoff und/oder Stickstoff enthaltendem Belüftungsgas enthält und der pH des Mediums während der Kultivierung im Bereich von 6,0 bis 8,2 gehalten wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der durch das Saccharid gegebenen Kohlenstoffquelle in dem Medium limitierend für das Wachstum der Bakterien ist

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an zugeführtem Sauerstoff auf den Bereich beschränkt wird, welcher eine optimale Umwandlung in das Polysaccharid ergibt

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß die Sauerstoffaufnahme zwischen 5 bis 20 mMol O₂/h/g Zelle liegt

Azotobacter, insbesondere Azotobacter vinelandii gebildet Die durch diese Mikroorganismen gebildete Aginsäure ist strukturell ähnlich der aus Seetang gewonnen, mit der Ausnahme, daß sie partiell acetyliert ist

Es ist bekannt, daß bei der Herstellung von Polysacchariden unter Verwendung von Stämmen von Azotobacter vinelandii eine Anzahl von Faktoren kritisch ist, insbesondere der pH-Wert des Mediums und

ίο auch die Menge an Phosphat in dem Medium.

In der GB-PS 13 31771 wird ein Verfahren beschrieben und beansprucht zur Herstellung eines Polysaccharids, bei dem ein Mikroorganismus der Spezies Azotobacter vinelandii unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert wird, wobei das Nährmedium wenigstens ein Monosaccharid und/oder Disaccharid als Kohlenstoffquelle und als wesentliche Bestandteile Quellen von Molybdän, Eisen, Phosphat, Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat enthält, und wobei kontrollierte pH-Bedingungen erforderlich sind, nämlich derart, daß ein pH im Bereich von 6.5 bis 8,5 wenigstens während der ersten Hälfte der Fermentationsperiode aufrechterhalten wird und ein pH-Bereich im Bereich von 4,5 bis 8,5 für den Rest der Fermentationsperiode, falls eine solche vorhanden ist, bis eine erhebliche Bildung an Polysaccharid erfolgt ist, worauf dann das gebildete Polysaccharid isoliert wird. Das in diesem Verfahren verwendete Kulturverfahren kann eine absatzweise oder eine kontinuierliche Kultur

jo sein.