DE1945447B2

DE1945447B2 - Verfahren zur herstellung eines milchgerinnungsenzyms

Info

Publication number: DE1945447B2
Application number: DE19691945447
Authority: DE
Inventors: Robert Lemoyne; Gertzman Donald Paul; Melachourius Nicholas; Elkhart Ind. Charles (V.St.A.). C12d 13-10
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1968-09-09
Filing date: 1969-09-08
Publication date: 1973-03-08
Also published as: US3549390A; DE1945447C3; GB1233332A; CA928234A; DE1945447A1; FR2017645A1; IT941529B; NL6913507A

Description

1 bis 3 mm

Dunkelgrau

keinen

an der Abzweigungsstelle
keine

1 bis 3 mm
5 bis 9 μ
glasig

Sabouraud- Dexi rose- Agar	Melasse-Agar	Brot
0,1 bis 1 mm	1 bis 2 mm	I bis 2,5 mm
glasig	Dunkclgrau	Dunkelgrau
brotartig	keinen	keinen
an der Abzwei	an der Abzwei	an der Ab?wei-
gungsstelle	gungsstelle	gungsslcllc
keine	keine	keine
1 bis 3 mm	1 bis 2 mm	I bis 2 mm
5 bis 9 μ	5 bis 9 μ	5 bis 9 μ
glasig	glasig	glasig bis Braun

Fortsetzung

Kolonie — Charakteristik

YPSS-Agar

Sabouraud-Dextrose-Agar

Melasse-Agar

Brot

C. Sporangium

Farbe

Sporenstreuung .

Größe

Form

D. Columella
Form

Farbe

Merkmale

E. Sporangiosporen

Größe

Form

F. Chlamydosporen

G. Zygosporen

Form

Größe

Farbe

H. Suspensor

Farbe

Merkmale

Durchmesser
Relative Größe ..

Gelbbraun

60 bis 100 μ rund

eiförmig oder rund glasig

warzenartige Spitzen

3,5 bis 6 μ oval bis sphärisch

keine

vorhanden rund bis oval 20 x 20 μ 30 x 30 μ Braun

glasig keine

7,5 μ

gleich

Gelbbraun Gelbbraun

die gesamte Masse löst sich ab

bis 100 μ
rund

oder eiförmig

glasig warzenartige

Spitzen

3,5 bis 6 μ oval bis sphärisch

keine keine 60 bis 100 μ
rund

runü

oder eiförmig

glasig

warzenartige
Spitzen

3,5 bis 6 μ
oval bis
sphärisch

keine
keine

Gelbbraun

60 bis 100 μ
rund

rund

oder eiförmig

glasig bis Braun

warzenartige

Spitzen

3,5 bis 6 μ
oval bis
sphärisch

keine
keine

Die Mucor miehei NRRL 3420 Organismen werden an einer Agarschräge erhalten und können in einem Medium wachsen, das Kohlenhydrate und Stickstoff enthält. Vorzugsweise enthält das Medium außerdem anorganische Salze. Typische Kohlenhydrate sind Maisstärke, Dextrose, Laktose, Milchfeststoffe, Weizenkleie und ähnliche Stoffe. Typische Stickstoffquellen sind Sojamehl, proteinhaltige Materialien, Aminosäuren, Diammoniumphosphat, Nährhefe, Natrium-caseinat und ähnliche Stoffe. Typische anorganische Salze sind Calciumcarbonat. Natriumsulfat, Diammoniumphosphat. Zinkacetat und ähnliche Stoffe. Diese Kohlenhydrate, Stickstoffquellen und anorganische Salze sind bekannt. Es ist günstig, wenn das Medium gemahlenen Mais als Quelle für einen Teil der Kohlenhydrate, des Stickstoffs und der anorganischen Salze enthält.

Die Organismen wachsen vorzugsweise unter den Bedingungen der submersen Fermentation innerhalb von 2 bis 7 Tagen bei einer Temperatur von ungefähr 30 bis ungefähr 50°C. Bei Temperaturen unterhalb von ungefalfr 30° C ist die Ausbeute an dem gewünschten Enzym zu niedrig um wirtschaftlich verwendbar zu sein, während bei Temperaturen oberhalb ungefähr 50'C das gewünschte Enzym inaktiviert wird. Die bevorzugte Wachslumstempcratur liegt zwischen ungefähr 35 und ungefähr 40⁰C. Am besten wird Atmosphärendruck verwendet, aber Drücke oberhalb und unterhalb von atmosphärischem Druck können. wenn gewünscht, ohne deutliche Vor- oder Nachteile verwendet werden.

Das gewünschte Milchgerinnungsenzym der vorliegenden Erfindung befindet sich in der Gärlösung außerhalb des Myzels und kann in der bevorzugten flüssigen Form durch einfaches Abfiltrieren des Myzels von der Gärbrühe und Auffangen des Filtrats erhalten werden. Das entstehende flüssige Enzym besitzt beim Aufbewahren eine Stabilität, die mit der bisher bekannten von Kälberrennin vergleichbar ist. Das Enzym kann, wenn gewünscht, mit Hilfe der bekannten Verfahren zur Gewinnung von Enzymen in Pulverform erhalten werden. So ein pulverisiertes Enzym ist ebenfalls beim Aufbewahren stabil. Das Filtrat kann gefroren und vom gefrorenen Zustand aus mit Hilfe der bekannten Gefriertrocknungsverfahren getrocknet werden. Das Gärbrühefiltrat kann wahlweise auch mit Äthanol behandelt werden, um das Enzym auszufällen. Das ausgefallene Enzym wird dann mit Äthanol gewaschen und im Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet. Aceton oder andere organische Lösungsmittel sowie Ammonium-sulfat können ebenfalls verwendet werden, um das Enzym aus der wäßrigen Lösung auszufällen.

Das neue MilcV.gerinnungsenzym, das gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, besitzt eine gute Aktivität in Beziehung auf das Gerinnen der Milch, während es eine geringe proteolytische Aktivität besitzt. Es greift daher den während der

Milchgerinnung gebildeten Quark nicht wesentlich an oder erweicht ihn nicht. Dieses neue Enzym kann unter den üblichen Milchgerinnungsbedingungen, wie sie mit dem Kälberrennin angewendet werden, verwendet werden und ist daher für die zur Zeit verwendeten Käseherstellungsverfahlen geeignet. Es kann an Stelle des gesamten oder eines Teils des Rinderrennins bei der üblichen Käseherstellung verwendet werden. Käseprüfungen haben gezeigt, daß Käse, der aus Quark hergestellt worden ist, der durch das Mucor miehei NRRL 3420 Milchgerinnungsenzym erzeugt worden ist, selbst nach einer langen Reifungszeit einen erwünschten Geschmack und Bitterfreiheit zeigt. Das ist äußerst ungewöhnlich, da die meisten bisher bekannten mikrobiologischen Milchgerinnungsenzyme proteolytische Eigenschaften hatteu, die in dem Käse entweder sofort oder nach einer kurzen Reifungszeit Bitterkeit erzeugten.

Die Milchgerinnungsaktivität des gemäß dem vorliegenden Verfahren hergestellten Enzyms wurde auf die folgende Weise geprüft. Eine I0%ige (Gew./Vol.) Lösung wurde durch Lösen der entsprechenden Menge nicht fetter, trockner Milchbestandteile in Wasser hergestellt. Zu dieser Lösung wurde dann CaCl₂ ■ 2H₂O zugegeben (bis zu einer Calciumkonzentration von 0,01 ml). Ein Anteil von 5 ml der obigen Milchlösung wurde in ein Reagenzglas gegeben und auf 37,5°C erwärmt. 0,5 ml wäßriges verdünntes Enzym von 37,5°C wurden dann zu der Milchlösung in dem Reagensglas zugegeben. Die Enzym-Milchlösung wurde dann gerührt, und die Zeit bis zur ersten Ausflockung wurde gemessen. Die Enzymkonzentration wurde so gewählt, daß die Gerinnungszeit ungefähr 4 Minuten betrug. Die Milchgerinnungsaktivität des Enzyms wurde wie folgt berechnet.

Soxhleteinheiten =

M (ml) 2400 (see)
E (mg) TösecT

1000

M = Milchvolumen.
E = Enzymgewicht.
T = Zeit bis zum ersten Ausflocken.

40

Die Enzymaktivität wird dann in Soxhleteinheiten (SE) pro Gramm ausgedrückt. Wenn das Enzym in der ursprünglichen flüssigen Form verwendet wird und nicht als gelöstes pulvriges Enzym in Wasser, wird in der obigen Formel für E das entsprechende Volumen in Mikrolitern eingesetzt,und die Enzymaktivität wird in Soxhleteinheiten pro Milliliter angegeben. Eine Soxhleteinheit ist der Betrag von Enzymaktivität der 1 ml der obigen Milchlösung in 40 Minuten zum Gerinnen bringt.

Die proteolytische Wirkung des Milchgerinnungsenzyms wird auf die folgende Weise geprüft. Eine l%ige (Gew./Vol.) wäßrige Lösung wird durch Lösen der entsprechenden Menge Casein in Wasser hergestellt. Zu dieser Lösung wird dann NaCl bis zu einer Konzentration von 0,1 m-Natrium zugegeben. 15 ml der obigen Lösung werden in ein Reagensglas gegeben und auf 37,5°C erwärmt. 7 ml der Enzymlösung von 37,5° C werden dann zu der Caseinlösung in dem Reagensglas zugegeben. Die Enzym-Caseinlösung wird dann bei 37,5°C genau 30 Minuten inkubiert. 22 ml einer 24%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Trichloressigsäure werden dann in das Reagensglas gegeben, um die Reaktion durch Inaktivieren des Enzyms abzubrechen. Das entstehende Gemisch wird 20 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann durch ein Whatman-Papierfilter Nr. 42 filtriert Die Ultraviolettabsorption des entstehenden FiJtrats wird bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen. Eine Blindprobe wird hergestellt, indem man 22 ml der 24%igen wäßrigen Trichloressigsäurelösung zu 7 ml der Enzymlösung, die untersucht werden soll, zugibt und dann 15 ml der l%igen wäßrigen Caseinlösung bei 37,5° C zu dem Gemisch zugibt. Die Ultraviolettabsorption der Blindprobe wird dann ebenfalls bei 280 nm gemessen. Die Enzymkonzentration wird so ausgewählt, daß die Ultraviolettabsorption bei 280 nm der oben angegebenen Reaktionslösung im Bereich von ungefähr 0,005 bis 0,700 liegt. Die proteolytische Aktivität des Enzyms wird wie folgt berechnet:

C =

A₂₈₀ - 0,004571
6,58589

Proteolytische Einheiten = C₁- ■ 1000.

Spezifische Aktivität

Proteolytische Einheiten · 1000

C₁ = Tyrosin-Konzentration (mg/ml).
Λ280 = Absorption bei 280 nm.

E = Menge des verwendeten Enzyms (mg).

Die proteolytischen Einheiten für die Blindprobe werden von denen der Probe abgezogen, bevor die spezifische Aktivität der Probe berechnet wird, die in proteolytischen Einheiten (PE) pro Gramm angegeben wird. Wenn das Enzym in der ursprünglichen flüssigen Form verwendet wird, und nicht als 'n Wasser gelöstes pulverisiertes Enzym, wird E für das entsprechende Volumen in der obigen Formel in Mikrolitern angegeben, und die Enzymaktivität wird in proteolytischen Einheiten pro Milliliter ausgedrückt. Eine proteolytische Einheit ist der Betrag von Enzymaktivität der in einer l%igen Caseinlösung 1 ji.g Substanz, berechnet als Pyrosin, pro Milliliter Filtrat in 30 Minuten in Freiheit setzen kann. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Eine Kultur von Mucor miehei NRRL 3420 wurde in verschiedene 1-1-Erlenmeyerkolben gegeben, von denen jeder ein sterilisiertes Medium enthielt, das aus 10 g Maisstärke, 12,5 g gemahlenem Mais, 7,5 g Sojamehl, 1,25 g Calciumcarbonat und 250 ml Wasser bestand. Dieses Medium enthielt auch 100 mg bakterielle Amylase, um die Stärkekomponenten des Mediums zu lösen. Die geimpften Kolbeninhalte wurden dann in einer sich hin und her bewegenden Schüttelmaschine mit einer Hubweite von 5,08 cm mit einer Frequenz von 176 Bewegungen pro Minute 6 T;i['c geschüttelt, wobei die Temperatur auf 32,5⁰C gehalten wurde. Die entstehende Gärbrühe wurde dann von dem Myzel abfiltriert, und die vereinigten Filtrate aus allen Kolben enthielten eine Enzymaktivität von 1233 Soxhleteinheiten pro Milliliter.

Ein Teil des Filtrates wurde gefroren und aus dem gefrorenen Zustand heraus entsprechend den bekannten Methoden getrocknet. Das getrocknete Pulver enthielt 114 823 Soxhleteinheiten pro Gramm und 727 proteolytische Einheiten pro Gramm. Das Verhältnis von Soxhleteinheiten zu proteolytischen Einheiten betruE 157.9.

Ein auf die oben angegebene Weise hergestelltes Enzym wurde dann zur Käseherstellung verwendet. 109 kg pasteurisierte Vollmilch wurden in einen Käsebottich gegeben und auf 31⁰C erhitzt. 1,09 kg einer Milchsäure-Starterkullur wurden dann zu der Milch zugegeben. Nach einer Stunde wurde eine Menge des wie oben hergestellten flüssigen Enzymfiltrats, die eine Gesamtenzymaktivität von ungefähr 800 000 Soxhleteinheiten enthielt, zu der Milch in dem Käsebottich zugegeben. Die Milch gerann und ein zufriedenstel- _]0 lender Quark wurde innerhalb von 28 Minuten hergestellt. Er wurde dann in die gewünschten Formen geschnitten und auf 39° C erhitzt. Die Molke wurde abgezogen und die üblichen Schritte wie die Herstellung von Cheddar,Mahlen, Salzen und Pressen wurden ausgeführt, um grünen Käse zu erhalten. Ein Vergleichskäse wurde in der selben Zeil hergestellt, wobei das bisher bekannte Kälberrennin unter ähnlichen Bedingungen verwendet wurde. Die Schnittqualität des Quarkes und die Struktur des mit dem mikrobiologisehen Enzym der vorliegenden Erfindung hergestellten grünen Käses erwies sich als vergleichbar mit der mit Kalbrennin hergestellten. Die Käse wurden bei 7°C und einer relativen Feuchtigkeit von 90% 60 Tage gereift. Die organoleptischen Bewertungen wie der Geruch, Geschmack, der Bruch und ähnliches zeigten, daß der mit dem mikrobiologischen Enzym hergestellte Käse normales Aussehen, Struktur und angenehmen Geschmack besaß und vollkommen frei war von Bitterkeit. Ranzigkeit oder einem anderen unangenehmen Beigeschmack und im wesentlichen der gleiche war, wie der mit Kälberrennin hergestellte.

Beispiel 2

Eine Kultur von Mucor miehei NRRL 3420 wurde in verschiedene 2800-ml-Fernbachkolben gegeben, von denen ein jeder ein sterilisiertes Medium enthielt, das aus 10 g Maisstärke, 12,5 g gemahlenem Mais, 6,0 g eines aminosäurehaltigen Materials (Peptone T), 0,25 g Natriumsulfat und 250 ml Wasser bestand. Dieses Medium enthielt auch 100 mg bakterieller Amylase, um die Stärkematerialien zu lösen. Die geimpften Kolbeninhalte wurden dann in einer sich hin und her bewegenden Schüttelmaschine mit einer Hubweite von 5 cm und einer Frequenz von 176 Bewegungen pro Minute 7 Tage geschüttelt, wobei die Temperatur auf 37 C gehalten wurde. Die entstehende Gärbrühe wurde von dem Myzel abfiltriert, und die vereinigten Filtrate aus allen Kolben enthielten 2290 Soxhleteinheiten pro Milliliter. Ein Teil des Filtrats wurde gefroren und aus dem gefrorenen Zustand entsprechend den bekannten Verfahren getrocknet. Das getrocknete Pulver enthielt 226 585 Soxhleteinheiten pro Gramm und 1339 proteolytische Einheiten pro Gramm. Das Verhältnis von Soxhleteinheiten zu proteolytischen Einheiten betrug 169,2. Das wie oben hergestellte Enzym kann zum Gerinnen von Milch bei der Käseherstellung verwendet wenden

Beispiel 3 _&

Eine Kultur von Mucor miehei NRRL 3420 wurde in verschiedene 2800-ml-Fernbachkolben gegeben, von denen jeder ein sterilisiertes Medium enthielt, das aus 8,0 g Dextrose-monohydrat, 12,5 g gemahlenem Mais, 5,0 g Peptone T und 250 ml Wasser bestand. Die geimpften Kolbeninhalte wurden dann in einer sich hin und her bewegenden Schüttelmaschine mit einer Hubweite von 7,62 cm und einer Frequenz von 176 Hin- und Herbewegungen pro Minute 7 Tage schüttelt, wobei die Temperatur auf 32° C gehalten wurde. Die entstehende Gärbrühe wurde von dem Myzel abfiltriert, und die vereinigten Filtrate aus allen Kolben enthielten 2400 Soxhleteinheiten pro Milliliter. Das Filtrat wurde dann gefriergetrocknet, und das entstehende Pulver enthielt 298 804 Soxhleteinheiten pro Gramm und 2321 proteolytische Einheiten pro Gramm. Das Verhältnis von Soxhleteinheiten zu proteolytischen Einheiten betrug 128,7. Das wie oben hergestellte Enzym kann zur Milchgerinnung bei der Käseherstellung verwendet werden.

Das entsprechend der vorliegenden Erfindung hergestellte Enzym besitzt ein höheres Verhältnis von Milchgerinnungsaktivität zu proteolytischer Aktivität als jedes bisher bekannte mikrobiologische Rennin. Zwei getrennte Ansätze von Enzym von dem angenommen wurde, daß es von dem bisher bekannten Mucor miehei Stamm Ka 3111 erzeugt worden ist, hatten die folgenden Eigenschaften.

Stamm Ka 3111
Ansatz

Gerinnungs-Aktivitäl

SE/g

295 200
304 180

Proteolytische

Aktivität

PE/g

3348
3126

SE£
T⁵ETg

88.2
97,3

Ein von dem bisher bekannten Mucor miehei Stamm »University of California 21« enthielt 28 846 Soxhleteinheiten pro Gramm und 433 proteolytische Einheiten pro Gramm und ein Verhältnis von SE/PE von 66,6. Der mit diesem Material hergestellte Käse besitzt einen unerwünschten ranzigen Geschmack.

Da die Menge eines gegebenen Milchgerinnungsenzyms, das für die Käseherstellung verwendet wird, im allgemeinen direkt von seiner Gerinnungsaktivität abhängt, erfordern die bisher bekannten Enzyme für eine bestimmte Gerinnungsaktivität eine größere Menge proteolytische Aktivität als in dem Enzym der vorliegenden Erfindung vorhanden ist. Diese höhere proteolytische Aktivität der bisher bekannten Enzyme führt zu einem unbefriedigenden Quark und zu einem unerwünschten bitteren Geschmack in dem fertigen Käse. Im Gegensatz dazu ermöglicht das höhere Aktivitätsverhältnis des erfindungsgemäßen Enzyms die Herstellung von zufriedenstellendem Käse, der mit dem mit natürlichem Kälberrennin hergestellten vergleichbar ist.

Es ist ferner üblich, zu Milch, die einen geringen Calciumgehalt besitzt und die »gealtert« ist, eine Calciumchloridlösung zuzugeben. Diese Calciumchloridlösung übt jedoch einen Einfluß auf die Aktivität des Milchgerinnungsenzyms aus. Auch die Änderung des pH-Wertes der Milch kann einen unerwünschten Einfluß auf die Milclhgerinnungsaktivität ausüben Diese Aktivitätsänderungen sind in jedem Falle un erwünscht, gleichgültig, ob es sich um eine Zunahm« oder Abnahme der Aktivität handelt, da jede Ände rung zu einer Änderung des Herstellungsverfahrens de Käses führt. Es wurde nun Versuche durchgeführt um die prozentuale Änderung der Enzymaktivität η Abhängigkeit des CaCl₂-Gehaltes und der pH-Werts änderung zu zeigen. Man erhielt die folgenden Ergeb nisse:

Versuch 1

(nachgereicht)

0,03% CaCl₂; pH Änderung von 6,65 auf 6,50

Enzym	Prozentuale Änderung der Enzym-Aktivität
Endothica parasitica Mucor pusillus Mucor miehei 3420 Kälberrennin	-11 + 6 0 + 5

Versuch 2
(nachgereicht)

pH 6,65; Änderung des CaCl₂-Gehaltes vor. 0,03 auf 0,06%

Enzym	Prozenttale Änderung der Enzym-Aktivität
Endothica parasitica Mucor pusillus	-16 + 21

"5

20

10

Enzym	Prozentuale Änderung der Enzym-Aktivität
5 Mucor miehei 3420 Kälberrennin	+ 6 + 4

Versuch 3

(nachgereicht)

0,06% CaCl₂; pH-Änderung von 6,65 auf 6,50

Enzym

Endothica parasitica

Mucor pusillus

Miicor miehei 3420 ,
Kälberrennin

Prozentuale Änderung der Enzym-Aktivität

-11 + 10

-4

J.7

Aus diesen Versuchen geht eindeutig hervor, daß bei dem erfindungsgemäß hergestellten Milchgerinnungsenzym sowohl bei einer Änderung des CaCl₂-Gehaltes als auch bei einer Änderung des pH-Wertes die geringsten Aktivitätsänderungen auftreten.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines Milchgerinnungsenzyms durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in hierfür üblichen Nährmedien und bei hierfür üblichen Züchtungsbedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Mucor miehei NRRL 3420 einsetzt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Milchgerinnungsenzyms. Das entstehende Enzym kann dazu verwendet werden, bei der Käseherstellung die Milch zu koagulieren.

Bei der im allgemeinen üblichen Käseherstellung läßt man die Milch gerinnen oder koagulieren, um einen festen Quark zu bilden. Dieser Quark wird in viele Stücke geschnitten, und die Stücke werden zusammen erhitzt. Die flüssige Molke wird von dem erhitzten Käsebruch abgetrennt, der dann in Blöcke geschnitten und gepreßt wird und einige Monate lang ausreift, um das gewünschte Käseprodukt zu bilden. Das normalerweise verwendete Mittel, um den Quark durch Gerinnen oder Koagulieren der Milch herzustellen, ist das Enzym Rennin, das im Labmagen von Kälbern gefunden wird.

Kälberrennin ist eine Substanz, die aus der Schleimhaut des vierten Magens von nicht entwöhnten Kälbern hergestellt wird. Es ist einleuchtend, daß die Qualität und Quantität von Rennin, das für die Käseherstellung verfügbar ist, direkt von der Zahl und Art der Kälber abhängt, die für Nahrungszwecke geschlachtet werden. Das hat bisher zu vielen Versuchen geführt, einen geeigneten Ersatz für Kälberrennin zu finden. Es wurden verschiedene pflanzliche und mikrobiologische Enzymzubereitungen zum Gerinnen von Milch verwendet. Obwohl verschiedene Enzymzubereitungen, die die gewünschten Milchgerinnungseigenschaften besitzen, untersucht wurden, sind die meisten dieser Enzyme kommerziell nicht geeignet. Sie haben eine so hohe proteolytische Aktivität, daß sie dazu neigen, den Quark, den sie erzeugt haben, aufzulösen. Sie verleihen dem aus diesem Quark hergestellten Käse einen bitteren Geschmack. Die bisher bekannten mikrobiologischen Enzyme haben außerdem den Nachteil, daß sie im allgemeinen eine geringe milchgerinnende Wirkung besitzen.

Ein Fortschritt wurde durch die Verwendung vor Mucor miehei Stamm Ka 3111 gemacht, der bein »Centraalbureau voor Schimmelkultur, Baarn, Hol land« unter der Nummer CBS 370.65 niedergelegi ist (französische Patentschrift 1 521 368). Dieser Organismus bildet, wenn er auf einem geeigneten Mediun wächst, ein mikrobiologischen Rennin, das für dk Herstellung von Käse kommerziell verwendbar ist.

Aus der schweizerischen Patentschrift 442 192 isi die Verwendung von Mumcor pusillus, aus der französischen Patentschrift 1 499 653 die Verwendung von Bacillus cereus und aus der USA.-Patentschrifi 3 275 453 die Verwendung von Endothica parasitic zur Herstellung von Milchgerinnungsenzymen bekannt. Alle diese bekannten Milchgerinnungsenzymt besitzen jedoch Nachteile, da sie entweder ein zu nie driges Verhältnis von spezifischer Milchgerinnungsaktivität zu proteolytischer Aktivität besitzen und dadurch zu einem bitteren Geschmack des damit hergestellten Käses Führen. Außerdem sind die bekannter Enzyme empfindlich gegen den üblichen Zusatz einci CaCl₂-Lösung zu der Milch bei der Käseherstellung

Diese Nachteile werdjen erfindungsgemäß überwunden durch ein Verfahren zur Herstellung eines Milchgerinnungsenzyms durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in hierfür üblichen Nährmedien und bei hierfür üblichen Züchtungsbedingungen, da« dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Mucor miehei NRRL 3420 einsetzt. Dieses Enzym hat ein erwünscht hohes Verhältnis von Gerinnungsaktivität zu proteolytischer Aktivität und kann unter den gleichen Bedingungen verwendet werden, wie das übliche Kälberrennin, um einen Käse von gutem Geschmack und erwünschter Konsistenz und Struktur herzustellen.

Der für die vorliegende Erfindung geeignete Mikroorganismus wurde aus getrockneten Sedimenten einer Abwasseraufbereitungsanlage isoliert und als ein Stamm von Mucor miehei entsprechend den bekannten Verfahren klassifiziert. Der spezielle Stamm von Mucor miehei. der zur Herstellung des neuen Milchgerinnungsenzyms geeignet ist, wurde bei der »Northern Utilization Research Branch, Agricultural Research Service of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois« niedergelegt und erhielt die Identifikationsnummer NRRL 3420. Diese Kultur ist ohne Beschränkung allgemein erhältlich.

Dieser Stamm hat die folgenden Charakteristika:

Kultur-Medium

Kolonie Charakteristik

A. Rasen

Tiefe

Farbe

Geruch

B. Sporangiosporen
Trennung durch
Scheidewände ..,

Merkmale

Länge

Durchmesser ...
Farbe

YPSS-Agar