DE1767183B2

DE1767183B2 - Verfahren zur herstellung von mikrobiellem labferment

Info

Publication number: DE1767183B2
Application number: DE19681767183
Authority: DE
Inventors: Louis Israel Spring Valley N.Y. Feldman (V.St.A.)
Original assignee: Baxter Travenol Laboratories Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1967-04-18
Filing date: 1968-04-10
Publication date: 1977-12-29
Also published as: DE1767183C3; CH506621A; ES351049A1; SE435194B; SE435066B; GB1207892A; DE1767183A1; SE398757B; IT970509B; IL29621A; SE7707286L; NL6805426A; FR1556473A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Labferment sowie die Verwendung dieses Labferments zur Herstellung von Käse.

Bei den bekannten Verfahren zur Herstellung von r> Käse wird Lab zum Koagulieren der Milch verwendet. Lab ist eine enzymhaltige Mischung, die aus dem vierten Magen von milchgefütterten Kälbern hergestellt wird. Bei der Herstellung von Käse wird das Lab der Milch zugesetzt, und das Enzym, das Labferment, übt eine jo milde proteolytische Wirkung auf das Casein und die anderen, in der Milch vorhandenen Proteine aus. Der Abbau der Proteine verursacht die Koagulation der Milch und die Bildung von festem Weißkäse. Dieser Weißkäse wird von der Molke abgetrennt, welche hauptsächlich eine wäßrige Suspension mit einem geringen Festkörpergehalt darstellt. Der Weißkäse wird dann mit Salz und weiteren Zusatzstoffen vermischt, zu Blöcken oder Rundstücken geformt und unter Bildung von Käse gegoren oder reifen gelassen.

Im Hinblick auf die besonders tierische Herkunft des Labs unterliegt die Lieferung und die Qualität des Labs großen Schwankungen. Man hat daher Versuche unternommen, Ersatzstoffe für das Lab zur Herstellung von Käse zu finden. Es sind zahlreiche tierische und mikrobielle Enzympräparate bei der Suche nach geeigneten Ersatzstoffen untersucht worden, welche die milchkoagulierenden Eigenschaft des Labs haben könnten. Unter den Mikroorganismen, die als nützlich für diesen Zwec!; beschrieben worden sind, befinden <>o sich beispielsweise die verschiedenen Mikroorganismen, die in der US-PS 13 91 219 beschrieben worden sind, sowie Endothia parasitica, offenbart in der US-PS 32 75 453, und Mucor pusillus, offenbart in den US-PS 31 51 039 und 32 12 905.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Labferment mit verhältnismäßig hoher milchkoagulierender Aktivität und verhältnismäßig niedriger proteolytischer Aktivität, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Mucor miehei NRRL ho 3169, A 7772, A 13 131 und/oder A 13 042 auf üblichem biologischem Wege unter aeroben Bedingungen in einer Nährlösung, enthaltend nutzbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Spurennährmittel, gezüchtet und das mikrobielle Labferment aus der Gärlösung gewonnen wird. b5

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten mikrobiellen Labferments zur Herstellung von Käse.

Das mikrobielle Labferment wird zweckmäßig dann von der Gärlösung abgetrennt, wenn eine nennenswerte Menge des Ferments gebildet worden ist. Dus so hergestellte Labferment kann zur Herstellung von Käse bei der Milchkoagulierung verwendet werden, wobei das sonst übliche Lab ganz oder teilweise durch das gemäß der Erfindung hergestellte Labferment erset/i werden kann.

Eine Erläuterung der allgemeinen Eigenschaften der Organismen Mucor miehei ist beschrieben von C 00-n e y und Emerson, »Thermophilie Fi^ngi«, Seilen 17 bis 27 (1964), veröffentlicht von W. H. Freeman & Co., San Francisco und London.

Kulturen der gemäß der Erfindung verwendeten Mikroorganismen sind hinterlegt bei den Northern Regional Research Laboratories, Peoria. Illinois und haben die obenerwähnten Codenummern erhalten. Besonders geeignet ist der Mikroorganismus, der die Codenummer NRRL3169 erhalten hat.

Beim Verfahren gemäß dem Anspruch 1 kann so vorgegangen werden, daß eine Kultur in einem geeigneten Medium in Gegenwart von Luft bei Temperaturen zwischen etwa 3O⁰C und etwa 55°C für Zeiträume von etwa 2 bis 14 Tagen gezüchtet wird. Das Fermentationsmedium hat in der Regel einen pH-Wert im Bereich von etwa 3 bis etwa 8 und vorzugsweise im pH-Wertbereich von etwa 4 bis etwa 7. Es können submerse aerobische Fermentationsmethoden, beispielsweise die Tiefgärung in kommerziellen Fermentationstanks oder die Gärung in Kolben auf einem Rotationsschüttler verwendet werden. Es können auch verschiedene Methoden der Aerobenoberflächenzüchtung angewandt werden, um das mikrobielle Labferment gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen.

Die Gewinnung des mikrobiellen Labferments aus dem Kulturmedium kann nach verschiedenen Methoden durchgeführt werden, wie sie zur Abtrennung von Proteinen aus Gemischen üblich sind, beispielsweise die Lösungsmittelfällung, die Salzfällung, die Chrorruitography und andere derartige Methoden der Proteinabtrennung. Beispielsweise für Lösungsmittel, die zur Ausfällung des mikrobiellen Labferments angewandt werden können, sind Ketone wie Aceton und Methyläthylketon, Alkohole wie Methanol, Äthanol und Isopropanol, sowie andere derartige organische Lösungsmittel. Als Salze, die verwendet werden können seien beispielsweise genannt Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und ähnliche Mineralsalze. Es können auch andere Verfahren zur Gewinnung des mikrobiellen Labferments angewandt werden, beispielsweise Dialyse, Elektrophorese, Gefriertrocknung usw.

Geeignete Fermentationsmedia können aus kohlenstoffhaltigen Stoffen hergestellt werden, wie Molke, abgebaute Maisstärke, Cerelose, Weizenkleie, und anderen organischen Quellen, die Kohlenstoff zur Verfügung stellen. Stickstoffhaltige Produkte sind beispielsweise Brauereihefe, Sojaprolein, Kasein, Harnstoff, Ammoniumsalze, Nitrate und andere derartige organische oder anorganische Quellen, die Stickstoff zur Verfügung stellen. Die Quellen für diese Bestandteile des Fermentationsmediums können rohe Naturstoffe oder stärker gereinigte Substanzen sein. Spurennährmittel, die vom Organismus benötigt werden können, sind in der Regel in den hauptsächlichen Bestandteilen des Fermentationsmediums enthalten. Deshalb ist die besondere Zugabe von Spurennährmittcln in der Regel nicht erforderlich. Beispielsweise sind Spurenmengen von anorganischen Salzen wie Metallchloriden, -sulfa-

und -nit rut cn

ien, -phosphaten und -nitraten in der kegel im Permentaiionsmedium zusammen mit den kohk-nstofflieferndcn und stickstoffliei'ernden Bestandteilen enthal-

Proteasen koagulieren in der Regel Milch. Jedoch verursachen die meisten Proteasen eine beträchtliche Protein-Verdauung. Wenn solche Proteasen von tierischem, pflanzlichem oder mikrobiellem Ursprung zum Koagulieren von Milch verwendet werden, entwickeln die erhaltenen Weißkäse unerwünschte Nebengeschmäcke, und zwar aufgrund der Proteolyse. Deshalb sind sie für die Herstellung von Käse nicht besonders gut geeignet.

Ein besonderer Vorteil des gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Labferments besteht darin, daß es unerwartet eine sehr niedrige proteolytische Aktivität bei gleichzeitiger großer milchkoagulierender Aktivität besitzt. Die Milchproteoiyse-Kurven, die mit den kennzeichengemäßen Mucor-miehei-Stämmen erhalten werden, sind identisch mit denjenigen, die mit ; Lab erhalten wurden, was eine sehr niedrige proteolytische Aktivität anzeigt. Das erfindungsgemäß hergestellte Mucor-miehei-Labferment scheint außerdem wesentlich weniger proteolytisch aktiv zu sein als Mucor pusillus, welches in der US-Patentschrift 31 51 039 offenbart ist. Bei Verwendung des Mucor-mie'nei-Labferments sind weniger als 10% des gesamten Kjeldahl-Stickstoffes in der Molke gefunden worden, während gemäß US-PS 31 51 039 (Spalte 4, Zeilen 58 bis 61)20% des Kjeldahl-Stickstoffes in die Molke gehen.

Wenn auch die vorliegende Erfindung nicht an eine bestimmte Theorie gebunden werden soll, wird doch angenommen, daß die Käsesorten, welche mit dem erfindungsgemäß hergestellten mikrowellen Labferment hergestellt werden, im wesentlichen frei sind von Nebengeschmäcken, und zwar >.um großen Teil aufgrund der niedrigen proteolytischen Aktivität des Labferment-Produktes.

Bei der Herstellung von gewissen Käsesorten ist es wünschenswert, ein mikrobielles Labferment, erhalten von den kennzeichengemäßen Mucor-miehei-Stämmen zu verwenden, in dem das Labferment im wesentlichen frei ist von irgendwelcher Lipase. Auf der anderen Seite kann es bei der Herstellung von gewissen anderen Käsesorten wünschenswert sein, ein mikrobielles aus diesen Stämmen erhaltenes Labferment zu verwenden, in dem das Labferment Lipase enthält.

Die folgenden Beispiele erläutern weiter die vorliegende Erfindung. Alle in den Beispielen angegebenen Prozentzahlen sind Gewichtsprozente, soweit nichts anderes gesagt ist. Die in den Eleispielen verwendete Cerelose ist hydrolysierte Stärke.

Beispiel I

Mucor miehei, NRRL 3169, wird von einer Agar-Schrägkultur unter sterilen Bedingungen in einen 1-Liter-Fernbach-Kolben gegeben, der 200 ml des folgenden wäßrigen Mediums enthält:

Gärflüssigkeit wird nitriert. Das FiItrat zeigt eine Aktivität, die 12.680 mcg NF Labiermant/mi gleich ist. Zu dem abgekühlten Filtrat (5''C) wird das doppelte Volumen von kaltem Aceton gegeben. Der erhaltene

"' Niederschlag wird filtriert und mit Aceton gewaschen, wobei ein feines weißes Pulver mit einer Aktivität von %8 mg NF Labferment/g erhalten wird.

Die Aktivität des labfermanthaltigen Materials, wie sie hier beschrieben wird, wird wie folgt ermittelt:

in Zu 9 ml frischer homogenisierter Milch (pH-Wert auf 6,2 eingestellt mit Milchsäure) bei 35°C wird 1 ml einer wäßrigen Lösung der Labfermentprobe gegeben. Die Probe wird periodisch gerührt und die Zeit, die erforderlich ist bis zum ersten Auftreten einer

i"> Ausflockung, wird gemessen. Das gleiche Verfahren wird gleichzeitig unter Anwendung von mehreren Spiegeln von NF-Labferment durchgeführt. Es wird eine Standardkurve für die Ausflockungszeit gegenüber dem Spiegel an NF-Labferment gezeichnet. Die

:ii Ausflockungszeit für die Versuchsprobe wird dann in Relation gesetzt zur Standardkurve, um die Aktivität der Vetsuchsprobe bezogen auf das N F-Labferment zu bestimmen.

Das gemäß dem Beispiel hergestellte mikrobicllc

Ji Labfermentprodukt kann dazu verwendet werden, um ganz oder teilweise das Lab zu ersetzen, das üblicherweise zur Erzeugung von gereiften Käsesorten wie Käse vom Cheddar Typ, Schweizer Käse und anderen sogenannten harten und weichen Käse in verwendet wird. Es kann auch zur Erzeugung von irgendwelchen anderen Arten von Käse verwendet werden, wo bisher Lab-Präparate verwendet worden sind.

μ B e i s ρ i e 1 2

Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, wobei das wäßrige Gärmedium durch die folgenden Media ersetzt wird:

Molke	82%
abgebaute Maisstärke	5%
Brauereihefe	1%
Cerelose (Glucose)	1%
Wasser	11%

a) Molke
Glucose

b) abgebaute Maisstärke
Brauereihefe
Cerelose (Glucose)
Molke
Wasser

c) Molke

abgebaute Maisstärke
Cerelose (Glucose)
Stickstoffquelle*
Wasser

97%

3%

100%

5% 1% 1%

0 - 80%

13-93%

100%

50% 5% 1%

0,5-5% 39-43,5%

100%

Der Kolben wird auf einem Drehschüttelgerät bei 37°C 168 Stunden lang der Züchtung überlassen. Die 100%

* Kasein. Sojaprotein, Pepton. enzymatisch abgebautes Kasein oder Maisquellwasser.

Die obigen Gärmedia sind weitere Beispiele für geeignete Media, die Kohlenstoff-, Stickstoff- und Spurennährmittel enthalten. Diese Nährmedia können zur Herstellung eines mikrowellen Labferments mit to verhältnismäßig großer milchkoagulierender Aktivität und verhältnismäßig niedriger proteolytischer Aktivität gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden.

Beispiel 3

An Stelle der submerscn Fermentation in einem flüssigen Medium gemäß Beispiel 1 wird ein Mueor-miehei-Labferment hergestellt in (a) einem stehenden und (b) einem bewegten halbfesten Fermentationsmedium, das 25% Weizen, 25% Zuekerrübenpulpe und 50% Molke enthält. Diese Labfermentp-odukte können zur Herstellung von harten und weichen Käsesorten in zufriedenstellender Weise verwendet werden.

Beispiel 4

Cheddar-Käse wird dadurch hergestellt, daß die zum Absetzen üblicherweise verwendete Lab-Zubereitung durch eine äquivalente Menge des gemäß Beispiel 1 hergestellten mikrowellen Labfermcnt-Produkies erseizt wird. Bei diesen Verfahren wird pasteurisierte Vollmilch auf 30 bis 31,1°C erwärmt. Dazu wird 1% einer handelsüblichen Milchsäure-Starterlösung zugegeben. Dann wird das mikrobielle Labferment in einer Menge von 85 g pro 454 kg Milch zu der Milch gegeben. Die Mischung wird gerührt, bis ein Quark mit zufriedenstellender Festigkeit erhalten wird. Der Quark wird in Blöcke geschnitten und dann mehrere Stunden lang bei 37,8°C gekocht. Der Quark wird von der Molke abgetrennt und in Scheiben geschnitten. Der gemahlene Quark wird dann mit 3 Gewichtsprozent Käsesalz gesalzen. Der gesalzene Quark wird dann in Gebinde gegeben, gepreßt und in einem Reifungsraum gelagert. Von dem mit dem Liibferment gemäß diesem [Jcispie hergestellten Käse weiden nach einigen Tagen dei Reifung in Abständen Proben entnommen. Ks wire dabei gefunden, daß er eine ausgezeichnete Qualität ha und im wesentlichen frei von Nebengeschmack ist.

Andere übliche Verfahren zur Herstellung vo_: Cheddar-Käse, beispielsweise diejenigen, die dual P re scott und Dunn, »Industrial Microbiology« Kapitel 21 (3. Auflage, 1959), McGraw-Hill Book Co Inc., New York und den dort angegebenen Literatur nachweisen beschrieben sind, können ebenfalls angewandt werden, um gemäß der vorliegenden Erfindung die Lab-Präparate zu ersetzen, die üblicherweise zui Herstellung von Käse angewandt werden. Es kann dabe: eine äquivalente Menge des mikrowellen Labs aus Mucor miehei gemäß Beispiel 1 angewendet werden, um einen Käse von guter Qualität herzustellen.

Um die Herstellung von mikrobiellem Labfcrmeni aus den kennzeichengemäßen Stämmen von Mucor miehei ohne und mit Bildung von Lipase zu demonstrieren, wurde das folgende Verfahren angewandt:

Die Züchtungen wurden unter Verwendung der Stämme von Mucor miehei. die die Nummern NKRL A 7772 und NRRL 3169 erhielten, in gerührten, belüfteten Glas-Fermentationsgefäßen bei 37°C für einen Zeitraum von 168 Stunden durchgeführt. Die angewandten Medien und die Labferment-Aktivitä'en der Filtrate der Fermentationsbrühen sind nachfolgend in der Tabelle A zusammengestellt.

Tabelle A	Fermentation Nr. 1 2 M. miehei Stamm A 7772 3169	50% 5 1 1 43	3 3169
	50% 5 1 1 43	100% 8,650	80% 5 1 1 13
Medium: Molke Abgebaute Maisstärke Brauereihefe Cerelose (Glucose) Wasser	100% 4,380		100% 9,000
Filtrat: Labferment Aktivität mcg Nl Labferment/ml

Die Filtrate der Fermentationsbrühen der Fermentationen Nr. 1,2 und 3 wurden dann wie folgt behandelt:

Fermentation Nr. 1:

Zu dem Filtrat wurde das zweifache Volumen Aceton gegeben, wobei ein weißer Niederschlag erhalten wurde, der die folgenden Aktivitäten besaß:

Labfermenle:460 mg NF Labferment/g.

Lipase: 0 Einheiten/g.

Fermentation Nr. 2:

Zu dem Filtrat wurde das zweifache Volumen Aceton gegeben, wobei ein Niederschlag mil den folgenden Aktivitäten erhalten wurde:
Labferment: 540 mg NF Labferment/g.
Lipase: 38 Einheiten/g.

Fermentation Nr. 3:

Zu jeweils 100 ml des Filtrats wurden 3,0 Gramm CaCb und 500 ml Äthanol gegeben, wobei ein bräunlichgelber Niederschlag mit den folgenden Aktivitäten erhalten wurde:
Labferment: 652 mg NF Labferment/g.
Lipase: 0 Einheiten/g.

Die Labfermentaktivität ist wie oben beschrieben definiert. Die Lipaseeinheiten werden definiert als die Menge an Enzym (Lipase), die aus einem Olivenöl-Substrat ein mikro Äquivalent Säure pro Minute bei pH 6,5 und 30⁰C erzeugt.

Vergieichsversuch

Unter Standardfermentationsbedingungen zur Herstellung von mikrobiellem Labferment, wie sie im

resentlichen in Beispiel l beschrieben wurden, wurden ie in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Stämme emäß der Erfindung einerseits und gemäß dem Stand er Technik (US-PS 31 51 039 und 32 12 905) anderer-

seits gezüchtet. In der Tabelle sind die relativen Ausbeuten an mikrobiellem Labferment angegeben, wobei die mit dem Stamm NRRL A 13 042 erhaltene Ausbeute mit 100 zugrunde gelegt wurde.

Stamm Relative Ausbeute an
mikrobiellem
Labferment

Mucor miehei Stämme	100
NRRLA 13 042	73
NRRLA 7772	59
NRRLA 13 131	49
NRRL 3169
Mucor pusillus Stämme	2
NRRL 1426	4
NRRL 3469	1
NRRL 3470

Aus dei Tabelle ist ersichtlich, daß die mit den Stämmen geir. ^!ß der Erfindung erzielte Ausbeute um ein Vielfaches besser ist als diejenige, die mit den drei Stämmen Mucor pusillus gemäß dem Stand der Technik erhalten werden kann.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von mikrobielleir, Labferment mit verhältnismäßig hoher milchkoagu- ^r> lierender Aktivität und verhältnismäßig niedriger proteolytischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß Mucormiehei NRRL 3169, NRRL A 7772, NRRL A 13 131 und/oder NRRL A 13 042 auf üblichem biologischem Wege unter aeroben Bedingungen in einer Nährlösung, enthaltend nutzbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Spurennährmittel gezüchtet und das mikrobielle Labferment aus der Gärlösung gewonnen wird.

2. Verwendung des gemäß Anspruch 1 hergestell- i> ten mikrobiellen Labferments zur Herstellung von Käse.