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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Xanthan unter Verwendung eines Stammes der Gruppe Xanthomonas campestris, bei welchem wachstumsanregende Substanzen eingesetzt werden.
Xanthan ist ein exozellulares anionisches Heteropolysaccharid, das durch Bakterien des Genus Xanthomonas gebildet wird. Es enthält Mannose, Glucose, Glucoronsäure, O-Acetylreste und acetalverknüpfte Brenztraubensäure. Auf Grund seiner Viskositäts- und rheologischen Eigenschaften wird Xanthan als Verdickungsmittel für wässerige Systeme verwendet. Ein breites Anwendungsgebiet befindet sich dabei auf dem Nahrungsmittelsektor, in der Industrie und der Landwirtschaft. Von besonderem. Interesse ist die zunehmende Verwendung von Xanthan bei der Sekundär- und Tertiärförderung von Erdöl. Xanthan ist gegenüber Salzen unempfindlich und über einen breiten pH-Bereich weitestgehend thermo- und viskositätsstabil.
Es sind bereits mehrere Verfahren zur Erzeugung von Xanthan bekannt, bei welchen Substrate, die ein Kohlehydrat, eine Phosphorquelle, eine Stickstoffquelle und eine Magnesiumquelle als Enzymaktivator enthalten, durch Mikroorganismen der Gattung Xanthomonas vergoren werden. Als Kohlehydrate kommen dabei insbesondere Glucose, Saccharose, Fructose, Stärkehydrolysate oder Melasse zum Einsatz. Als anorganische Stickstoffquellen dienen Ammoniumsalze, Mono- oder Diammoniumsulfat, Mono- oder Diammoniumphosphat oder Nitrate, wie z. B. Kalium-oder Natriumnitrat. Phosphor wird in Form von Dinatrium- oder Dikaliumphosphat oder als Mono- oder Diammoniumphosphat zugegeben. Als Magnesiumquelle kann Magnesiumsulfatheptahydrat, Magnesiumacetat oder Magnesiumchlorid eingesetzt werden.
Das Medium sollte auch Spurenelemente, wie Calcium, Zink, Bor, Mangan und Eisen, enthalten, die für das Zellwachstum essentiell sind. Wenn das Fermentationsmedium nicht gepuffert ist, muss der PH-Wert durch Zusatz von Natrium- oder Kaliumhydroxyd im Bereich zwischen 6, 2 und 7, 2 gehalten werden. Die bevorzugte Fermentations-
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Es ist weiters bekannt, bei der Fermentation als Stickstoffquelle gewisse Aminosäuren in reiner Form oder als natürliche Mischungen, wie z. B. Hefeextrakt, Maismazerationslaugen oder Kristallisationslaugen der Glutaminsäureerzeugung einzusetzen. Eine solche Massnahme bringt zwar eine gewisse Ausbeutesteigerung, doch hat sich gezeigt, dass das gebildete Xanthan qualitativ minderwertiger ist. Weiters wurde gefunden, dass ein Überschuss an Stickstoff eine Reduktion der produzierten Polysaccharidmenge mit sich bringt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, mit welchem eine verkürzte Gärzeit, eine hohe Produktivität und eine hohe Ausbeute unter Erreichung einer hohen Qualität in einem rein synthetischen Medium erzielt wird. Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass in der Anlaufphase der Gärung einer oder mehrere der essentiellen Nährstoffe, wie z. B.
Kohlehydrate, Stickstoff, Phosphor und/oder Schwefel, als wachstumslimitierende Faktoren eingesetzt werden, dass am Beginn der Produktionsphase die essentiellen Nährstoffe auf den vom Mikroorganismus benötigten Optimalwert ergänzt und die das Wachstum der Mikroorganismen anregenden Substanzen sowie zusätzlich noch das Wachstum regelnde Substanzen zugesetzt werden, wobei als Mikroorganismen der Gruppe Xanthomonas campestris vorzugsweise Xanthomonas betlicola ATTC 19047, Xanthomonas celebensis ATCC 19046 oder Xanthomonas vitians ATCC 19320 eingesetzt werden.
Dadurch wird die Bakterienpopulation immer in einem dem Wachstumsstadium und der Xanthanproduktion entsprechenden Masse gehalten, wodurch die für das Bakterienwachstum erforderlichen Kohlehydratmengen so gering wie möglich gehalten werden, was eine auf die eingesetzte Kohlehydratmenge bezogene Ausbeuteerhöhung mit sich bringt, wobei die Wachstumsphase schneller durchlaufen wird, was die Gesamtgärzeit entsprechend verkürzt. Ausserdem wird während der Hauptgärung die Bakterienpopulation annähernd konstant gehalten, u. zw. auf der für die Xanthanproduktion und die verwendeten Stämme optimalen Höhe, wodurch einerseits eine gleichmässige Xanthanerzeugung erzielt wird und anderseits nur eine minimale Menge des Kohlehydrats für das Zellwachstum und die Zellatmung verbraucht wird, wodurch besonders hohe Ausbeuten erreicht werden.
Es haben sich dabei die angeführten Stämme der Xanthomonas campestris- - Gruppe als besonders leicht zu steuernde und als auf die Zusatzstoffe besonders rasch reagierende Mikroorganismen erwiesen.
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Vorteilhafterweise können als wachstumsanregende Substanzen Sarcosin oder Anserin eingesetzt werden. Es hat sich gezeigt, dass schon geringe Mengen dieser Stoffe, wenn sie zusätzlich zur anorganischen Stickstoffquelle zugegeben werden, die Wachstumsphase erheblich abkürzen, wodurch in kürzerer Zeit mehr Produkt gebildet werden kann, als in Medien, die diesen Zusatz nicht enthalten, wobei es gleichgültig ist, ob in kontinuierlichem oder chargenweisem Verfahren gearbeitet wird. Weiters können als wachstumsregelnde Substanzen Verbindungen aus der Gruppe der Histamine, insbesondere 1-Methylhistamin, eingesetzt werden.
Dadurch wird besonders wirksam die Bakterienpopulation immer auf einem dem Wachstumsstadium und der Xanthanproduktion entsprechenden Niveau gehalten, wodurch nur geringe Mengen der eingesetzten Kohlehydrate für das Bakterienwachstum verlorengehen und die Hauptmenge der Kohlehydrate zu Xanthan verarbeitet wird, so dass hohe Ausbeuten und eine hohe Xanthankonzentration erzielt werden.
Zusammenfassend kann somit angeführt werden, dass durch das Zusammenwirken der erfindungsgemässen Massnahmen, nämlich die anfängliche Bremsung des Bakterienwachstums durch Einsatz von Nährstoffen als limitierenden Faktor, die Auffüllung der Nährstoffe zu Beginn der
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histamin, die angestrebte Erhöhung der Ausbeute unter Steigerung der Produktqualität erzielt wird. Wie schon erwähnt, kann das erfindungsgemässe Verfahren mit gleicher Wirkung sowohl chargenweise als auch kontinuierlich ausgeführt werden.
Die Erfindung wird nachstehend an Verfahrensbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1 : Man überträgt eine Kultur von Xanthomonas betlicola, ATCC 19047, die nicht älter als drei Tage sein soll, von einem Schrägagar, der 0, 5% Trypton, 0, 2% Glucose, 0, 5% Hefeextrakt, 0, 1% KH2PO. und 2% Agar enthält, in zwei Schüttelkolben mit je 100 ml steriler Maische, enthaltend 0, 3% Malzextrakt, 0, 3% Hefeextrakt, 1% Glucose und 0, 5% Pepton, und schüttelt 24 h auf einem Rotationsschüttler mit 200 Umdr/min und bei 26 C.
Dieses Inokulum dient der Beimpfung eines 5-Liter-Fermenters, der ein Medium folgender Zusammensetzung enthält :
1% Glucose, 0, 05% KH. PO. 0, 02% (NHJ 2SO., 0, 01% MgSO.. 7H2O, ergänzt durch Spurenelemente, u. zw. 0, 0002 g MnSO, 0, 0003 g ZnSO. 7H2O, 0, 0001 g Eisen-III-chlorid, 0, 0001 g Calcium- chlorid und 0,005 g Borsäure pro Liter.
Nach der Beimpfung wird die Belüftungsmenge auf 8. 10-7 M3/1. s-'eingestellt und bei 28 C Gärtemperatur für 12 bis 18 h bei einer Rührerdrehzahl von 300 Umdr/min inkubiert, bis eine optische Dichte, gemessen in 1 cm-Küvetten bei 540 nm, von etwa 4 erreicht ist. Zu diesem Zeit-
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zeigt, dass die Produktbildung beginnt. Man erhöht die Gärluftmenge auf 1, 33. 10-5 mall. S-1. Um weiteres Zellwachstum hintanzuhalten, gibt man 0, 0005 g/l 1-Methylhistamin hinzu und hält damit die optische Dichte auf 6 bis 7. Mit steigender Produktbildung erhöht man die Rührgeschwindigkeit auf 1000 Umdr/min.
Nach 60 h wurden 4, 7% Xanthan produziert, was einer Ausbeute, bezogen auf die eingesetzte Glucosemenge, von 94% entspricht, d. h. umgerechnet auf Produktbildung in der Zeiteinheit, 0,78 g/l/h.
Die Gewinnung des Xanthans aus der Kulturmaische erfolgt durch übliche Fällmethoden mit einem niedrigen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol, tertiärem Butanol u. dgl. Wirtschaftlicher könnte die Fällung in Gegenwart von Natrium- oder Kaliumchlorid erfolgen.
Beispiel 2 : Die Herführung des Inokulums erfolgt wie bei Beispiel 1, ausser dass Xanthomonas celebensis ATCC 19046 verwendet wird. Mit dem Inhalt der Schüttelkolben wird ein 5-Liter-Fermenter, der mit einer Maische analog Beispiel 1 gefüllt ist, beimpft, wobei nach 16 h Gärzeit der Inhalt dieses Fermenters als Inoku1um für einen 100-Liter-Fermenter dient, der für eine kontinuierliche Gärung eingerichtet ist. Das Medium dieses Fermenters weist ebenfalls gleiche Zusammensetzung
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auf wie das Medium gemäss Beispiel 1. Die Kultur wird 12 bis 16 h wachsen gelassen, u. zw. mit einer Belüftungsmenge von 8. 10-7 mall. S-1, einer Rührgeschwindigkeit von 300 Umdr/min und einer Gärtemperatur von 28 C, bis eine optische Dichte von 3 bis 4 erreicht ist.
Nach Zusatz von 0, 25 g/l Sarcosinhydrochlorid wird mit dem Zufluss von sterilem Medium begonnen, welches 8% Glucose, 0, 5% KH2PO , 0, 2% (NHhSO und 0, 0005 g/l 1-Methylhistamin enthält,
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auf 800 Umdr/min und die Belüftungsrate auf 1, 33. 10-1 mall. S-1 erhöht.
Nach etwa 48 h wird auf eine Verdünnungsrate von 0, 140 h-1 eingestellt. Nach 10 Turnovers, d. h. Austausch des Fermentervolumens durch Zugabe frischen Mediums, erhält man eine Ausbeute von 94, 8%, bezogen auf eingesetzte Glucose.
Die Gewinnung des gebildeten Xanthans erfolgt in gleicher Weise wie gemäss Beispiel 1.
Beispiel 3 : Die Herführung des Inokulums erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 1, ausser dass Xanthomonas vitians ATCC 19320 eingesetzt wird.
In einem 5-Liter-Fermenter wird eine chargenweise Gärung auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 angesetzt.
Nach 20 h erreicht die Kultur eine optische Dichte von 3, 5. Nach Ergänzung des Mediums auf 5% Glucose, 0, 5% Kaliumdihydrogenphosphat und 0, 2% Ammoniumsulfat sowie nach Zusatz von 0, 2 g/l Anserin erhöht sich die optische Dichte innerhalb von 3 h auf 6, 2. Durch Zusatz von 0, 5 mg/l 1-Methylhistamin kann man die optische Dichte auf 6, 8 halten.
Nach 64 h erreicht man eine Xanthankonzentration von 4, 81%, was einer Ausbeute von 96, 2% und einer Produktion in der Zeiteinheit von 0, 75 g/l/h entspricht.
Im beiliegenden Diagramm ist die Wachstumskurve vollausgezogen und die Xanthanbildungskurve strichpunktiert eingezeichnet, wobei Pfeil I den Zeitpunkt des Zusatzes von Anserin und Pfeil II den Zeitpunkt des Zusatzes von 1-Methylhistamin anzeigt. Am Kurvenverlauf ist dabei deutlich die Wirkung des Anserins, u. zw. nahezu sprunghafte Wachstumssteigerung, und jene des 1-Methylhistamins, u. zw. rascher Übergang in die stationäre Phase, erkennbar.
Mit allen drei Stämmen erhält man somit analoge Ergebnisse, u. zw. wahlweise in chargenweiser oder kontinuierlicher Kultur.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Xanthan unter Verwendung eines Stammes der Gruppe Xanthomonas campestris, bei welchem wachstumsanregende Substanzen eingesetzt werden, dadurch gekennzeichnet, dass in der Anlaufphase der Gärung einer oder mehrere der essentiellen Nährstoffe, wie z. B.
Kohlehydrate, Stickstoff, Phosphor und/oder Schwefel, als wachstumslimitierende Faktoren eingesetzt werden, dass am Beginn der Produktionsphase die essentiellen Nährstoffe auf den vom Mikroorganismus benötigten Optimalwert ergänzt und die das Wachstum der Mikroorganismen anregenden Substanzen sowie zusätzlich noch das Wachstum regelnde Substanzen zugesetzt werden, wobei als Mikroorganismen der Gruppe Xanthomonas campestris vorzugsweise Xanthomonas betlicola ATCC 19047, Xanthomonas celebensis ATCC 19046 oder Xanthomonas vitians ATCC 19320 eingesetzt werden.