DE2723165C3

DE2723165C3 - Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharide

Info

Publication number: DE2723165C3
Application number: DE2723165A
Authority: DE
Inventors: Lynda Deavin; Renton Clive Righelato
Original assignee: Tate and Lyle PLC
Current assignee: Tate and Lyle PLC
Priority date: 1976-05-28
Filing date: 1977-05-23
Publication date: 1979-10-11
Also published as: AU2550777A; GB1513104A; NL7705897A; DE2723165A1; SE7706260L; DE2723165B2; FR2352879B1; CA1087123A; LU77431A1; BE855084A; US4130461A; NO771842L; JPS5530360B2; DK235277A; FI771704A; FR2352879A1; IT1083006B; JPS52145595A; IL52145A0

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines alginatartigen Polysaccharids durch Kultivieren von Bakterien der Spezies Azobacter vinelandii.

Alginsäure, eine hydrophile kolloidale Kohlenwasserstoffsäure, besteht aus einem unterschiedlichen Block-Copolymeren zusammengesetzt aus D-Mannuronsäureeinheiten und L-Guluronsäureeinheiten. Obwohl Alginsäure selbst praktisch unlöslich in Wasser ist, kann sie durch Neutralisation mit einem geeigneten Alkali leicht löslich gemacht werden. Eine der besonderen Eigenschaften von Alginatlösungen ist deren hohe Viskosität bei sehr niedrigen Konzentrationen; wobei bei Zugabe von gewissen zweiwertigen loneii, wie Kalzium oder Magnesium zu Lösungen von Alginaten, eine Gelierurig eingeleitet wird. Die ungewöhnlichen physikalischen Eigenschaften von Alginsäure und Alginaten ermöglichen einen weiten technischen Anwendungsbereich als Emulgatoren, Stabilisatoren und Verdickungsmittel. Sie können beispielsweise in der Nahrungsmittelindustrie als Emulsionsstabilisatoren für Eiscreme verwendet werden, als Gelierungstnittci Iu.· Miiehpudding ui.d als Verdickungsmittel für Soßen, sowie als Schaumstabilisatoren für Hier, pluü :ι.,ι/ι' ■. h können si¹.· «ils Emulatoren uii.l (.Ίτλ',ιη'Ά--:- :■:.'< iur Tablette, ah Susp-.-nsionr.r-i":! f-"'r '^:-:>'-■■- ! ils absorbicbare (...■Ic fiir 1.1 ■ ::^:-.<J·. ^v ■ n ■ · 'endet werden. In der !'.1.111:1 ':i.l "lt;\i ■: werden yr als

Leime, für Beschichtungsmassen, Überzugsmassen, Farbstoffe und Druckfarben verwendet und in der Landwirtschaft können sie als Bodenverbesserer eingesetzt werden.

Alginate und Aiginsäuren werden technisch durch Extraktion gewisser Spezies von braunem Seetang, beispielsweise Laminaria digitata und Ascophyllum nodosum gewonnen, wobei sie einen erheblichen Anteil der Zellwandungen bilden.

Dieses übliche Extraktionsverfahren von Seetang weist den Nachteil auf, daß man auf den Nachschub von Alginat enthaltendem Seetang als Ausgangsmaterial angewiesen ist. Das Verfahren läßt sich auch nur schwierig durchführen wegen der Mengen an zu verarbeitendem Seetang und eine erhebliche weitere Reinigung wird manchmal erforderlich, insbesondere wenn ein Material für Nahrungsmittel und pharmazeutische Anwendungen benötigt wird.

Aufgrund dieser Schwierigkeiten sind in den vergan genen Jahren alginatähnliche Polysaccharide hergestelli worden durch Kultivierung von verschiedenen Spezies von Azotobacter insbesondere Azotobacter vinelandii Die Alginsäure die durch diese Mikroorganismer gebildet wird, ist strukturell ähn'ich der aus Seetang gewonnenen, mit der Ausnahme, daß sie zum Tei acetyliert ist.

Es ist bekannt, daß die Herstellung von Polysacchariden unter Verwendung eines Stammes von Azotobactei vinelandii kritisch abhängig von einer Zahl vor Faktoren ist, insbesondere von dem pH des Medium; und auch von der Menge des Phosphats in dem Medium.

In der GB-PS 13 31771 wird ein Verfahren zui Herstellung von Polysacchariden beschrieben, das au: einem partiell acetylierten variablen Block-Copolymei von 1 —4-verbundenen D-Mannuronsäure- und L-GuIu ronsäure-Resten besteht, bei dem ein Mikroorganismu: der Spezies Azotobacter vinelandii unter aerober Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium enthal tend wenigstens ein Monosaccharid und/oder Disaccha rid als Kohlenstoffquelle und enthaltend als wcsentlicht Bestandteile Quellen von Molybdän, Eisen, Phosphat Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat, unte; kontrollierten pH-Bedingungen, so daß ein pH in Bereich von 6,5 bis 8,5 für wenigstens die erste Hälft« der Fermentationsperiode und im Bereich von 4,5 bis 8,! für den Rest der Fermentationsperiode sofern eini solche vorliegt, kultiviert wird, bis eine wesentlichi Bildung des Polysaccharids stattgefunden hat, worau das gebildete Polysaccharid isoliert wird. Die in diesen Verfahren angewendete Kultivierungsmethodc kam absatzweise oder kontinuierlich sein.

In der Beschreibung wird betont, daß die Menge ai Phosphat in dem Wachstumsmedium eine wesentlich' Rolle hinsichtlich der Ausbeute an Polysaccharid spiel· Es wird in der dortigen Beschreibung vorgeschlager daß niedrige Phosphatmengen die Ausbeute erhöhei und es wird eine Phosphatkonzentration von 0,015 bi 1.4 mMol, vorzugsweise 0,2 bis 0.7 mMol vorgeschlagcr Unter diesen Bedingungen werden Polysacchariden /entrationen von etwa 2,5 bis 3.0 g/l erhalten.

in der GB-PS 13 34 413 wird eine besondere Auswar der Bedingungen zur Erzielung besonders gute Ausbeuten an Polysacchariden beschrieben. In diese Patentschrift wird ein iihnli: hi:s Verfahren v. if in rlc vorerwähnten Patentschrift . esc!i;icben und bean sprucht. n'ier dir Ko" cntr't·'
Mediun. ist auf 0 ' bi··- i milder Kultiviorun!· viril ^: τ ρ"

Verfahren ν. ι
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von 7,0 bis 8,2 gehalten. Unier diesen Bedingungen können Polysaccharidkonzentrationen von 3 bis 3,5 g/l erhalten werden.

In der GB-PS 13 94 413 wird wiederum betont, daß die besten Ergebnisse bei niedrigen Phosphatkonzentrationen erzielt werden.

Es wurde nun gefunden, daß bei einem kontinuierlichen Fermentationsverfahren dieser Art die tatsächliche Konzentration an Phosphat in dem Medium unter bestimmten Bedingungen erheblich höher sein kann als in den früheren Patentschriften betont wurde.

Unter kontinuierlichen Fermentierungsbedingungen ist es ein wesentliches Erfordernis, daß die Kultur unter begrenzten Phosphatbedingungen durchgeführt wird. Das heißt, daß es die Menge an Phosphat in dem Medium ist, welche der bestimmende Faktor für die Konzentration des Mikroorganismus wird.

Dabei ist zu beachten, daß die Konzentration an Zellen des in dem Ferment vorhandenen Mikroorganismus eine Funktion der Konzentration des Phosphates ist, welche Grenzbedingungen bei einer kontinuierlichen Kultur ergibt. Je höher die Phosphatkonzentration, um so höher ist die Konzentration an vorhandenen Zellen bei Grenzbedingungen. Unter der Voraussetzung, daß dieses Prinzip angewendet wird, ist es möglich, phosphatbegrenzte Bedingungen bei kontinuierlichen Kulturen zu erzeugen, bd Phosphatmengen, die erheblich im Überschuß über denen liegen, die in den früheren Patentschriften offenbart wurden und wobei man viel höhere Polysaccharidkonzentrationen, beispielsweise bis zu 27 g/l Polysaccharid, erzielt, insbesondere wenn man niedrigere Verdünnungsgrade anwendet

Gemäß der vorliegenden Crfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Poiysai iiarids aus einem partiell acetylierten variablen Block-Copolymeren aus 1 —4-verbundenen D-Mannuron- und L-Guluronsäure-Resten zur Verfügung gestellt, bei dem ein Bakterium der Spezies Azotobacter vinelandii unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, enthaltend als wesentlichen Bestandteil wenigstens ein Monosaccharid oder ein Disaccharid als Kohlenstoffquelle und Quellen von Phosphat, Molybdän, Eisen, Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat, kontinuierlich kultiviert wird, wobei das wäßrige Kulturmedium eine bestimmte Menge an Stickstoff und/oder Stickstoff enthaltendem Belüftungsgas enthält und die Konzentration des Phosphates in dem Medium begrenzend wirkt auf die Konzentration der Bakterien und wenigstens 1,OmMoI beträgt, und wobei während der Kultivierung der pH des Mediums im Bereich von 6,0 bis 8,2 gehalten wild.

Jeder Stamm von Azotobacter vinelandii kann beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Besonders wertvolle Stämme, weiche besonders gute Ausbeuten an dem Polysaccharid ergeben sind die in den beiden früheren Patentschriften erwähnten, welche die Kultur-Sammelnr. NCIB 9068 und NCIB 8799 (ragen, sowie der Stamm, welcher die Kultur-Sammelnr. NCIB 8660 trägt. Diese Stämme sind erhältlich vom National Collection of Industrial Bacteria, Terry Research Station, P.O. Box .31, 135 Abbey Road, Aberdeen, Schottland, und werden in dem Sammlungskitalog beschrieben.

Die Phosphatmenge, die in dem Medium verwendet wird, variier! in Abhängigkeit vor der Zellkonzentra-I ion in dem Fermcntatiot^gdaß: je höher die /.ellkonzeniration, um so hohe. ¹Si die Phosphatmenge, die limitierend ist Es wurde beispielsweise gefunden, daß bei Verwendung eines chemisch definierten Mediums der Art, wie es in Beispiel 1 der GB-PS 13 31 771 beschrieben wird, einer Phosphatkonzentration von 1,0 mMol und einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,15 l/h wirksam limitierend ist bei einer Zellkonzentration von etwa 2,3 g/l.

Eine Phosphatkonzentration von 2,0 mMol ist wirksam limitierend bei einer Zellkonzentration vou etwa 4 g/l, während eine Phosphatkonzentration, die so hoch wie 2,0 mMol ist, wirksam limitierend bei einer Zellkonzentration von etwa 4,7 g/l ist Bei niedrigeren Verdünnungsgraden erhöht sich die Zellkonzentration, d. h. die gesamte Zellmasse bei einer speziellen !imitierenden Phosphatkonzentration, wahrscheinlich durch eine Erhöhung des einzelnen Zellgewichtes. Somit ist bei einem Verdünnungsgrad von 0,05 l/h 3,0 mM Phosphat limitierend bei einer Zellkonzentration von etwa 14 g/l.

In jedem speziellen Fall kann ein Anzeichen dafür, ob die Phosphatkonzentration tatsächlich limitierend ist, durch Erhöhung der Phosphatkonzentration und Beobachten der Auswirkung auf die Zellkonzentration erkannt werden. Wenn die Konzentration einer nicht limitierenden Komponente in dem Medium erhöht wird, wird keine erhebliche Veränderung der Zeükonzeniration beobachtet; wird dagegen die Konzentration der limitierenden Komponente erhöht, so spricht die Zellkonzentration sehr schnell durch eine Erhöhung an. Beispielsweise bewirkt eine Erhöhung der limitierenden Phosphatkonzentration um das 2fache eine wenigstens 10%ige Erhöhung der Zellkonzentration innerhalb 5 Stunden.

Es wurde gefunden, daß unter üblichen kontinuierlichen Kultivierungsbedingungen, beispielsweise unter Verwendung eines Chemostats (siehe Herbert EIsworth und Teilung, 1956, Journal of General Microbiology, 14,601) besonders vorteilhafte Phosphatmengen im Bereich von 2,0 bis 3,0 mMol liegen, wobei man eine Zeilkonzentration von etwa 4 bis etwa 4,7 g/l bei Verdünnungsgraden von 0,15 h~' oder etwa 14 g/l bei 0,05 h-' erzielt. Bei Anwendung dieser Mengen wurde eine Polysaccharidkonzentration von bis zu etwa 27 g/l gefunden. Es kann keine obere Grenze der Phosphatkonzentration festgelegt werden, angenommen von der Grenze, die durch praktische Überlegungen diktiert wird, wie sie bei kontinuierlichen Fermentierungsverfahren wesentlich sind.

In der erwähnteil früheren Patentschrift wurde angezeigt, daß ein weiterer Faktor wichtig ist bei der Bildung von Polysaccharid unter Verwendung von Azotobacter vinelandii, und zwar die Menge an Sauerstoff, welche dem Fermentationssystem zugeführt wird. Sauerstofflösungsmengen von etwa 5 bis 50, vorzugsweise etwa 8 bis etwa 20 mMol Sauerstoff pro 1 Kulturmedium pro Stunde werden wort erwähnt.

Es wurde gefunden, daß die Wirksamkeit, mit welcher das angewendete Monosaccharid oder Disaccharid in ein Polysaccharid umgewandelt wird, in Beziehung steht zu der Menge der Sauerstoffzufuhr. Bei kontinuierlichen Kultävierungsbedingüngen trifft dasselbe für Sauerstoff zu, was auch für Phosphat zutrifft, nämlich daß eine Beziehung zwischen dem Sauerstoffgehalt und der Zellkonzentration besteht, die wesentlich ist und nicht die Sauerstoffkonzentration im Medium als solche. Es wurde festgestellt, daß zwar eine Sauerstoffzufuhr von etwa 50 mMol/g Zelle/h unter pbosphatlimitierenden Bedingungen eine Sacrharoseiitr.vanrllijng von etwa

9% ergibt, daß aber eine Sauerstoffzufuhr von etwa 7 bis etwa 22 mMol/g Zelle/h eine Saccharoseumwandlung von über 40% ergibt. Eine Sauerstoffzufuhr von 20,5 mMol/g Zelle/h hat eine Saccharoseumwandlung von etwa 49% ergeben.

Die tatsächliche Sauerstoffaufnahme in mMol/l/h entsprechend diesen Zahlen hängt selbstverständlich von der Zellkonzentration im Fermentationsgefäß ab. Die Aufnahme pro l/h liegt im allgemeinen in dem in den früheren Patentschriften beschriebenen Bereich, aber es n?uß betont werden, daß es die Beziehung zwischen Sauerstoffzufuhr und Zellkonzentration ist, die wesentlich ist.

Eine Veränderung der Sauerstoffzufuhr zu der Kultur kann auf verschiedene Weise bewirkt werden. Zunächst kann die Konzentration an Sauerstoff in dem Gas, im allgemeinen Luft, welches in die Kultur während der Fermentierung eingeleitet wird, verändert werden, indem man die Luft mit Stickstoff oder einem Inertgas verdünnt oder indem man die Luft durch Extrasauerstoff anreichert. Weiterhin kann man dm Druck des in die Kultur eingeleiteten Gases verändern, so daß die Lösungsgeschwindigkeit variiert. Drittens kann die Wirksamkeit, mit welcher der Sauerstoff in der Gasphase in die flüssige Phase überführt wird, verändert werden, indem man die Gas-Flüssigkeits-Mischeigenschaften verändert, was am einfachsten durch eine Veränderung der Geschwindigkeit und der Wirksamkeit des Rührers erfolgt. Eine Kombination von zwei oder mehreren dieser Verfahren kann auch angewendet werden, um das korrekte Gleichgewicht zwis.hen Stickstoff und Sauerstoff sicherzustellen.

Um das Polysaccharid in hohen Mengen zu erzielen. und eine gute Wirksamkeit hinsichtlich der Umwand-

Tabelle 1

Zusammensetzung des Wachstumsmediums

IJcslanCiCil	Konzentration	(g/1) [millimolar
	Beispiel 1	Beispiel
Saccharose	60	60
KII₂PO₄	°-⁰³²l[l,G]	0,064 ι
K₂HPO₄	0,12 I	0.25 '
MgSO₄7H₂O	1.6	1,6
NaCI	1,6	1,6
Na₂MoO₄	0,008	0.008
CaCI-2H₂O	0,34	0,34
FeCMH₂O	0,017	0,017
H₁BO₄	0,023	0,023
CoSO₄7H₂O	0,009	0,009
MnCMH₂O	0,007	0,007
ZnSO₄7H,O	0,009	0,009
CuSO₄7H₂O	0,0008	0,0008
FeSO₄7II₂O	-	-

[2,0|

Vier kontinuierliche Kulturen vom Chemostat-Typ (Herbert et al., wie vorher erwähnt) unter Verwendung von Azotobacter vinelandii NCIB 9068 in einer kontinuierlichen Kulturvorrichtung mit einem Kulturvolumen von 1,0 ! wurden jeweils mit einem der sterilen Medien, wie in Tabelle 1 angegeben, versetzt, und zwar mit den dort angegebenen Phosphatkonzentrationen.

lung des Mono- oder Disaccharids zu erhalten, ist es erforderlich, die Wschstumi.geschwindigkeil der Bakterien zu überwachen und gelrennt davon den Respira lionsgrad, so daß die Zufuhr von Sauerstoff zu den Bakterien einerseits nicht begrenzt ist und andererseits nicht unnötig hoch ist. Dabei muß betont werden, daß die Sauerstoffzufuhr nicht limitierend sein muß, weil dadurch die Bildung des Polysaccharids erniedrigt wird. Andererseits bewirken unnötig hohe Respirationsgrade, die durch einen hohen Sauerstoffgehalt sich ergeben, daß ein großer Anteil der Kohlehydf atquelle zu Kohlendioxid oxidiert wird, wodurch eine niedrige Umwandlungswirksamkeit sich ergibt.

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiele i bis 4

Es wurden verschiedene Medien gemäß Tabelle 1 verwendet:

Die Medien wurden hergestellt und den Kulturen in zwei Ansätzen zugegeben: Ansatz (ι) wurde autoklavisiert mit 1 kg/cm² während 1 Stunde in zwei Teilen, die nach dem Abkühlen aseptisch kombiniert werden. Der eine Teil enthielt Saccharose. KH₂PO₄ und K₃HPOj in 14 i, der andere Teil enthielt MgSOi · NaCI und Spurenelemente mit Ausnahme von Kalzium und Eisen in 4 1. Ansatz (2) enthielt CaCl₂ und FeCI₂ in 2 I; das CaC l· wurde in 1.9 1 autoklavisiert und das FeCI₂ wurdc nltersterilisiert in 100 ml und dann zu der Masse des Ansatzes (2) gegeben. Ansätze (1) und (2) wurden zu dem Kulturmedium durch gersnnte Leitungen zugeführt, wobei (1) mit der 9facher: jesch windigkeit von (?) zugegeben wurde, so daß qk Konzentration in c-jr Kultur wie in Tabelle 1 angegeben, sich einstellte.

Beispiel 3

0.096 1
0.38 '
1.6
1.6

0.008
0.34
0.017
0.023
0.009
0.007
0,009
0,0008

[3,01

Bespiel 4

120

0.096 ;
0.38 ^!
1.6
1.6

0.008
0.34
0.025
0.23
0.009
0,007
0,009
0,0008

Beispiel

13.01

20

0,008 I 0,032 ' 0,2 0,2 0,008 0,043

10.251

0,003

Die Ansätze (1) und (2) wurden den Kulturen in einer kombinierten Menge zugepumpt, wobei man die Verdünnungsg-ade, die in Tabelle 2 angegeben werden, erhielt, und die Kulturbrühe floß über einen Standrohrüberlauf in ein Aufnahmegefäß. Die Temperatur wurde wie in Tabelle 2 angegeben, eingestellt.

Der pH wurde auf 7.4 durch automatische Zugabe von

21 23 165

I M NaOh eingestellt. I.lift wurde in die Fermentations vorrichtung in einer Menge von I l/Min, geperlt und die Rührgeschwindigkeit wurde so eingestellt, daß die Saueraufnahme im Bereich von IO bis (0 mMo|/g Zelle/h lag. Aus dem lermentationsg'.'fäß wurden täglich Proben entnommen und I Intersiichiingen der Zcllmassen und der Poiysaccharidkonzentrationen durchgeführt. Zu jeder 40 ml Probe wurden O₁H ml Ο,¹) M KDTA und 0,8 ml 5 M NaCI gegeben. Die Proben wurden dann 40 Minuten mit 25 00Og zentrifugiert. Die erhaltenen Zcllkügelchen wurden in destilliertem Wasser wieder suspendiert. 40 Minuten mit 25 000 g zentrifugiert und das Überstehende wurde dekantiert.

Libelle 2

PoK saeebariilbildung unter phosphallimitierien Bedingungen

I.in \<>rher gewogenes Kohl, eiilhallend das Sedimenl ■Aiirde 12 S'unden Ihm 10") ( getrocknei und dam gewogen. Das Poksaccharid wurde von dem I !herste lienden iler ersien Zentrifiigierung durch Zugabe von
Voltimenteile Propan-.' öl ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und im Vakuum 2« Stunden bei 45 ( getrocknet Die Phosphatlimitieniitf. wiirJe bei Phosphatkonzentralionen von 1.OmMi)I In¹ 5.0 mMol erzielt. Besonders geeignete Konzenti aiionei an Polysacchariden wurden unter Verwendung \oi Medien, einhalten.¹ 2.0 bis i.O mMol zugefügten Phosphat, erhallen.

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In allen Fällen wird gezeigt, daß die Phosphatkon/.entration die Zellkonzentraiion limitiert, indem die Phosphatkonzentration auf das 2fache erhöht wird: innerhalb von 5 Stunden beobachtete man eine Erhöhung der Zellkonzentration von wenigstens 10%.

Beispiel 5

Auswirkung auf die Polysaccharidausbeute durch

verschiedene Belüftungsgeschwindigkeiten im
Kulturgefäß unter phosphatlimitierten Bedingungen

150 ml/h) /ugcgeb-.:n. Fuft wurde zu der Kultur in einei Menge von 1.7 l/Min, gegeben. Der Respirationsgrat des Organismus wurde durch Veränderung der Rührgc schwindigkeit eingestellt, wobei man die Kultur eir konstantes Stadium erreichen ließ, (eweils wenn eir konstantes Stadium erreicht wurde, wurde die Polysac charidbildung gemessen, indem man mit Propan-2-o einen Niederschlag bildete und anschließend da; Trockengewicht feststellte, das Zellprodukt wurde durch Bestimmung des Trockengewichtes gemesser und die rückständige Saccharose wurde durch g. I. c

kontinuierlichen Kultur unter Verwendung eines wäßrigen Kulturmediums der Zusammensetzung der Tabelle I in einer gerührten Tankfermentiervorrichtung gezüchtet.

Zu dem Medium in der Fermentiervorrichtung wurde ein auf einem Agar-Nährboden gewachsener Impfstoff zugegeben und die Fermentierung wurde absatzweise 24 Stunden bei 30°C bei einem pH von 7.5 vorgenommen. Zine kontinuierliche Mediumzufuhr wurde mit einem Verdünnungsgrad von 0.15h¹ (d.h.

unter Verwendung eines paramagnetischen Sauerstoff analysators und die COj-Entwicklung unter Verwen dung eines infrarot-COrAnalysators.

Immer wenn ein konstantes Stadium erreicht war wurden zu dem KulturgefäQ 2 ml sterile Phosphatlösunt (0.125 M) zugegeben. In jedem Fall erhöhte sich die Konzentration an Bakterien, wodurch angezeigt wird daß die Zellkonzentration durch die Phosphatkonzen tration limitiert worden ist. Die Ergebnisse sind ir Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Auswirkung des Respirationsgrades auf die Wirksamkeit der Saccharoseumwandlung in ein Poiysaccharid

S₁IUCr-U)Il- .lutnahme	/cllkon	zentration	Pol>saccharid- konzentration	Verwendete Saccharose	l mwandlung von Saccharose in Poiysaccharid	Rührge- schwindigkeit
immol/g Zelie/h)	tg/h		(5/1)	(g/l)		(LpMl
7.0	0.5		0.70	1.65	42%	400
Ϊ2.4	0.42		0.84	1.8	47"-;,	500
20.5	0.44		1.09	2.2	49%	600
2S.2	0.44		1.16	4.7	25%	700
51.0	0.60		0.89	9.9	9%	870

Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, daß die Ausbeute an Poiysaccharid aus Saccharose von 9% bei höheren Belüftungsgraden (und infolgedessen höheren Respirationsgraden) auf 47 bis 49% erhöht werden kann bei Sauerstoffaufnahmen zwischen 12 und 20 mMol/g Zelle/h.

Claims

97 I^ Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids aus einem partiell acetjlierten variablen Block-Copolymer aus 1 —4-verbundenen D-Mannuron- und L-Guluronsäure-Resten, bei dem ein Bakterium der Spe/ies Azotobacter vinelandii kontinuierlich unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium kultiviert wird, wobei das Kulturmedium als wesentliche Bestandteile wenigstens ein Monosaccharid oder Disaccharid als Kohlenstoffquelle und Quellen von Phosphat, Molybdän, Eisen, Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat enthält, und das Medium eine bestimmte Quelle an Stickstoff und/oder ein Belüftungsgas enthaltend Stickstoff, enthält und der pH des Mediums im Bereich zwischen 6,0 und 8,2 gehalten wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Phosphat in dem Medium limitierend auf die Konzentration des Bakteriums ist und wenigstens I₁OmMoI beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als A. vinelandii ein Stamm NCIB 9068, 8789 oder 8660 verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Phosphatkonzentration in dem Medium 2,0 bis 3,0 mMol beträgt

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sauerstoffaufnahme durch die Kultur auf ein Niveau beschränkt wird, das eine optimale Umwandlung des Monosaccharids oder Disaccharide in das Polysaccharid ergibt.

5 Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Sauerstoffaufnahme auf eine Menge von etwa 7 bis 22 mMol/g Zelle/h beschränkt wird.