DE2708239A1 - Verfahren zur erzeugung von polysacchariden durch fermentation - Google Patents
Verfahren zur erzeugung von polysacchariden durch fermentationInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Erzeugung von Polysacchariden durch Fermentation von Gluciden bzw.
Kohlehydraten (insbesondere Zuckern) mittels eines geeigneten Mikroorganismus, insbesondere des Genus Xanthomonas und insbesondere
Xanthomonas campestris sowie die so erhaltenen Polysaccharide.
Es ist bekannt, daß zur Erzeugung von extrazellularen Polysacchariden
durch diese Mikroorganismen das zu fermentierende
Milieu gewöhnlich eine Quelle für Glucide bzw. Kohlehydrate, eine Quelle für Phosphor, eine Quelle für Magnesium, das ein Enzymaktivator ist und eine Stickstoffquelle, die üblicherweise durch "Distiller's Solubles" (US-Patent 3 000 790) umfaßt sowie Kleie oder Mehl von ganzen Körnern, wie Sorghum, Soja oder Mais (US-Patent 3 271 267) oder auch "corn steep"
(US-Patent 3 355 447 "Maisquellwasser").
Milieu gewöhnlich eine Quelle für Glucide bzw. Kohlehydrate, eine Quelle für Phosphor, eine Quelle für Magnesium, das ein Enzymaktivator ist und eine Stickstoffquelle, die üblicherweise durch "Distiller's Solubles" (US-Patent 3 000 790) umfaßt sowie Kleie oder Mehl von ganzen Körnern, wie Sorghum, Soja oder Mais (US-Patent 3 271 267) oder auch "corn steep"
(US-Patent 3 355 447 "Maisquellwasser").
Diese organischen Stickstoffquellen weisen den Nachteil auf,
daß sie außer der Lieferung von assimilierbarem Stickstoff
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auch unlösliche Verunreinigungen zuführen, welche sich in dem Polysaccharid, das aus der Fermentationsbrühe extrahiert wird, wiederfinden.
auch unlösliche Verunreinigungen zuführen, welche sich in dem Polysaccharid, das aus der Fermentationsbrühe extrahiert wird, wiederfinden.
Verunreinigungen verleihen dem aus dem extrahierten Produkt gewonnenen Gel eine gewisse Färbung und ein trübes Aussehen
und bewirken außerdem, daß das Gel für gewisse Verwendungszwecke, beispielsweise die Rückgewinnung des Erdöle
ungeeignet ist. Tatsächlich beeinträchtigt die Anwesenheit wenig löslicher Verunreinigungen und großer Proteinmoleküle
die Filtrierbarkeit der aus diesen Polysacchariden erhaltenen Gele und erschwert ihr Eindringen in die Gesteinszwischenräume.
Man hat bereits verschiedene Reinigungstechniken vorgeschlagen, jedoch sind diese kostspielig und wenig befriedigend.
Gegenstand der Erfindung ist die Lieferung einer völlig löslichen Quelle für anorganischem bzw. mineralischen Stickstoff.
Es ist bereits bekannt, gewisse mineralische bzw. anorganische Stickstoffverbindungen als Stickstoffquelle zur Erzeugung von
Polysacchariden durch Bakterien, insbesondere Xanthomonas, zu verwenden.
So wird von M. P. Starr ("The nutrition of phytopathogenic bacteria - I. Minimal nutritive requirements of the genus
Xanthomonas", J. Bacteriol. £1_, S. 131-143, 1946) die Verwendung
von Ammoniumchlorid angegeben. Jedoch ist beim Arbeiten in industriellem Maßstab die Anwesenheit von Cl~-Ionen in der
Brühe die Ursache für Korrosionen der Apparaturen.
Man hat auch bereits vorgeschlagen (US-Patent 3 391 060), Ammoniumnitrat als einzige Stickstoffquelle in dem Endstadium
der Fermentation zu verwenden; jedoch werden bei diesem Verfahren bis zu vier Vorstufen auf Medien, die als Stickstoffquelle
hauptsächlich Sojapepton enthalten, notwendig.
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Es wurde nun gefunden, daß man mittels Xanthomonas und insbesondere
Xanthomonas campestris ein Polysaccharid mit verbesserten physikalischen Eigenschaften erhalten kann, indem
mit einer beschränkten Anzahl von Stufen, welche drei nicht überschreiten, gearbeitet wird, wobei alle diese Stufen mit
Ausnahme der Anfangsstufe bei der Bildung des Inokulums auf Medien durchgeführt werden, welche als einzige Stickstoffquelle
Ammoniumphosphat enthalten, das gleichzeitig die für die Fermentation notwendige Phosphorquelle darstellt. Die
Durchführung dieser Fermentation erfordert bekanntlich, daß der pH-Wert in dem Bereich von 6 bis 7>5» vorzugsweise 6,5
bis 7»2, gehalten wird und infolgedessen wird dem Fermentationsmedium eine Puffersubstanz, wie Dikaliumphosphat, zugesetzt.
Wenn das Medium nicht gepuffert wird, kann man eine Vorrichtung zur Regulierung des pH-Wertes anwenden, wodurch
dem Reaktionsmilieu die notwendigen Mengen eines alkalischen Reagenz, wie Natriumhydroxid, Kaiiumhydroxid oder Kalk in
gelöster oder nicht-gelöster Form zugeführt werden.
Unter den Gluciden bzw. Kohlehydraten, die auf diese V/eise
zu Polysacchariden umgewandelt werden, kann man u.a. nennen:
Saccharose, Glucose, Fructose, Getreidestärken oder Maisstärken und ihre Hydrolysate usw.
Die Menge an Ammoniumphosphat, das als Stickstoffquelle verwendet
wird, beträgt 1 bis 6 g je Liter, ausgedrückt in Diammoniumphosphat,
vorzugsweise 1,3 bis 3 g je Liter.
Nach Beendigung der Fermentation isoliert man das Polysaccharid aus der Brühe in üblicher V/eise, beispielsweise indem man es
durch Zugabe eines niedermolekularen Alkohols oder Aceton oder eines Gemisches dieser Fällungsmittelyausfallt, den Niederschlag
abtrennt, wäscht, trocknet und zerkleinert. Das erhaltene Produkt ist dann durch Zugabe von Wasser zur Herstellung von
Gelen verwendbar, die eine erhöhte Viskosität und gute Filtrierbarkeit aufweisen.
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< S'
Die folgenden Beispiele erläutern in nicht beschränkender Weise die Erzeugung und die Eigenschaften der erfindungsgemäß erhaltenen
Polysaccharide.
Aus einer Kultur von Xanthoraonas campestris, die auf Gelose
in Röhrchen gehalten wird, beimpft man mit der Platinöse einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit 75 ml YIl-B ouill on; dieses Züchtungsmedium,
das von der DIPCO Chemical Company in entwässerter Form geliefert wird, hat die folgende Zusammensetzung:
Hefeextrakt für die Bakteriologie 3 g
Malzextrakt 3 g
Sojapepton für Bakteriologie 5 g
reine Glucose 10 g.
Nach 48 Stunden Inkubationszeit bei 28 bis 300C benützt man
den Inhalt dieses Erlenmeyer-Kolbens zur Beimpfung eines
Laboratorium-Fermentationsgefäßes von 10 1 Inhalt mit 6 1 eines sterilen Mediums folgender Zusammensetzwig:
Glucose 20 g/l
Diammoniumphosphat 1,5g/l
Dikaliumphosphat 3 g/l
Magnesiumsulfatheptahydrat O,25g/1
Antischaummittel 2 ml/l
Wasser ad 6000 ml/1.
Hier dient das Dikaüumphosphat als Puffer, um den pH-Wert
zwischen 6,9 und 7,5 zu halten.
Nach 64 Stunden Fermentation bei 28 bis 30 C unter Rühren und Belüften findet man keine Glucose mehr in dem Milieu. Die
Viskosität, gemessen mit dem Brookfield LVT-Viskosimeter zu
30 Umdrehungen je Minute und mit der Nadel Nr. 4, beträgt 4800 Centipoise und der Gehalt an Polysaccharid beträgt 14»4 g/kg,
was einer Ausbeute von 72$ entspricht.
Man arbeitet wie in Beispiel 1 beschrieben und beimpft 6 1
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des sterilen Milieus mit folgender Zusammensetzung:
Saccharose 20 g/l
Diammoniumphosphat 1,3 g/l
Magnesiumsulfatheptahydrat 0,25 g/l
Antischaummittel 2 ml/l
Wasser , ad 6000 ml/1,
der pH-Wert wird mittels KOH bei 6,7 gehalten.
Nach 68 Stunden Fermentation bei 28 - 3O°C unter Rühren und
Belüften ist die gesamte Saccharose umgewandelt. Die Viskosität des Mediums beträgt 5100 Centipoise und der Gehalt an Polysaccharide
beträgt 15»3 g/kg» was einer Ausbeute von 76,5$
entspricht.
Man arbeitet in gleicher Weise wie in Beispiel 1 und beimpft 6 eines sterilen Mediums der folgenden Zusammensetzung:
Maisstärke 20 g/l
Diammoniumphosphat 3 g/l
Magnesiumsulfatheptahydrat 0,25 g/l
Antischaummittel 2 ml/1
Wasser ad 6000 ml/l.
Der pH-Wert wird während der Fermentation durch NaOH bei 6,8 gehalten.
Nach 65 Stunden Fermentation beträgt die Viskosität des Mediums 5200 Centipoise und der Gehalt an Polysaccharid 15,1 g/kg,
was einer Ausbeute von 75»5$ entspricht.
Aus einer Kultur von Xanthomonas campestris, welche auf Gelose in Röhrchen gehalten wird, beimpft man mit der Platinöse einen
1 1-Kolben mit 150 ml YM-Bouillon.
Nach 48 Stunden Inkubationszeit bei 28 fcis 3O0C verwendet man
den Inhalt dieses Kolbens zur Beimpfung eines Labοratoriums-Fermentationsgefäßes
von 20 1 Inhalt mit 15 1 eines sterilen Melieus folgender Zusammensetzung:
Glucose 10 g/l
Diammoniumphosphat 1,5 g/l
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Dikaliuraphosphat 2 g/l
Magnesiumsulfatheptahydrat O,25g/l
Antischaummittel 2 ml/1
Wasser ad 15OOO ml/l.
Das Dikaliuraphosphat dient als Puffer zur Aufrechterhaltung
des pH-Wertes zwischen 6,9 und 7,5.
Nach 40 Stunden Inkubationszeit bei 28 bis 300C unter Rühren
und Belüften überführt man den Inhalt dieses Fermentationsgefäßes unter sterilen Bedingungen in ein 1300 1-Fermentationsgefäß
mit 1000 1 eines sterilen Mediums folgender Zusammensetzung:
Glucose 20 g/l
Diammoniumphosphat 1,5 g/l
Dikaliumphosphat 5 g/l
Magnesiumsulfatheptahydrat 0,25 g/l
Antischaummittel 2,5 ml/l
Wasser 1000 ml/1.
Das Dikaliumphosphat dient als Puffer für die Aufrechterhaltung des pH-Wertes zwischen 6,9 und 7,5.
Nach 60 Stunden Fermentation bei 28 bis 3O0C unter Rühren und
Belüften befindet sich in dem Milieu keine Glucose mehr. Die Viskosität beträgt 5800 Centipoise und der Gehalt an PoIysaccharid
beträgt 14,8 g/kg, was einer Ausbeute von 74$ entspricht.
Ein Teil dieser Brühe wird mit Isopropanol in der üblichen Weise zur Ausfällung des Polysaccharids versetzt, welches dann
gewaschen, getrocknet und zerkleinert wird.
Man verwendet das so erhaltene Pulver für Viskositäts- und Filtrierbarkeitsversuche im Vergleich mit einem industriellen
Polysaccharid, das durch Fermentation auf einem Milieu mit einer organischen Stickstoffquelle erhalten wurde.
Man mißt mit Hilfe eines Brookfield LVT-Viskosimeters die
Viskosität von Gelen, welche aus dem oben erhaltenen Polysac-
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charid und einem industriellen Polysaccharid hergestellt wurden.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestelt.
Arbeitsbed ingungen
Polysaccharid aus dem Milieu mit anorganischem
Stickstoff
Polysaccharid aus einem Milieu mit organischem Stickstoff
Gel zu 1$ in V/asser
Nadel Nr. 4,
30 Umdrehungen/Min. 2700 cPs Gel zu 0,3$ in Wasser
Nadel Nr. 2
3 Umdrehungen/Min. 2000 cPs Gel zu 1$ in Wasser
Adapter UL
0,6 Umdrehungen/Min. 350 cPs
2800 cPs
2000 cPs
340 cPs
Man stellt keine gravierenden Unterschiede zwischen den beiden Kategorien von Polysacchariden fest.
Man mißt das Volumen eines 0,1$-igen wäßrigen Gels, welches
durch ein Milliporenfilter mit einer Porosität von 0,45 u und
47 mm Durchmesser unter einem absoluten Druck von 2,4 bar filtriert wurde, nach 10 Minuten.
Das Polysaccharidgel, welches durch Fermentation mit einer anorganischen
Stickstoffquelle gemäß der Erfindung erhalten wurde, hat eine Piltrierbarkeit von 25 ml.
Das Gel des Polysaccharide, welches durch Fermentation mit einer organischen Stickstoffquelle erhalten wurde, hat eine
Filtrierbarkeit von 9 ml.
Aus diesen Versuchen wird ersichtlich, daß das erfindungsgemäß . erhaltene Polysaccharid Gele liefert, welche ähnliche
Viskositätseigenschaften haben wie die Gele von Polysacchariden,
die aus einem Milieu mit organischer Stickstoffquelle erhalten
wurden, daß jedoch die Filtrierbarkeit der erfindungsgemäßen Polysaccharidgele bedeutend besser ist.
709836/0757
Claims (3)
1. Verfahren zur Erzeugung von Polysacchariden durch Fermentation
von Gluciden bzw. Kohlehydraten mittels eines Mikroorganismus,
insbesoiidere des Genus Xanthomonas, dadurch gekennzeichnet,
daß man nach der Anfangsstufe der Bildung des Inokulums für die folgende oder die folgenden Stufen ein Fermentationsmedium
mit Ammoniumphosphat als einziger Stickstoffquelle
verwendet.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 1-6 g/l Ammoniumphosphat, vorzugsweise 1,3 "bis 3 g/l»
ausgedrückt als Diamnioniumpliosphat, verwendet.
3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß der pH-Wert des Fermentationsmediums in dem Bereich von 6 bis 7,5, vorzugsweise von 6,5 bis 7,2, gehalten
wird.
709836/0757
ORIGINAL INSPECTED
Applications Claiming Priority (1)
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