DE2306459A1

DE2306459A1 - Pilzzuechtungsverfahren

Info

Publication number: DE2306459A1
Application number: DE2306459A
Authority: DE
Inventors: John Anderson; John Edward Smith
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1972-02-10
Filing date: 1973-02-09
Publication date: 1973-08-30
Also published as: BE795040A; JPS4912088A; FR2171358A1; FR2171358B1; IT1044788B; US3892629A; GB1398591A

Description

PATENTANWALTSBÜRO TlEDTKE - BüHLING - KfNNK

TEL· (0811) 539653-56 TELEX: 524845 ti pat CABLE ADDRESS: Germaniapatent München

8000 München 2 ο ο Π C Λ C Q Bavariarlng 4

Postfach 202403 9. Februar 1973 case B.24746

Imperial Chemical Industries Limited London, S. W. 1 / Großbritannien

Pilzzüchtungsverfahren

Die Erfindung betrifft ein industrielles Verfahren zur Züchtung eines.Pilzes und ein Verfahren zur Herstellung eines sekundären Metabolits, beispielsweise Citronensäure.

Es sind verschiedene industrielle Verfahren bekannt, bei denen chemische Verbindungen, beispielsweise Citronensäure und bestimmte Antibiotika als sekundäre Metabolite gebildet werden, wenn man Pilze auf einem geeigneten Nährmedium züchtet. Beispielsweise wird Citronensäure im allgemeinen bei einem ansatzweisen Verfahren erhalten, bei dem ein Stamm des Pilzes Aspergillus niger auf einem Nährmedium, das einen Zucker enthält, bei einer Temperatur zwischen 25 und 33°C,gezüchtet wird. Das Verfahren kann durchgeführt werden, indem man das Nährmedium in Schalen gibt und mit Pilzsporen inokuliert, wonach das Geflecht oder das Myzel des Schimmelpilzes zu wachsen beginnt und die Oberfläche des Mediums bedeckt. Alternativ kann das Verfahren in großen Fermentationsgefäßen durchgeführt werden, wobei das Medium

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gerührt und belüftet wird und das Schimmelwachstum homo- - gen innerhalb des Mediums verteilt ist.

Während des üblichen Entwicklungszyklus eines Pilzes wie Aspergillus niger in Anwesenheit von Nährmedien folgt auf die Inkubationsphase (die 6 bis 9 Stunden im Falle von Asp.ergillus niger dauert), während der die Pilzsporen quellen, ein Wachstum der Keimfäden. Die Mehrheit der Pilzsporen bildet einenoder.zwei Keimfäden,, und darauf folgt eine Phase des vegetativen Wachstums, deren Ausmaß und Dauer von den Umgebungsbedingungen abhängt, wobei Konidienträger_? die asexuellen Fortpflanzungssysteme gebildet werden.

Während der vegetativen Wachstumsphase wird von den gebildeten Hyphen ein Geflecht oder ein Myzel gebildet. Dies bringt Schwierigkeiten mit sich, wenn Zirkulationsfermentationsgefäße verwendet werden, wie es in der deutschen Patentschrift . ... *..' (deutsche Patentanmeldung P-entsprechend der britischen Anmeldung Nr. .35285/70) beschrieben -ist, und zwar in Verfahren, bei denen Pilze gezüchtet werden, da das Myzel dazu neigt, Blockierungen in dem Fermentationsgefäß zu verursachen.

Gegenstand der Erfindung ist ein industrielles Verfahren zur Züchtung eines Pilzes auf oder in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff

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und anorganische Nährstoffe enthält, wobei die Sporen des Pilzes bei einer Temperatur gehalten werden, die höher ist als die, bei der normales Hyphenwachstum (dieser Ausdruck wird im folgenden definiert) auftritt, aber unterhalb der Temperatur", bei der die Sporen untätig bleiben, mindestens während einer Zeit während der Inkubationsphase, wie sie im folgenden definiert wird, während des Entwicklungszyklus.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines sekundären Metabolits durch Züchten eines Pilzes auf oder in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und anorganische Nährstoffe enthält, wobei die Sporen des Pilzes bei einer Temperatur gehalten werden, die höher ist als die, bei der ein übliches Hyphenwachstum (wie es im folgenden definiert wird) auftritt, aber unterhalb der Temperatur, bei der die Sporen untätig verbleiben, mindestens während einer Zeitdauer während' der Inkubationsphase (wie es im folgenden definiert wird) während des Entwicklungszyklus.

In der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Ausdruck "Hyphenwachstum" oder "hyphales Wachstum" das Wachstum von faden- oder faserartigen Hyphen, deren Mehrheit, wenn sie in vollständigem Ausmaß wachsen können, auf eine Länge von mindestens der zehnfachen des Sporendurchmessers ohne bemerkenswerte Verzweigung wächst. Sporen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet werden, ergeben ein wesent-

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lieh geringeres Hyphenwachstum als die üblichen,wobei im wesentlichen alle Hyphen, wenn sie voll ausgewachsen sind, eine Länge besitzen, die-geringer ist als die zehnfache Länge (insbesondere geringer als die dreifache Länge) des Sporendurchmessers, ohne daß eine bemerkenswerte Verzweigung auftritt. . . ;-:·■■■-.. ---"....^;--;..

In der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Ausdruck "Inkubätionsphase"die Phase des Entwieklungszyklus von Pilzsporen, die unter normalen Hyphenwachstumsbedingungen der Bildung der Keimfäden oder Keimschläuche vorausgeht« - -

Das erfindungsgemäße Verfahren ist anwendbar auf Sporen, die Pilze ergeben und die geeigneterweise zu den folgenden Klassen gehören: Phycomycetes, Ascomycetes, Basidomycetes und insbesondere Fungi imperfecti* Fungi der Arten Aspergillus, Penicillium und Cephalosporium sind bei dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich.

Als Beispiele für spezifische.Pilzspecies₉ die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet werden können, sollen erwähnt, werden: .,.· · ,-- - . ■

Penicillium-Species wie Penicillium notatum, patulum und griseofulvin.

Zygorhyncus moellari, Gliocladium vireno, Fusarium monoliforme.

Helminthosporium monoceras (Drechslera monoceras) Paecilomyces variotii Banier.

Cephalosporium-Species, beispielsweise Cephalosporium sp

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IMI 49137.

Besonders geeignete Species sind die Species von Aspergillus genus, beispielsweise Aspergillus niger (insbesondere der Stamm Van Tiegham IMI 41873, Stamm ATCC 11414, beschrieben von Clark 1962; Steel, Lentz & Martin 1955 und Shu und Jackson 1947j ebenfalls identifiziert als Nr. A/1/233 von der Division of Applied Biology, National Research Council, Ottawa, Kanada, Asp. phoenicis (insbesondere Stamm ATCC 12847), Asp. clavatus, Asp. itaconicus, Asp. ochraceus, Asp. oryzae (insbesonders Stamm RCST 612) und Asp. nidulans (insbesondere Stamm IMI 96217).

Stämme der obigen Species wurden in der Literatur beschrieben und werden von Kultursammlungen wie von der Commonwealth Micological Institute, Kew, Surrey, Großbritannien, zur Verfügung gestellt.

Die folgenden sekundären Metabolite können als Beispiele für solche erwähnt werden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden können:

Organische Säuren wie Itaconsäure, Gluconsäure, Kojisäure und insbesondere Citronensäure und Aminosäuren wie Lysin und Glutaminsäure.

Antibiotika wie Penicillin, Griseofulvin, Streptomycin, Aphalosporin und insbesondere Cephalosporin.

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Enzyme wie Amyloglucosidase, cc-Amylase, Protease und Glucoseisomerase.

Pflanzenwachsturns-Stimulant!en wie Gibberellinsäure. Antipilzmittel wie Monocerin.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ebenfalls verwendet .werden, um Sporen von genießbaren Pilzen der Klasse Basicomycetes herzustellen, die einen starken Pilzgeruch besitzen und die zur Herstellung von Geschmacks- und Geruchsmitteln verwendet werden können. Zusätzlich kann man das er~ findungsgemäße Verfahren verwenden, um Sporen herzustellen, die bei Steroidumsetzungen, beispielsweise bei der Herstellung von empfängnisverhütenden Pillen, verwendet werden können. Pilzstämme, die für Steroidumwandlungen geeignet sind, umfassen die Stämme von Genus Cunninghamella und die Stämme von Aspergillus ochraceus. Beispiele von Steroidumwandlungen, die durch Pilzsporen und Pilzstämme hervorgerufen werden und die verwendet werden können, werden in "Advances in Applied Microbiology", Band 10, 1968, Seite 221 ff,herausgegeben von Academic Press, beschrieben.

Die Wirkungen, die man erreicht, wenn man Pilzsporen während ihrer Inkubationsphase Temperaturen aussetzt, die höher sind als die, bei der üblicherweise Hyphenwachstum auftritt, bestehen darin, daß das exogene Quellen oder das kugelförmige bzw. sphärische Wachstum der Pilzsporen erhöht

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wird, während die Bildung der Keimfäden und das vegetative Wachstum erniedrigt werden. Die Bildung der Keimfäden nimmt mit Temperaturerhöhung ab, bis sie vollständig gehemmt ist. Bei noch höheren Temperaturen verbleiben die Sporen untätig. Die Konidienträger werden leichter direkt von den vergrößerten Konidien (=Pilzsporen) gebildet, die durch Wachstum bei erhöhten Temperaturen gebildet werden als von üblicherweise entwickelten Pilzsporen. Bei Temperaturen, bei denen sowohl ein erhöhtes kugelförmiges bzw. sphärisches Wachstum der Konidien und mindestens teilweise eine Keimfädenbildung auftritt,· ergeben erhöhte Temperaturen eine erhöhte Bildung von Konidienträgern direkt aus den Konidien. Bei Temperaturen jedoch, bei denen eine vollständige Hemmung der Keimfädenbildung auftritt, wird die Bildung der Konidienträger ebenfalls gehemmt.

Die Initiation der Konidienträger direkt aus den Konidien wird bei höheren Temperaturen stimuliert, die Reifung der Konidienträger ist bei niedrigeren Temperaturen besser. Sporen, die bei Temperaturen, bei denen die Keimfädenbildung vollständig gehemmt ist(die Sporen aber nicht untätig sind),während längerer Zeit gezüchtet wurden,ergeben Konidienträger, ohne irgendein vegetatives Wachstum, wenn die Temperatur danach erniedrigt wird, beispielsweise auf den Wert, bei dem ein Hyphenwachstum bei dem normalen Entwicklungszyklus auftritt. Werden die Sporen einer Temperatur ausgesetzt, bei der sie untätig bleiben, entwickeln sie sich normal, wenn

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die Temperatur auf die Temperatur erniedrigt wird, bei der ein übliches Hyphenwachstum auftritt.

Wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein sekundärer Metabölit gebildet, so .werden die Sporen-vorzugsweise . bei einer Temperatur, über der, bei der normales Hyphenwaehstum auftritt, während einer Zeit .gehalten* während der der sekundäre Metabolit durch die vergrößerten Koni dien gebildet wird, und die Temperatur wird nicht erniedrigt, damit nicht irgendwelche Koiildienträger reifen können* Insbesondere ist es bevorzugt, daß die Sporen bei einer Temperatur gehalten werden, bei. der die Konldienträgerblldung-während de*¹ ■-, Bildung des sekundären Metabollten gehemmt Ist, Der sekundäre Metabolit kann in einem Chargenverfahren oder bei einem kontinuierlichen Verfahren hergestellt "werden, bei dem die vergrößerten Sporen in das Fermentationsgefäß eingefüllt werden und diese ersetzen, die aufgehört haben, sekundären Metabollten zu bilden.

In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein,, um sekundäre Metabolite zu bilden, die Temperatur beispielsweise auf 30⁰C zu erniedrigen, nachdem die vergrößerten Konidien durch eine frühere Inkubation bei erhöhter Temperatur, gebildet wurden. In solchen Fällen ist es wünschenswert, die Hyphenentwicklung weiter zu begrenzen, Indem man bekannte Hemmverfahren verwendet. Es wurde gefunden, daß nach verlängerter Inkubation (beispielsweise während ungefähr 48 Stunden)

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bei Temperaturen wie 41 bis 44° fast alle der vergrößerten Konidien keine Keimfäden bilden, wenn die Temperatur erniedrigt wird. Jedoch kann ein Myzelwachstum noch auftreten, bedingt durch den kleinen Anteil an Konidien, bei denen die Keimfädenbildung nicht gehemmt wurde. Geeignete Hemmverfahren umfassen die Zugabe von Inhibitoren wie 5-Hydroxymethyl-furfuraldehyd (HMF) oder Phenäthylalkohol (PEA) zu dem Kulturmedium, wenn die Temperatur vermindert ist, oder man kann die vergrößerten Konidien in ein Medium überführen, das zuvor ein ausgedehntes Myzelwachstum versorgt hat, oder in ein Medium, das keine Stickstoffquelle enthält. Fügt man HMF als Inhibitor zu, so liegt die Konzentration vorzugsweise über 40 mMol, insbesondere bei 50 bis 60 mMol. Wird PEA zugefügt, so liegt die Konzentration vorzugsweise über 20 mMol, insbesondere bei 20 bis 40 mMol.

Ist es gewünscht,Konidienträger und anschließend Konidiensporen herzustellen, so wird das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt so durchgeführt, daß man die Sporen während der Inkubationsphase einer Temperatur unterwirft, die höher ist als die, bei der übliches Hyphenwachstum auftritt, um die Bildung von vergrößerten Konidien zu begünstigen und das vegetative Wachstum zu hemmen. Danach wird die Temperatur auf einen Wert erniedrigt, der innerhalb des Bereichs liegt, bei dem normales Hyphenwachstum auftritt, um zu bewirken, daß die Konidienträger direkt aus den reifen Konidien gebildet werden. Die Konidiensporen die gebildet werden, sind

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normal (d.h. sie bilden Keimfäden und Hyphen), wenn sie nicht selbst einer Temperatur ausgesetzt werden, die über der liegt,, bei der das übliche Hyphenwachstum auftritt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung einer großen Anzahl von Sporen, indem man einfach die Sporen bei erhöhten Temperaturen züchtet und dann die Temperatur erniedrigt, so daß die' Konidiensporen gebildet werden können. Die Konidiensporen. können dann gewünschtenfalls verwendet werden, um eine Fermentation zu inokulieren, die unter normalen Wachstumsbedingungen durchgeführt wird.

Die Temperatur, bei der ein normales Hyphenwachstum auftritt, hängt von dem verwendeten Pilzstamm ab. Vorzugsweise werden während der Inkubationsphase die Sporen während einer bestimmten Zeit einer Temperatur ausgesetzt, die mindestens um 2⁰C höher liegt als die, bei der ein normales Hyphenwachstum auftritt; insbesondere liegt sie um 2 bis 12°C und bevorzugt um 3 bis 6° C über der genannten Temperatur. Für viele Pilzstämme oder"-arten, beispielsweise Aspergillus niger-Stämme wie Aspergillus niger van Tieghem (IMI 41873), tritt das normale Hyphenwachstum bei Temperaturen im Bereich von 25 bis 38⁰C, insbesondere bei ungefähr 30 bis 35⁰C, auf und die Sporen bleiben bei Temperaturen über 46⁰C untätig. Für diese und ähnliche Arten liegt die bevorzugte, erhöhte Temperatur innerhalb des Bereichs von 41 bis 45⁰C₁ besonders von 42 bis 44⁰C. Der bevorzugte erhöhte

Temperaturbereich kann von dem angegebenen Bereich in einigen Fällen variieren, "beispielsweise kann er sich bei einigen Arten oder Stämmen bis zu 46 oder selbst bis zu 48⁰C erstrecken. Bevorzugt werden Sporen dieser Arten, wenn Konidienträger und anschließend Konidiensporen hergestellt werden sollen, während einer bestimmten Zeit bei einer erhöhten Temperatur gehalten, und die Temperatur wird dann erniedrigt auf einen Wert zwischen 25 und 55⁰C, insbesondere auf ungefähr 30⁰C, damit die Koni dienträger reifen können. Für Cephalosporin-Stämme (beispielsweise Stamm IMI 49137) tritt das normale Wachstum bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 28⁰C auf und besonders geeignete Temperaturen zur Herstellung von vergrößerten Sporen liegen im Bereich von 37,5 bis 39°C.

Bei der Herstellung von Konidienträgern hängt die optimale Dauer, während der die Sporen bei erhöhten Temperaturen gehalten werden, von der Art des verwendeten Pilzes und von der erhöhten Temperatur ab. Im allgemeinen beträgt die Zeit jedoch mindestens 10 Stunden, vorzugsweise mindestens 48 Stunden. Für die Herstellung des sekundären Metaboliten werden die Sporen bevorzugt bei einer erhöhten Temperatur, vorzugsweise bei 44°, im Falle von Aspergillus niger während des Verfahrens gehalten.

Das Ausmaß, in dem die Keimfäden von den vergrößerten Konidien (=coridix) gebildet werden, hängt von der

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Konidiendichte In dem Medium aib,- Bei hOheren' Konidiendichten,,

;ß -■■---..--beispielsweise bei 15 χ 10 Konidien/ml Medium und höher, ist die Keimf ädenhildung ,gehemmt. Wenn daher die Keimfädenbildung während der Herstellung des sekundären Metaboliten gehemmt werden soll, liegt die JKonidiendichte vorzugsweise "bei 15 x 10 /ml oder höher» jbeispielsweise bei 15 Ms 80 χ 10^/ml;, "besonders .bei 15 Ms 25 χ 10^JmI. ¥eim die Konidiendichte auf diese Weise erhöht mrd, kann man niedrigere Temperaturen, beispielsweise fri bis 42⁰G, in ädern bevorzugten Bereich verwenden, wenn -VergrBBerte Eoniöien Cponia) gebildet werden sollen,was eine schnellere Vermehrung ermöglicht.

Geeignete Quellen iür assimiliierbaren Kohlenstoff hängen von der Irt des "verwendeten Pilzes oder von dem sekundären Metaboliten,, der gebildet "werden soll, ab. Geeignete Quellen umfassen in vielen Fallen Glucose und Saccharose. ■■"■*■"

Die bevorzugte Zusammensetzung des Kulturmediums hängt von dem Pilz und dem sekundären Metaholiten_:, der gebildet wird, ab. Im Falle der Züchtung von.Aspergillus niger zur Herstellung von Citronensäure enthält das Kulturmedium geeignet die folgenden Bestandteile in den folgenden Konzentrationen ϊ

Die Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff ist vorzugsweise in dem Nährmedium in Teilen zwischen 1 und 1496, insbesondere 10 bis 14%, vorhanden.

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Die anorganischen Nährstoffe, die in dem Nährmedium vorhanden sind, umfassen bevorzugt anorganische Quellen der Elemente wie Kalium, Stickstoff, Phosphor, Schwefel und Magnesium. Diese Elemente können in dem Medium vorhanden sein, indem man zu dem Medium Verbindungen wie Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat, Phosphorsäure, Ammoniak, Harnstoff, Ammoniumsalze, beispielsweise (NH^pSCK, und Nitrate, beispielsweise KNCU, zufügt. Es ist bevorzugt, daß die anorganischen Verbindungen, die diese Elemente enthalten, zu dem Medium in Mengen zugegeben werden, die ausreichend sind, um die folgenden Konzentrationen in Prozent (Gew./Vol) zu ergeben:

N 0,04 bis 0,045

K⁺ 0,025 bis 0,035

Mg²⁺ 0,002 bis 0,003

PO^" 0,065 bis 0,075

SO²." 0,014 bis 0,015

Das Nährmedium kann ebenfalls Spurenmengen von Ionen anderer metallischer Elemente wie von Calcium, Kupfer, Eisen, Kobalt, Mangan und Natrium enthalten .(die als Chloride oder Sulfate zugefügt werden), vorzugsweise in Mengen, die Ionenkonzentrationen, ausgedrückt in Gew.%, zwischen 6 χ 10" und 2 χ 10" % Gew./Vol. ergeben. Das Medium kann ebenfalls organische Nährstoffe außer der Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthalten. Für die Sporenbildung, aber nicht für eine übermäßige Sporenbildung, ist es wünschenswert, eine Form von organischem Stickstoff vorzusehen.

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Zusätzliche organische Nährstoffe umfassen Glutamat (geeigneterweise zugefügt als Mononatriumsalz der Glutaminsäure), diese haben die Wirkung, daß sie die Anzahl der Konidien, die Konidienträger "bilden, erhöhen, und Alanin, das für die Entwicklung von einigen Arten von Aspergillus niger nötig erscheint. Ein sehr geeignetes Medium, das bei der Herstellung von Cephalosporin verwendet werden kann, ist Czepek Dox-Medium. . ..

Der pH-Wert des Mediums wird geeigneterweise auf einen Wert im Bereich von 2 bis 6,insbesondere 3 bis 4,5, eingestellt, beispielsweise in vielen Fällen durch Zugabe von HCl oder NaOH. . .

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, um Pilze zu züchten, die stark vergrößerte Konidien. enthalten und bei denen kaum, oder kein Hyphenwachstum und anschließen» de Myzelbildung auftritt„ Dies erleichtert die Verwendung von Zirkulationsfermentationsgefäßen, wie sie in der deutschen Patentschrift .... ... (Patentanmeldung entsprechend der britischen Anmeldung Nr. 35285/70) für Verfahren, bei denen Pilze gezüchtet werden, beschrieben sind«

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel T

Wachstum von Aspergillus niger van Tiegham (IMI 41875) "bei erhöhten Temperaturen

Stockkulturen des Pilzes wurden auf Kartoffel-Glucose-Agar-Schrägflächen "bei 27°C gehalten. Die Sporen wurden von 4 Tage-Kulturen geerntet, und diese Sporensuspension wurde filtriert und dann zweimal in sterilem entionisiertem ¥asser durch Zentrifugieren bei 300Ox g während 10 Minuten gewaschen. Die Sporen wurden schließlich in sterilem entionisiertem Wasser suspendiert, geschüttelt und in einem Haemocytometer gezählt.

Das Pilzwachstum wurde in dem folgenden Kulturmedium bei 30°, 35°, 38°, 41°, 44° und 47°C untersucht:

Kulturmedium - "1 1 entionisiertes V/asser, das enthielt: 10 g Glucose, 5 g Glutaminsäure (Mononatriumsalz): 1 g KH₂PO₄: 0,25 g MgSO₄.7H₂O:0,234 mg CuSO₄.8H₂0:6,32 mg FeSO₄.7H₂O: 1,1 mg ZnS0₄.7H₂0: 3,5 mg MnCl₂.4H₂0: 46,7 mg CaCl₂ : 1,98 g (NH₄)₂S0₄: mit HCl auf pH 4,5 eingestellt. Das Medium wurde in 5 ml Volumenteilen in Glasröhren (150 χ 24 mm) verteilt. Alle Kulturen wurden so inokuliert, daß sie 1 χ 10 Sporen/ml Medium enthielten.

Mikroskopische Beobachtungen wurden an frisch hergestellten Proben oder an Proben, die in 494 Formaldehyd bei 4°C gelagert wurden, folgendermaßen durchgeführt:

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Die Anteile der Sporen, die ein sphärisches Wachstum zeigten, wurden bestimmt, indem man 100 Sporen/Probe untersuchte. ■:..-

Die Bildung von'Keimfäden wurde bestimmt, indem man 100 Sporen/Probe untersuchte und eine Bildung annahm, wenn der Keimfaden so lang wie breit war.

Der Sporendurchmesser wurde bestimmt, indem man 50 Sporen/Probe maß, wobei man ein Mikroskop verwendete, das mit einem okularen Mikrometer ausgerüstet war.

Die Konidienträgerbildung aus den Konidien wurde bestimmt, indem man 100 Konidien/Probe direkt zählte und eine Bildung annahm, wenn der Konidienträger so lang wie breit war. Die. Zählungen umfassen sowohl die unreifen (Konidienträger stengel) als auch die reifen [Stengel mit Bläschen,~ Schälchen (=Kapseln=Phialiden (phialides) und Konidien] Strukturen.

Von den untersuchten Temperaturen erhielt man die schnellste Geschwindigkeit bei dem sphärischen Wachstum bei 38⁰C, gefolgt von den folgenden Temperaturen, die entsprechend geordnet sind: 41°, 35°, 44° und 30⁰C. Kein sphärisches Wachstum (=Kugelwachstum) trat bei 47⁰C auf. Bei Temperaturen innerhalb des Bereichs von 35 bis 44⁰C war die sich ergebende Sporengröße ähnlich (ungefähr 20 /u), obgleich die Zeit, die erforderlich war, um diese Größe zu erreichen,

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entsprechend der sphärischen Wachstumsgeschwindigkeit variierte. Maximale Sporengrößen bei 38⁰C waren nach 24 Stunden erreicht, wohingegen bei 44⁰C ungefähr 48 Stunden erforderlich waren. Ein Vergleich der Sporendurchmesser, der Spcrenoberfläche und des Sporenvolumens von nichtgequollenen Sporen mit sphärisch gewachsenen Sporen, die nach 48 Stunden Kultivierung bei 44°C gebildet waren, ist in Tabelle I aufgeführt.

Die Anteile der Sporen, die Keimfäden ergeben, und die Zeit der Keimfädenbildung variieriHi entsprechend der Inkubationstemperatur. Bei 30°, 35°und 38⁰C hatten einige der Sporen nach 6 Stunden Keimfäden gebildet, obgleich die Mehrheit zwischen 6 und 9 Stunden und 97 bis 99% der Sporen innerhalb von 12 Stunden Keimfäden gebildet hatten. Bei 41⁰C trat ein Verlust in dem Synchronismus der Keimfädenbildung auf und der Teil der Sporen, die Keimfäden bildeten, nahm ab. Bei 44 C war die Keimfädenbildung vollständig gehemmt.

Die Morphologie der gebildeten Keimfäden wurde durch die Inkubationstemperatur beeinflußt. Bei 30°C waren die Keimfäden dünn und hatten wenig Verzweigungen, wohingegen bei höheren Temperaturen die größeren Sporen dickere verzweigte Keimfäden ergaben. Das Nettoergebnis war eine schnellwachsende Kultur bei 3O⁰C, eine langsamwachsende Kultur bei 41⁰C, die aus einer Mischung aus großen, sphärisch gewachsenen Sporen mit und ohne Keimfäden bestand, und minimales

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Wachstum bei 44⁰C, wobei die Kultur hauptsächlich aus großen sphärisch gewachsenen Sporen ohne Keimfäden bestand.

Wenn das Wachstum während Zeiten, die langer"als 24 Stunden waren, stattfand, so beobachtete man häufiger bei erhöhten Temperaturen als bei 30⁰C, daß Konidienträgerstengel direkt aus den Konidien gebildet wurden. Bei. Temperaturen (35°, 38° und 41⁰C), die sowohl ein Quellen als auch eine mindestens teilweise Keimfädenbildung ermöglichten, ergaben höhere Temperaturen eine größere Keimträgerbildung _r aus den vergrößerten Konidien₀ Bei 44⁰C wurden keine Keimträger gebildet. Die Bildung von Bläschen und Phialiden trat stärker ai£ bei 35 und 38⁰C als bei 41⁰C. Bet 41⁰C waren die meisten Keimträger, obgleich sie die Normallängen erreichten, nicht fähig, die Endstufen der Fortpflanzung zu trennen^ und dies gab abnomale Spitzen.

Versuche wurden durchgeführt _s bei denen die Sporen verschiedene Zeiten bei Temperaturen von 35°, 38°, 41°, und 47⁰C gezüchtet wurden» Anschließend erfolgte einiger Zeit eine Züchtung bei 30⁰C. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt« Eine Inkubation bei Temperaturen von 35 bis 44⁰C zu Beginn erhöhte die Anzahl an Keimträgern, die sich bei 30⁰C bildeten. Bei 47° trat keine Quellung auf und keine Erhöhung über den Kontroll (30⁰C)-Wert wurde erhalteng wenn diese Konidien bei 30⁰C zum Keimen gebracht wurden. Nach 48 Stunden bei 44°C bildeten fast alle Konidien

keine Keimfäden bei 3O⁰C, aber sie bildeten Konidienträger.

	Tabelle	I	Sporenober* fläche {j\i^d)	38,5	Sporen- , volumen (m)	10	15	20 40 (2)
-	Sporendurch messer ( Al)			1207	22,4	30	37	32 35
ungequollene Sporen A	3,5			31,4	3933	51	58	48 52
große sphärisch wachsene Sporen	ge- B 19,6			175,6	66	59	63 61
Verhältnis B/A	5,6	II			88	95	90 78
	Tabelle		Prozent der Konidien, die KonidienträKer bilden	59	61	74 0
Temperatur zu Beginn	Zeit bei der¹) Anfangstemp.		5	34	29	31 0
	(Std.)		33
30			36
35		44
38		38
41		31
44		36
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1) Nach der Inkubation bei der Anfangstemperatur während der angegebenen Zeit wurden die Konidien bei 30°C während 24 Stunden gezüchtet.

2) Die Konidien, die bei der Anfangstemperatur während 40 Stunden gezüchtet wurden, wurden danach bei einer tieferen Temperatur nicht mehr gezüchtet.

Beispiel 2

Die Bildung von vergrößerten Sporen Sporenträgern wurde mit den folgenden Organismen unter-

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suchtj Asp. niger (ATCC 11414), Asp. phoenicis (ATCC 12847) KuIturbedingungen; Das Kulturmedium und die Kulturbedingungen waren die gleichen, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurden. Mikroskopische Untersuchung: Alle Untersuchungen erfolgten an frischpräparierten Proben. Die Sporendurchmesser wurden bestimmt, indem man ein Mikroskop verwendete, das mit einem Bildverschiebungsokular ausgerüstet war,und 40 Sporen/Probe wurden gemessen.

Sekundäre Sporenbildung; Die Bedingungen, die erforderlich sind, um Konidienträger zu bilden aus vergrößerten sphärisch gewachsenen Sporen, variierten, abhängig von dem Organismus. Die mit den individuellen Organismen erhaltenen Ergebnisse sind im folgenden . beschrieben und in Tabelle III zusammen- gefaßt. .

Asp, niger (ATCC 11414)

Die Kulturen wurden während 48 Stunden bei Temperaturen von 44°, 45° und 46⁰C inkubiert. Alle Kulturen enthielten nach 48 Stunden vergrößerte sphärisch gewachsene Sporen, ein Myzelwachstum war nicht erkennbar. Ein Vergleich der Sporendurchmesser der ungequollenen Sporen mit sphärisch gewachsenen Sporen in diesen Kulturen ist in Tabelle IV aufgeführt.

Wurden die Kulturen auf eine Temperatur von 3O⁰C gebracht, so produzierten die Kulturen, die zuerst bei 45 und 46⁰C gezüchtet waren, nach 24 Stunden sowohl Myzel als auch Konidienträger bei 30⁰C. Ein größerer Teil von Konidienträ-

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gern wurde von den Kulturen, die bei 45⁰C inkubiert wurden, als von denen, die zuerst bei 46⁰C inkubiert wurden, gebildet.

Weitere Kulturen wurden während 96 Stunden bei 45°C und dann während 24 Stunden bei 3O⁰C inkubiert. Nach dem Wachstum bei 45° enthielten die Kulturen sphärisch gewachsene Sporen ohne Myzelwachstum. Nach der Inkubation bei 30° wurden Konidienträger zusammen mit kurzen, stark durch Scheidewände getrennte, verzweigte Hyphen, die ungefähr 30 bis 40/U lang waren, gebildet. Dieses Hyphenwachstum war längenmäßig begrenzt und schien aufzutreten, wenn die Kulturen bei 3O⁰C während Zeiten, die länger waren als 24 Stunden, inkubiert wurden. Erfolgte eine Inkubation weitere 48 Stunden, so enthielten die Kulturen kleine Zusammenballungen (bzw. Büschel; mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1,0 mm) von sphärisch gewachsenen Sporen mit und ohne Hyphen und/oder Konidienträgern. Die meisten der gebildeten Hyphen hatten ein oder zwei Phialiden an ihren Spitzen.

Diese schienen Sporen zu bilden zusätzlich zu jenen, die von den Konidienträgern gebildet wurden. Eine Anzahl von sekundären Sporen war im Medium erkennbar und ebenfalls in den Zusammenballungen des Myzels eingeschlossen.

Eine Suspension aus sekundären Sporen wurde hergestellt, indem man durch sterilen Mull filtrierte, wobei man eine Suspension mit 5 χ 10"³ sekundären Sporen/ml erhielt.

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Vermutlich war die Anzahl der gebildeten sekundären Sporen größer als diese Zahl anzeigt, aber eine so große Zahl wurde nicht gewonnen, da ein Teil in den Zusammenballungen des Myzels eingeschlossen war.

Asp, phoenicis (ATCC 12847)

Kulturen wurden während 48 Stunden bei Temperaturen von 44 und 45°C inkubiert. Die Kulturen enthielten naph 48 Stunden vergrößerte sphärisch gewachsene Sporen, ein Myzelwachsturn war nicht erkennbar. Ein Vergleich der Sporendurchmesser der ungequollenen Sporen mit sphärisch gewachsenen Sporen in diesen Kulturen ist in Tabelle IV aufgeführt.

Die Kulturen, die ursprünglich bei 44°C inkubiert wurden, wurden auf eine Temperatur von 30° gebracht. Bei . dieser Temperatur bilden die. Sporen nur Konidientrager.Die meisten der Konidien bildeten nach 15 Stunden bei 30° Phialiden und waren nach 24 Stunden vollständig reif, Zu diesem Zeitpunkt beobachtete man eine große Anzahl an sekundären Sporen im Medium. In diesem Falle bildeten mehr als 90% der sphärisch gewachsenen Sporen einai oder mehrere Konidienträger. ·

	Inkubation Beginn, ⁰C	48 48 96	Tabelle ]	CII	24 24 72	am	Hyphen- wachstum	Konidien träger
Stamm bzw.Art	45 46 45	48	zu	Inkubation Ende, ⁰C	24	h h h	Γ	♦
ATCC 11414	44	h h h	30 30 30		h	Null
ATCC 12847	h	30

In Tabelle III ist das geschätzte Ausmaß des Hyphenwachstums und der Konidienträger durch die Anzahl der Kreuze bezeichnet, wobei 3 Kreuze das größte Ausmaß bezeichnen.

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Tabelle IV

Art Temp.,⁰C Sporendurchmesser der vergrößerten Sporen-Sporen nach der Inkubation während durchmesser verschiedener Zeiten bei den ange- der ungegebenen erhöhten Temperaturen (/u) quollenen

	44 45 46	' 24	(ATCC	Std.	48 Std.	96	V	Std.	-	»puren ^ /uy
ATCC. 11414	44 45	9 8 7	Der Versuch	ι O ,2 ,7	16,4 11,4 , 8,4	19 13 8		,2 ,4 ,9	, wobei ι	3,6
ATCC 12847	ρ i c	11	,7	17,6 25,1			4,3
B ei s	ϊΐ.3
	Wirkung der	Variation der Sporendichten beim	man das	Wachstum
von A.	ni^er	11414)
		folgende
	wurde durchgeführt
Kulturmedium verwendete (Medium A):

in 1 1 destilliertem Wasser: Saccharose - 140,0 g, NH₄NO₃ - 2,5g, KH₂PO₄ - 1,0 g, MgSO₄.7Η_£0 - 0,25 g,

FeCl₃.6H₂O - 6,27 mg, ZnSO₄.7H₂O - 2,2 mg, pH mit HCl auf 3,1 eingestellt.

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Konidien für die Inokulation des Mediums A wurden auf dem Medium B hergestellt, das die gleichen Bestandteile enthielt, mit der Ausnahme von FeCl^.6H₂O und ZnSQ^TH₂G. Der pH-¥ert des Mediums B wurde auf 5 Ms 5»5 eingestellt und das Medium wurde mit 2£ Agar verfestigt. Die mikroskopischen Untersuchungen wurden wie in. Beispiel 1 durchgeführt. Gewaschene Konidien wurden zu Medium A mit verschiedenen Konidiendichten im Bereich von 1 χ 10· /ml Ms 80 χ 10 /ml zugegeben. Die verschiedenen hergestellten Kulturen wurden unter Rühren bei 41° inkubiert« Bei allen Konidiendichten trat bei ungefähr 60% der Konidien eine Erhöhung im Durchmesser auf 15 bis 20 /um nach 24 Stunden Inkubation auf.

Die Koniddendichte hatte eine starke Wirkung auf die Keimfädenbildung. Nach I6stimdiger Inkubation bei 41⁰C hatten in der 1 χ 10 Konidien/ml Kultur viele vergrößerte Konidien Keimfäden gebildet» wohingegen zur gleichen Zeit die Keimf ädehbildung aus den vergrößerten Konidien bei Kulturen mit höherer Konidiendichte gehemoffe war_t d.h. hei Dichten von 15 x 10⁶/ml und höher.

Beispiel

Die Medien A und B und die in Beispiel 3 beschriebenen Organismen wurden verwendet. Die mikroskopische Untersuchung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

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Kulturen mit Konidxendichten von 1 χ 10 Konidien/ml und 15 x 10 Konidien/jiX wurden bei den folgenden Temperaturen 38°, 41°_P 42° und 44°C gezüchtet.

Bei des. 1 χ 10 Konidien/ml-Kulturen traten Keimfa&en. vor 16 Stunden, bei allen Temperaturen unter 44°C auf. Bei 44° wurden selbst nach. 96stündiger Inkubation keine Keinifäden. gebildet. , . '.

Bi den 15 χ 10 Konidien/nLL-Eulturen traten die Keimfaden vor 16 Stünden bei 3S°_r nacit 18 Stunden^ bei 41 °, nach 22 Stunden -bei 42° auf und nach: 96 Stunden bei 44° traten sie nicitt auf. Aus diesen Konidien in. diesen Kultur en wurden keime Eonddienträger gebildet. .

Bei spi el 5 ■'··_./ .- "' ;.. ■ ■-..

Bie Mediem A und B= und die wie in Beispiel 5 besehrie-Organisaien wurden vervfendet. Bie mikroskopisciien Uhr erfolgten wie in Beispiel 1 beschrieben.

Die Kulturen der Organismen! wurden bei 41° bzw. 42°C wlforend 16 bzw. wä&rend 20 Stunden gezücirtet. Die Temperatur wurde danai in. beiden Fällen auf 44° erköht und die KtLlturen- wurden; bei dieser Temperatur während 96 Stunden gehalten _E wobei keine Eeimfädenbildung auftrat*

Beispiel 6

Der verwendete Aspergillus niger-Stamm war ATCC 11414,

Das verwendete Kulturmedium enthielt die folgenden Bestandteile in 1 1 destilliertem Wasser: 10 g Saccharose, 1 g KH₂PO₄, 0,25 g MgSO₄.7H₂O, 2,5 g NH₄NO₃, 2,21 mg ZnSO₄.7H₂O, 6,2 mg FeCl^.6H₂O und 2,2 g Brenztraubensäure/ Mononatriumsalz. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von HCl zu Beginn auf 4,5 eingestellt.

Gewaschene Konidien mit einer Dichte von 4 χ 10 /ml wurden in dem Kulturmedium bei 44 C während 48 Stunden gerührt. Während dieser Zeit trat in Abwesenheit eina?Hyphenbildung eine Vergrößerung der Konidien auf. Gegen Ende der Zeit wurden zu dem Kulturmedium weitere 130 g Saccharose zugefügt. Nach weiteren 48 Stunden bei 44°C wurde Citronensäure in dem Kulturmedium in einer Konzentration von 800/Ug/ml festgestellt.

Beispiel 7

Es wurde der gleiche Organismus wie in den Beispielen 3 bis 6 verwendet. Als Kulturmedium wurde das in Beispiel 3 beschriebene Medium A verwendet.

Gewaschene Konidien mit einer Dichte von 15 x 10 /ml wurden in dem Kulturmedium bei 42° während 22 Stunden gerührt. Während dieser Zeit trat in Abwesenheit von einer

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Hyphenbildung eine Vergrößerung der Konidien auf V Gegen Ende der Zeit wurde Citronensäure in dem Kulturmedium in einer Konzentration von 4,5 mg/ml festgestellt.

Beispiel 8

Es wurde der gleiphe Organisfflus wie in den Beispielen 3 bis 7 verwendet. Als Kulturmedium verwendete man Medium A.

Konidien mit einer Dickte von 15 χ 10 /ml Medium wurden bei 41° während 16 Stunden inkubiert.. Bas Kulturmedium wurde dann in sieben Teile geteilt,, wobei man zu jedem Teil unterschiedliehe Mengen an 5 ■^E^drosq^etb^riL'-furfuraldehyd (BMF) zufügte und wobei man Kulturen erhielt, die folgende Konzentrationen an HMF -besaßen;: Wi, 2Q₁, ßQ_t 40, 5P., ;6Q und 80 mMol.. Diese Kulturen wurden während 96 Stunden bei 30° gehalten. Bei Konzentrationen yon 3JMF zwischen 10 und 40 mMol trat eine Keimf adenbildung und ein langsames jäyphenwachstum auf. Bei Konzentrationen von ÜMF siber 4p -XnMpIL trat iceine Keimfädenbildung auf_;.

Bei einem Versuch wurde die Inkubation jfter vergrößerten Konidien bei 30° in Anwesenheit yon 50 mMol HMF für 6 Tage ausgedehnt. Die :Konidien wurden dann gewaschen und in frisches Medium A gegeben. Es traten .-. Keimf adenbildung und Hyphenwachstum auf, vwenn die Inkubation bei 30° fortgeführt wurde> cwas zeigte, daß rdie ver^Pößerten Konidien lebensfähig bleiben, -wenri" sie in Kontakt mit Xnhiibitorkpnzentra

tionen sind, die eine Hyphenentwicklung verhindern.

Beispiel9

Beispiel 8 wurde wiederholt, wobei man Phenäthylalkohol (PEA) als Inhibitor verwendet. Die Konzentrationen an PEA, die untersucht wurden, betrugen 15» 18, 20, 40, 60, 80 bzw. 100 mMol. Bei Konzentrationen von PEA bis zu 18 mMol bildeten die vergrößerten Konidien Keimfäden und zeigten Hyphenentwicklung bei 30°. Bei PEA-Konzentrationen von 20 mMol und größeren Konzentrationen wurden keine Keimfäden gebildet. Ein Versuch (wie er in Beispiel 8 beschrieben ist) zeigte, daß vergrößerte Konidien in Anwesenheit von 20 mMol PEA während 16 Tagen lebensfähig bleiben.

Beispiel 10

Man verwendete den gleichen Organismus wie "in den Beispielen 3 bis 9. Das Kulturmedium war Medium A.

Konidien mit einer Dichte von 15 x 10 /ml Medium wurden bei 41° während 16 Stunden inkubiert. Das Kulturmedium wurde dann in zwei Teile 1 und 2 geteilt. Teil 1 wurde zu einem Filtrat des Mediums A zugefügt, das zuvor ein starkes Myzelwachstum besorgt hatte. Teil 2 wurde zu Medium A zugefügt, das kein NH^NO* (d.h. keine Stickstoffquelle) enthielt. In beiden Teilen 1 und 2 bildeten die vergrößerten Konidien kein Myzel oder nur sehr wenig Myzel nach dem Wachstum während 96 Stunden bei 30° <,

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Beispiel 11

Medium? Das-Medium enthielt;

Zuckerrübenmelassen 300 g/l KH₂PO₄ 0,1 g/l .

Na₂Fe(CN)₆ ' ' " 1 g/l

Versuch 1: Subaerische Sporen, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben,wurden in 2 1 des obigen Mediums in einer Menge von 10 Sporen/ml inokuliert (ATCC 11414). .

Die Inkubation erfolgte in einem gerührten, mit Ablenkblechen versehenen Fermentationsgefäß während 48 Stunden; danach wurde: die Fermentationsmischung mit Ausnahme von 400 ml entfernt und das Volumen wurde mit frischem Medium auf ein; Volumen von 5 1 aufgefüllt.

Nach weiteren 5 Tagen Inkubation fand man, daß die Kultur 21,5 g/l Trockengewicht Myzel und 0,3% Citronensäure enthielt.

Versuch Z% Versuch 1 wurde wiederholt, wobei man sekundäre Sporen verwendete, die durch mikrocyclische Konidienbildung erhalten wurden*

Nach der gleichen Zeitdauer fand man, daß die Kultur 25 g/l Trockengewicht Myzel und 0,3% Citronensäure enthielt.

3 O υ 3 S /

B ei s ρ i e 1 12

Das Wachstum von Kulturen von C ephalosporium sp. IMI 49137 in Czepek Dox-Medium wurde bei verschiedenen Tem peraturen untersucht. Die Normaltemperatur für das Wachstum dieses Organismus liegt zwischen 25 und 28⁰C. Vergrößerte Sporen wurden in Kulturen "bei Temperaturen im Bereich von 37,5 Ms 39°C gezüchtet. Eine Verbindung, die Cephalosporia enthielt und antibiotische Eigenschaften zeigte, wurde durch üblich gewachsene Sporen bei Temperaturen zwischen und 28⁰C und durch die vergrößerten Sporen bei 37,5 bis 39⁰C gebildet.

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Claims

Patentansprüche

1. Industrielles Verfahren zur Züchtung eines Pilses und Erzeugung eines sekundären Stoffwechselproduktes»beispielsweise Zitronensäure, auf oder in einem wäßrigen Nährmedium* das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und anorganische Nährstoffe enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Sporen des Pilzes mindestens während einer Zeit während der Inkubationsphase (wie sie zuvor definiert wurde) ihres Entwicklungszyklus bei einer Temperatur gehalten werden, die höher ist als die, bei der ein normales Hyphenwachstum (wie es zuvor definiert wurde) auftritt, aber unterhalb einer Temperatur, bei der die Sporen untätig bleiben.

ι _

2. Verfahren zur Züchtung von Pilsen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pilse die Pilze verwendet, die zu den folgenden Arten gehören? Aspergillus, Penicillium oder Cephalqsporium. . - .

3₀ Verfahren gemäß Anspruch 2, -dadurch gekennzeichnet,-

daß man als Pils Pilz,® der Stämme Aspergillus niger IMI 41873 ©der ATCC 11414, Aspergillus phoenicis Stamm ATCC 12847 oder Cephalosporium sp_o. Stamm IMI 49137 verwendete

4* Verfahren zum Züchten von Pilsen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sporen während des normalen Entwicklungszyklus für einige Zeit ■

- 3ft -

bei einer Temperatur gehalten werden, die 2 bis 12°C höher ist als die, bei der ein normales Hyphenwachstum auftritt.

5. Verfahren zur Herstellung von Pilzen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sporen während einer Zeit von mindestens 10 Stunden bei einer Temperatur, die höher ist als die, bei der normales Hyphenwachstum auftritt, gehalten werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als sekundären Metaboliten Citronensäure, Cephalosporin oder Aphalosporin herstellt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als sekundären Metaboliten Citronensäure herstellt und daß man als Pilz einen Stamm der Aspergillus niger-Species verwendet.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als sekundären Metaboliten Cephalosporin herstellt und daß man als Fungus Cephalosporium sp. Stamm IMI 49137 verwendet.

9. Verfahren zur Herstellung eines sekundären Metaboliten gemäß einem der Ansprüche 1 und 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Sporen während der Zeit, während der der sekundäre Metabolit gebildet wird, bei einer Temperatur gehalten

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* β α β OO

werden, die höher ist als die, bei der normales Hyphenwachstum auftritt.

10. Verfahren zur Herstellung eines sekundären Metaboliten gemäß einem" der Ansprüche "1 und 6 bis-8, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Wachstum bei einer Temperatur» die höher ist als. die, bei der normales Kyphenwachstum auftritt, der sekundäreMetabolit bei einer Temperatur gebildet wird, die innerhalb eines Bereichs liegt, bei der während des normalen Entwicklungszyklus normales Hyphenwachstum auftritt.

11. ■ Verfahren gemäß Anspruch 10_? dadurch gekennzeichnet, daß die Sporen, währ end der sekundäre Metabolit gebildet wird, einer Behandlung zur Hemmung des Hyphenwachstums unterworfen sind.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11 für die Herstellung von Citronensäure, dadurch gekennzeichnet,' daß die Sporen während einiger Zeit bei einer, Temperatur im Bereich von 41 bis 45⁰C gehalten werden und daß danach die Temperatur auf einen Wert im Bereich von 25 bis 35°C erniedrigt wird.

13. Verfahren zur Herstellung eines sekundären Metaboliten gemäß einem der Ansprüche 1 und 6 bis 12,-dadurch gekennzeichnet, daß die Sporen während mindestens 10 Stunden bei einer Temperatur gehalten werden, die höher ist als die, bei dor normales Hyphenwachstum auftritt.

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14. Verfahren zur Kerstel3.ung eines sekundären Metaboliten gemäß einem der Ansprüche 1 und 6 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Sporendichte in dem Medium im Bereich von 15 χ 10 bis 80 χ 10 Sporen/ml Medium liegt.

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