DE69102640T2

DE69102640T2 - Verfahren zur herstellung von einer proteinhaltigen zusammensetzung.

Info

Publication number: DE69102640T2
Application number: DE69102640T
Authority: DE
Inventors: Thomas Naylor; Geoffrey Robson; Anthony Trinci; Marilyn Wiebe
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1990-05-21
Filing date: 1991-05-21
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2011-05-22
Also published as: JPH06500004A; AU7879191A; DK0530260T3; AU654488B2; ATE107474T1; ES2056651T3; EP0530260B1; WO1991017669A1; GB9011347D0; DE69102640D1; EP0530260A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer proteinhaltigen Zusammensetzung, insbesondere einer eßbaren, proteinhaltigen Zusammensetzung.
15 Die GB-A-1 210 356 und die GB-A-1 346 061 beziehen sich auf die Herstellung von eßbaren, proteinhaltigen Zusammensetzungen, wobei nicht-toxische Stämme von Pilzen unter aeroben Bedingungen in Kulturmedien kultiviert werden, die eine Kohlenstoffquelle und andere essentielle Nährstoffe enthalten, und die Kultivierung in solch einer Weise durchgeführt wird, daß die Kohlenstoffquelle der limitierende Nährstoff für das Wachstum ist.
Die GB-A-2 137 226 bezieht sich auf eine Verbesserung, bei dem die Kultivierung in solch einer Weise durchgeführt wird, daß Sauerstoff der limitierende Wachstumsfaktor ist.
Die Produkte der GB-A-1 210 356, GB-A-1 346 061 und GB-A-2 137 226 sollen fleischanaloge Produkte sein, zum Beispiel analog zu Rindfleisch oder Hühnchen. Um für diesen Zweck erfolgreich zu sein, müssen die proteinhaltigen Produkte eine Beschaffenheit aufweisen, die der des zu simulierenden Fleisches entspricht, insbesondere ein sogenanntes "Mundgefühl". Eine Schwierigkeit in diesem Zusammenhang besteht darin, daß die Struktur der proteinhaltigen Zusammensetzung von der Struktur des filamentösen Mikroorganismus, aus dem sie zusammengesetzt ist, abhängig ist und daß die Struktur solch eines filamentösen Mikroorganismus von der des zu simulierenden Fleisches unterschiedlich ist. Veränderungen in der Beschaffenheit des fleischanalogen Produktes können durch eine Veränderung in der Struktur des filamentösen Mikrorganismus erreicht werden. Es ist somit wichtig, die Struktur des filamentösen Mikroorganismus zu kontrollieren, insbesondere das Ausmaß der Verzweigung, welches in den Hyphen auftritt. Ein nützlicher Indikator für das Ausmaß der Verzweigung ist die "Einheitslänge des Hyphenwachstums". Dies kann dadurch bestimmt werden, daß die Gesamtlänge aller Filamente eines Mycels durch die Gesamtzahl der Hyphenspitzen in dem Mycel dividiert wird.
Wir haben herausgefunden, daß die Verzweigung der Hyphen in einem filamentösen Mikroorganismus durch die Regulation der Konzentration der Calciumionen in dem Medium, in dem der filamentöse Mikroorganismus kultiviert wird, gesteuert werden kann.
Demgemäß stellt die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer proteinhaltigen Zusammensetzung aus einem filamentösen Mikroorganismus bereit, wobei der filamentöse Mikroorganismus einen gewünschten Wert der Einheitslänge des Hyphenwachstums zeigt und das Verfahren die Schritte aufweist:
(i) Kultivierung des filamentösen Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle und Quellen für andere essentielle Nährstoffe enthält;
(ii) Testen auf einen Indikator der Hyphenverzweigung, zum Beispiel der Einheitslänge des Hyphenwachstums des filamentösen Mikroorganismus, der in dem Medium kultiviert wird; und
(iii) Kontrolle des Calciumgehaltes des Mediums, um ein Testergebnis in einem gewünschten Bereich zu erzielen.
Die Einheitslänge des Hyphenwachstums kann direkt, zum Beispiel durch die Verwendung eines Mikroskops, gemessen werden, wobei in einem Herstellungsverfahren wegen der Einfachheit der Messung Bestimmungen von physikalischen Eigenschaften, die durch Wechsel in der Einheitslänge des Hyphenwachstums verändert werden, die direkte Messung ersetzen können.
Die Erfindung weist ferner ein Verfahren für die Herstellung einer proteinhaltigen Zusammensetzung aus einem filamentösen Mikroorganismus aus der Gattung Fusarium, wobei das Verfahren beinhaltet, daß Fusarium unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium kultiviert wird, das eine Kohlenstoffquelle und Quellen von anderen essentiellen Nährstoffen enthält, und das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Kulturmedium Calciumionen in dem Bereich von 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup5; molar und vorzugsweise von 10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup5; molar enthält.
Die Kultivierung kann in einer bekannten Weise vollzogen werden, zum Beispiel in einer Chemostat-Kultur oder einer Turbidostat-Kultur. Um eine verbesserte Produktivität zu erzielen, wird jedoch bevorzugt, daß die Kultivierung in einer Turbidostat-Kultur abläuft, das heißt in einer Kultur, worin die Mehrheit der mikrobiellen Zellen keiner spezifischen Nährstoffbeschränkung mit Ausnahme der Calciumbeschränkung unterliegen. Wenn die Kultivierung in einer Turbidostat-Kultur abläuft, wird das Wachstum der mikrobiellen Zellen in dem Fermenter hydrodynainisch gesteuert.
Die Kultivierung kann stoßweise oder kontinuierlich ablaufen. Eine kontinuierliche Kultivierung wird bevorzugt.
Die Temperatur, bei dem das Verfahren vollzogen wird, kann gemäß dem besonderen, zu kultivierenden Mikroorganismus ausgewählt werden, um akzeptable Erträge und Umwandlungsverhältnisse zu erzielen. Typische Temperaturen liegen innerhalb des Bereiches von 25 bis 34ºC.
In ähnlicher Weise wird der pH, bei dem das Verfahren abläuft, vorzugsweise innerhalb des Bereiches gehalten, bei dem der spezifische Mikroorganismus ein maximales Wachstum zeigt. Der pH liegt typischerweise in dem Bereich von 5,0 und 8,0, insbesondere liegt der pH bei 6.
Die Kohlenstoffquelle in dem Kulturmedium kann jede geeignete Kohlenstoffquelle sein, zum Beispiel Stärke, Stärke enthaltende Materialien oder ihre Hydrolyseprodukte, zum Beispiel Glukose, Saccharose, Saccharose enthaltende Verbindungen oder hydrolysierte Saccharose, d.h. Invertzucker, oder deren Gemische. Die Kohlenstoffquelle kann somit hydrolysierte Kartoffel, Melasse, Glukose, Maltose, hydrolysierte Bohnenstärke oder Maniok aufweisen. Alternative Kohlenstoffquellen, wie Kohlenstoffquellen von tierischem Ursprung, zum Beispiel Milchmolke, können auch benutzt werden. In dem Kulturmedium werden ausreichende Mengen einer assimidierbaren Kohlenstoffquelle zusammen mit anderen essentiellen Wachstumselementen, wie Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Spurenelemente, aufrechterhalten, so daß das Wachstum des Mikroorganismus durch keiner dieser Nährstoffe begrenzt wird. Die gelöste Sauerstoffspannung (DOT) wird auf einem ausreichenden Niveau gehalten und vorzugsweise auf einem Niveau, bei dem der größte Teil der Kultur keiner Sauerstoffbeschränkung unterliegt. Zusätzlich zu den oben erwähnten Nährstoffen können ein oder mehrere Vitamine, wie Biotin, in dem Kulturmedium vorliegen.
Während des Verfahrens wird in bevorzugter Weise Kulturmedium ständig der Kultur zugeführt und die Kultur wird kontinuierlich aus dem Fennenter entfernt. Die entfernte Kultur kann dann behandelt werden, um davon den filamentösen Mikroorganismus abzutrennen. Bei einer typischen Behandlung wird die entfernte Kultur hitzebehandelt, filtriert und der erzielte Filterkuchen wird dann in einen Zustand formuliert, der für die Verwendung in Nahrungsprodukten geeignet ist.
Wenn das Kulturmedium ständig zugeführt und die Kultur kontinuierlich aus dem Fermenter entfernt wird, wird die Gesamtzahl der individuellen Mycelien in dem Fermenter durch die Bildung von neuen Hyphenfragmenten (Starterzellen) aufgrund der Konidienbildung und des Zellbruches bestimmt. Während der Kultivierung ist wichtig, daß die Starterzellen kontinuierlich in der Kultur gebildet werden. In idealer Weise sollten diese Starterzellen mit annähernd der gleichen Rate gebildet werden, mit der Zellen aus der Kultur entfernt werden. Wenn keine Starterzellen hergestellt werden, wird es im Kulturverlauf zu einem "Auswaschen" kommen.
Im allgemeinen ist die Einheitslänge des Hyphenwachstums eine direkte Funktion der Konzentration der Calciumionen in dem Fermenter. Bis zu einer Calciumion-Konzentration von 10&supmin;&sup5; M verändert sich normalerweise die Einheitslänge entsprechend dem Logarithmus der Konzentration der Calciumionen. Bei einer Konzentration von Calciumionen über etwa 10&supmin;&sup5; M ist die Einheitslänge des Hyphenwachstums weniger sensitiv gegenüber den Veränderungen in der Konzentration der Calciumionen.
Konzentrationen von Calciumionen von etwa 10&supmin;&sup9; M können durch die Verwendung von Komplexbildnern erzielt werden. Um solch niedrige Calciumionkonzentrationen zu erreichen, müssen die meisten, wenn nicht alle, dieser Rohmaterialien, zum Beispiel Nährstoffe, die nicht als Calciumquellen bei der Kultivierung des filamentösen Mikroorganismus verwendet werden, im wesentlichen frei von Calcium sein.
Die Kultivierung des filamentösen Mikroorganismus kann somit in einem Medium ablaufen, bei dem die Konzentration der Calciumionen in dem Bereich von 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup5; M liegt. Insbesondere beträgt die Calciumionkonzentration zwischen 10&supmin;&sup8; und 10&supmin;&sup5; M.
Das Zeitintervall zwischen der Entnahme von Proben und die Berechnung der Einheitslänge des Hyphenwachstums des filamentösen Mikroorganismus wird durch Faktoren wie die Größe des Fermenters, der verwendete Kultivierungstyp, zum Beispiel stoßweise oder kontinuierlich, Chemostat oder Turbidostat, des verwendeten spezifischen, filamentösen Mikroorganismus bestimmt. Normalerweise liegen die Zeiträume zwischen den aufeinanderfolgenden Proben in dein Bereich von 4 Stunden bis 24 Stunden.
Die Regulierung der Konzentration der Calciumionen kann auch von der spezifischen Wachstumsrate und des Wachstumsertrages des kultivierten, filamentösen Mikroorganismus beeinflußt werden. Die spezifische Wachstumsrate ist gemäß Steele et al, Journal of General Microbiology, 91, 362-368 (1975) definiert. Der Wachstumsertrag ist als die Massse der während der Kultivierung hergestellten Biomasse pro Einheitsmasse der während der Kultivierung zugeführten Kohlenstoffquelle, zum Beispiel Glukose, definiert.
Der filamentöse Mikroorganismus ist vorzugsweise ein Pilz, insbesondere ein Stamm von Fusarium und speziell Fusarium graminearum Schwabe Stamm IMI 145425, hinterlegt am 26. Februar 1970, und 154209 bis 154213, hinterlegt am 14. Januar 1971, wobei alle diese Stämme am 3. Februar 1976 öffentlich verfügbar wurden, sowie Varianten oder Mutanten dieser Stämme. Diese spezifischen Stämme von Fusarium graminearum sind in der GB 1 346 061 beschrieben, deren Offenbarung hier mit Bezug eingeführt ist. Diese spezifischen Stämme sind an dem CAB International Mycological Institut (IMI), Ferry Lane, Kew, Richmond, Surrey, England, hinterlegt. Der Stamm 145429 wurde auch gemäß dem Budapester Abkommen als IMI 346762 und auch als ATCC 20334 bei American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele verdeutlicht. In diesen wurde der Mikroorganismus Fusarium graminearum Schwabe Stamm IMI 145425 verwendet. Dieser wurde auf Erde bei 4ºC gehalten. Von Plattenkulturen, die für sieben Tage auf Vogel's Agar Medium (H.J. Vogel Microbial Genetics Bulletin, 13, Seiten 42 bis 44, 1956) wuchsen, wurden Sporensuspensionen in destilliertem Wasser geerntet. Die Sporensuspension wurde durch zwei Lagen eines Linsengewebes (Whatman) gefiltert, um die Mycelien-Biomasse zu entfernen. Die Sporen wurden durch zweimaliges Zentrifugieren bei 1500 g für drei Minuten gewaschen, wobei sie in 10 ml von destilliertem Wasser nach jeder Zentrifugation resuspendiert wurden.
Fusarium graminearum (IMI 145425) wuchs in 20 ml Volumen des Vogel's Mediums, das Glukose als Kohlenstoffquelle enthielt, wobei ein Mangel an zugeführtem Calcium bestand, und das 50 mM von 2-(N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES) als Puffer (pH 6) in 250 ml Flaschen (nephlos) enthielt.
Jede Flasche wurde mit 0,2 ml einer 10&supmin;&sup6; Sporensuspension inokkuliert und bei 200 rpm auf einem Drehschüttler mit einem 2,5 cm Hub geschüttelt.
Die Grundkonzentration an Calcium in diesem Medium war 3,5 uM (3,5 x 10&supmin;&sup6; M) (gemessen mit Atomabsorption).
Bei den Beispielen wurde die Einheitslänge des Hyphenwachstums (G) optisch bestimmt, wobei Mycelien, suspendiert in dem Wachstumsmedium und auf Objektträger aufgetragen, verwendet wurden. 25 Mycelfragmente wurden entlang von Quereinkerbungen, die sich entlang dem Objektträger befanden, gemessen, wobei dies ein Wert für eine Einheitslänge des Hyphenwachstums ergab, die durch
G = L/T
definiert ist, wobei
L = Gesamtlänge der Hyphen
T = Zahl der Hyphenspitzen
bedeutet. Alle Fragmente mit 5 oder mehr Spitzen wurden bestimmt, sofern sie nicht mit anderen Fragmenten in einem unlösbaren Ausmaß verbunden waren.

Beispiel 1

Eine Serie von Experimenten wurde mit einer Konzentration an Ca²&spplus;-Ionen im Bereich von 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup7; durchgeführt. Diese Konzentrationen wurden durch Zugabe eines filtersterilisierten (0,22 um, Whatman) Komplexbildners, Ethylenglycol-bis (B-Aminoethlether) N, N, N¹, N¹,-Tetra-Essigsäure (EGTA), zu dem Medium erzielt, so daß eine Konzentration des Komplexbildners von zwischen 0,5 bis 15 mM erreicht wurde.

Beispiel 2

Eine Serie von Experimenten wurde ähnlich Beispiel 1 durchgeführt, bei denen die Ca&spplus;&spplus;-Ionen in dem Bereich von 10&supmin;&sup7; bis 10&supmin;&sup5; vorlagen. Diese Konzentrationen wurden durch Zugabe verschiedener Konzentrationen von filtersterilisiertem Calciumchlorid (CaCl&sub2;) zu dem Medium, das 1 mM EGTA enthielt, erzielt.

Beispiel 3

Eine Serie von Experimenten wurden ähnlich denen von den Beispielen 1 und 2 durchgeführt, wobei die freie Ca&spplus;&spplus;-Konzentration zwischen 10&supmin;&sup5; und 10&supmin;² M lag. Solche Konzentrationen wurden durch die Zugabe von Calciumchlorid zu dem Medium erzielt.
Die Werte für die spezifische Wachstumsrate, den Wachstumsertrag, ausgedrückt durch den verbrauchten Nährstoff- Kohlenstoff zu dem hergestellten Zell-Kohlenstoff, die Einheitslänge des Hyphenwachstums und den Hyphendurchmesser wurden für jede Serie an Experimenten bestimmt und sind in der Tabelle I angezeigt. Tabelle 1 Calcium Konzentration (M) Einheitslänge des Hyphenwachstums (um) Hypendurchmesser (um) Spezifische Wachstumsrate (u) (hr&supmin;¹) Wachstumsertrag (Y)
Die Produkte mit einer Einheitslänge des Hyphenwachstums von weniger als 300 um zeigen eine gute Verzweigung und eine attraktive Beschaffenheit für bestimmte Nahrungsmittelprodukte.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer proteinhaltigen Zusammensetzung aus einem filamentösen Mikroorganismus, wobei:

(i) der filamentöse Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium kultiviert wird, das eine Kohlenstoffquelle und Quellen für andere essentielle Nährstoffe enthält;

(ii) ein Test auf einen Indikator der Hyphenverzweigung durchgeführt wird, zum Beispiel für die Einheitslänge des Hyphenwachstums des filamentösen Mikroorganismus; und

(iii) der Calciumgehalt des Mediums gesteuert wird, so daß ein Testergebnis in einem gewünschten Bereich aufrechterhalten wird.

2. Verfahren zur Herstellung einer proteinhaltigen Zusammensetzung aus einem filamentösen Mikroorganismus der Gattung Fusarium, wobei Fusarium unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium kultiviert wird, das eine Kohlenstoffquelle und Quellen für andere essentielle Nährstoffe enthält, und das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß das Kulturmedium Calciumionen in dem Bereich von 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup5; molar und vorzugsweise von 10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup5; molar enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die vorliegenden Zellen keiner Nährstoffbeschränkung außer einer Beschränkung an Calciumionen unterliegen.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren kontinuierlich durchgeführt wird und bei dem das Wachstum der Zellen durch die Steuerung der Verdünnungsrate gesteuert wird.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die Kultivierung kontinuierlich erfolgt.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die Temperatur in dem Bereich von 25ºC-34ºC liegt.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem der pH in dem Bereich von 5,0-8,0 liegt.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem das Nährstoffmedium als Kohlenstoffquelle Stärke, ein Produkt der Hydrolyse von Stärke, Glukose, Saccharose oder hydrolysierter Saccharose oder deren Gemische aufweist.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem ein Komplexbildner verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem der Mikroorganismus wenigstens einer der Fusarium qraminearum Schwabe Stämme IMI 145425 und 154209 bis 154213 oder eine Variantenmutante oder ein Abkömmling davon ist.

11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die aus dem Verfahren entfernte Kultur hitzebehandelt, filtriert und in einen Zustand formuliert wird, der für die Verwendung in Nahrungsmittelerzeugnissen geeignet ist.