Enzymmischung, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Enzymmischung bakteriellen Ursprungs, ein Verfahren zu deren Herstellung und die Verwendung dieser Enzymmischung zur Herstellung von Käse. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Enzymmischung, die das Gerinnen der Milch bewirkt und die insbesondere anwendbar ist, um einen'Käse herzustellen, der ausserordentlich gute Struktur besitzt, wobei die Ausbeute und die Eigenschaften bezüglich der Beständigkeit des Geschmackes sehr gut sind.
Die aus Tieren gewonnenen Enzympräparate werden im allgemeinen aus dem vierten Magen der gesäugten Kälber extrahiert und diese Präparate werden im allgemeinen Labt genannt. Es ist schon lange bekannt, dass diese Präparate die Fähigkeit haben, Milch zu koagulieren, und anschliessend geringe proteolytische Eigenschaften auf das so gebildete Gerinnungsprodukt ausüben.
Bezüglich dieser beiden Eigenschaften war Lab das bisher einzige erhältliche Produkt und seine Vorteile bei der Herstellung von verschiedenen Arten an Käsen und Milchprodukten sind hauptsächlich auf diese Eigenschaften zurückzuführen. Da jedoch das zur Herstellung dieses Enzyms verwendete Rohmaterial der vierte Magen der gesäugten Kälber ist, ist die Menge an zur Verfügung stehendem Rohmaterial begrenzt und das Produkt ist daher teuer.
Man weiss, dass eine grosse Anzahl an proteolytischen Enzymen, die in der Folge als Peptidasen bezeichnet werden, die Eigenschaft besitzen, Milch zu koagulieren. So sind sowohl die Peptidasen aus tierischem Ursprung, beispielsweise Pepsin oder Trypsin, als auch die Peptidasen aus pflanzlichem Ursprung, beispielsweise Papain und Ficin in der Lage, eine Koagulierung der Milch hervorzurufen. Da nur wenig Lab zur Verfügung steht, wurde Pepsin als Verdünnungsmittel für das Lab venvendet. Obwohl Pepsin im allgemeinen dem Lab bezüglich der Aktivität und der spezifischen Eigenschaften sehr ähnlich ist, wurde gefunden, dass Käse, der mit Hilfe von koagulierenden Präparaten hergestellt wurde, die wesentliche Mengen an Pepsinen enthalten, die Neigung besitzt, beim Lagern bitter zu werden.
Dies dürfte von einer Art der Proteolyse herrühren, die von der Proteolyse, die durch Lab hervorgerufen wird, verschieden ist. Trypsin hat den Nachteil, dass es viel stärker proteolytische Eigenschaften aufweist, so dass eine nachfolgende zu starke Proteolyse dazu führt, dass das gebildete Koagulierungsprodukt abgebaut wird, obwohl durch Trypsin Milch rasch zum Koagulieren gebracht wird.
Auch Peptidasen, die aus Bakterien hergestellt werden, beispielsweise aus dem Bacillus subtilis, dem Bacillus cereus und der Pseudomonas fluorescens, weisen eine Milch koagulierende Aktivität auf. Peptidasen von bakteriellem Ursprung werden in der britischen Patentschrift Nr. 565 788 beschrieben. Da jedoch diese Peptidasen eine zu starke proteolytische Aktivität haben und eine relativ geringe Milch koagulierende Wirkung besitzen, konnten sie keine praktische Verwendung als Milch koagulierende Enzyme finden.
Eine grosse Anzahl von Versuchen wurde unternommen, um ein Ersatzmaterial für Lab zu finden, wobei hiefür beispielsweise Enzyme verwendet wurden, die aus dem Pilz Endothia parasitica gewonnen werden, wie dies von Sardinas in den USA-Patentschrift Nr. 3 275453 beschrieben wird. Auch das Enzym, das aus dem Pilz Mucor pusillus Lindt gewonnen wird, wurde als Ersatzmaterial für Lab herangezogen, wie dies von Arima et al, in den USA-Patentschriften Nr. 3 151 039 und Nr. 3 212 905 beschrieben ist. Das Enzym, das aus Endothia parasitica gewonnen wird, weist jedoch den Nachteil auf, dass der Pilz Endothia parasitica ein Pflanzenpathogener Pilz ist.
Das Enzym, das aus dem Pilz Mucor pusillus Lindt gewonnen wird, dürfte den Nachteil haben, dass es einen Käse liefert, der eine pfropfenartige Konsistenz besitzt, so dass eine lange Reifungszeit notwendig ist, damit die übliche Geschmacksentwicklung eintritt.
Durch eine Untersuchung der Eigenschaften verschiedener Peptidasen bezüglich Milch wurde gefunden, dass manche Peptidasen eine maximale Aktivität bezüglich des Caseins bei einem pH-Wert von etwa 7 besitzen, dass sie jedoch bei einem pH-Bereich von etwa 7 + 1,5 abgerahmte Milch leicht koagulieren. Derartige Peptidasen werden in der Folge neutrale Peptidasen genannt. Die Milch, die bei diesem Test und allen folgenden Koagulierungstests verwendet wurde, wurde mit Hilfe von Milchsäure auf einen pH-Wert von 6,5 angesäuert und bei 36C belassen. Das von den neutralen Peptidasen gebildete Koagulat wurde mit einem derartigen verglichen, das durch Lab hergestellt war, und es stellte sich heraus, dass es weicher und fahler war und eine schwächere gummiartige Bindung oder Textur aufwies.
Die Tatsache, dass das Produkt fahler ist, weist darauf hin, dass viele feine Quarkteilchen anwesend waren. Gewisse andere Peptidasen, die in der Folge saure Peptidasen genannt werden, weisen maximale Aktivität peaks gegen über Hemoglobin in einem mittelsauren Bereich eines pH-Wertes von 4,0 i 2,0 auf, jedoch waren sie nicht in der Lage Milch zu koagulieren. Es wurde jedoch gefunden, dass falls derartige saure Peptidasen mit neutralen Peptidasen kombiniert wurden, und diese Mischung der Milch zugegeben wurde, das erhaltene Koagulat eine bessere Gesamtqualität aufwies, als ein solches, das erhalten wurde, wenn neutrale Peptidasen alleine verwendet wurden.
Eine dritte Gruppe von Peptidasen, die in der Folge alkalische Peptidasen genannt wird, weist eine maximale Aktivität gegenüber Casein im pH-Bereich von 8,5 + 1,0 atif. Diese alkalischen Peptidasen wurden auch beim Studium der Milchkoagulation geprüft. Es wurde beobachtet, dass für den Fall, dass ein derartiges Enzym alleine verwendet wurde oder in Kombination mit einer neutralen Peptidase oder in Kombination mit einer neutralen und einer sauren Peptidase verwendet wurde, sich ein Koagulat bildete, das eine besonders schlechte Gesamtqualität aufwies, im Vergleich zu einem Koagulat, das mit Hilfe von Lab hergestellt worden ist.
Es war daher anzunehmen, dass ein Enzymsystem, das saure Peptidasen und neutrale Peptidasen enthält, wobei nur sehr geringe Mengen oder überhaupt keine alkalischen Peptidasen anwesend sind, als Ersatzprodukt für Lab mit Erfolg verwendet werden kann.
Die Gesamtbindung oder die Gesamtkonsistenz des aus der Milch hergestellten Koagulats, d.h. die Glätte, die Härte und der gummiartige Charakter, ist für den Fachmann auf dem Gebiete der Käseherstellung leicht festzustellen. Eine derartige Bewertung liefert jedoch nur geringe, falls überhaupt irgendwelche, quantitativen Werte für eine Vergleichsarbeit. Um Vergleichswerte erhalten zu können, wurde das folgende Prüfverfahren für das Koagulierungsprodukt, d.h. für den Quark, entworfen:
Eine festgesetzte Menge an Milch wurde in der vorhin beschriebenen Weise vorbehandelt und mit einem Enzympräparat zum Koagulieren gebracht. Das Koagulat wurde zerschnitten und man liess das Zusammenballen nocil 30 Minuten lang fortschreiten.
Die gesamte Masse aus Molke und Quark wurde dann 10 Minuten lang zentrifugiert, wobei bei dem Zentrifugieren ein Schwerefeld von 1225 g herrschte. Nach dem Zentrifugieren wurde der Quarkpfropfen einem Penetrationstest unterworfen. Für diesen Test wurde ein Penetrometer (Precision Scientific Co.-ASTM Bezeichnung D 217) herangezogen und ein Penetrationskegel eines Viertels der Grösse (ASTM Bestimmung D 1403) wurde verwendet. Eine Standard Penetrationszeit von 5 Sekunden wurde während aller dieser Tests eingehalten. Der mit Hilfe von Lab gewonnene Quark und die Quarkarten, die dem mit Hilfe von Lab gewonnenen ähnlich waren, zeigten eine minimale Penetration, die durch die Millimeter der tatsächlichen Penetration veranschaulicht wird.
Typische Penetrationswerte für Quarkarten, die mit Hilfe von verschiedenen koagulierenden Präparaten erhalten wurden, werden in der Tabelle I angegeben, wobei in dieser Tabelle auch käuflich erhältliche koagulierende Präparate enthalten sind.
TABELLE 1 Enzympräparat Penetration Lab 3,5 mm Pepsin 3,5 mm Trypsin 7,0 mm käuflich erhältliche neutrale Peptidasen 5,4 mm käuflich erhältliche neutrale + käuflich erhältliche saure Peptidasen 4,5 mm käuflich erhältliche neutrale + käuflich erhältliche saure + käuflich erhältliche alkalische Peptidasen 5,8 mm käuflich erhältliche alkalische Peptidasen 6,2 mm
Sodann wurde Bacillus subtilis in einem Weizenkleie Kalziumchloridmedium gezüchtet und das geklärte Filtrat des Züchtungsmediums wurde auf Peptidase Komponenten geprüft. Das Prüfverfahren war eine Abwandlung des Anson Verfahrens, das von Husain & McDonald im Can. J. Microbiol. 4 Seiten 237 bis 242 (1958) beschrieben wird, wobei als Substrate vitaminfreies Casein und standardisiertes Haemoglobin (Nutritional Biochemicals Corp.) verwendet wurden.
Das Verfahren wurde ferner dadurch modifiziert, dass man im sauren Bereich (Haemoglobin) Succinat-Puffer verwendete und im neutralen und alkalischen Bereich (Caseinbereich) Tris-maleinsaure-Puffer anwandte. Die Prüfung auf neutrale Peptidasen in Anwesenheit von alkalischen Peptidasen wurde dadurch vorgenommen, dass man die alkalischen Peptidasen mit einem Kartoffelinhibitor hemmte, wobei der Inhibitor nach dem Verfahren extrahiert wurde, das von Watanabe in Nippon Nogei-Kagaku Kaishi, 32 Seiten 260 bis 262 (1958) beschrieben wurde.
Die Aktivität der neutralen Peptidasen wurde durch eine Chelatbildung mit Äthylendiamintetraessigsäure gehemmt und dadurch wurden die gegen das Chelierungsmittel unempfindlichen alkalischen Peptidasen gemessen.
Die Prüfmethoden zeigten, dass das Hydrat des Kulturmediums mindestens zwei Peptidasen enthielt, die normalerweise mit dem Wachstum des Bacillus subtilis verbunden sind, nämlich eine alkalische Peptidase und eine neutrale Peptidase. Zusätzlich zu diesen üblicherweise enthaltenen Peptidasen wurde festgestellt, dass auch saure Peptidase anwesend war, die in mittelsaurem Bereich einen Peak der maximalen Aktivität aufwies. Es zeigte sich, dass die saure Peptidase bezüglich ihrer Aktivität und Stabilität von den zweiwertigen Kationen, insbesondere von Kalzium und Zink abhängig war. Sie konnte leicht durch Chelierungsmittel gehemmt werden.
Dieses Enzym konnte nur nachgewiesen werden, wenn bei dem Prüfverfahren auf Peptidase niedrig absondernde Puffer verwendet wurden. Die Anwesenheit von drei Peptidasen in dem aus der Kultur gewonnenen Filtrat konnte sowohl durch Elektrophorese auf Celluloseacetat als auch durch Plattenelektrophoresis nachgewiesen werden.
Unter Zugrundelegung der vorher gefundenen Tatsache, dass die Gesamtqualität des Milchkoagulierungsproduktes, das unter Verwendung von käuflichen Peptidasen gewonnen wird, dadurch verbessert werden kann, wenn nur saure Peptidasen und neutrale Peptidasen anwesend waren, wurde ein neues Enzympräparat entwickelt.
Gegenstand der Erfindung ist eine von Bakterien hergestellte Peptidase-Enzymmischung, die eine hohe Milch koagulierende Aktivität und eine geringe proteolytische Aktivität besitzt, und sich dadurch auszeichnet, dass die Enzymmischung eine saure Peptidase und eine neutrale Peptidase enthält, und im wesentlichen frei von alkalischer Peptidase ist
Eine bevorzugte erfindungsgemässe Enzymmischung ist die von Bakterien der Klasse Bacillus, beispielsweise einem Stamm der Species Bacillus subtilis, stammende Enzymmischung. In der Mischung liegt das Verhältnis von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase vorzugsweise im Bereich von etwa 1: 0,5 bis etwa 1: 5,0, insbesondere im Bereich zwischen etwa 1: 2,0 bis etwa
1: 3,0. Die Enzymmischung kann Ionen von mindestens einem zweiwertigen Metall enthalten.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Enzymmischung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Medium, das Kohlehydrate liefernde Verbindungen, stickstoffhaltige Materialien, essentielle Nährstoffe und anorganische Salze enthält, mit einem Bakterium beimpft, das in der Lage ist, mindestens saure Peptidase und neutrale Peptidase zu liefern, und die bei der Züchtung gebildeten Enzyme anschliessend extrahiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemässen Enzymmischung zur Herstellung von Käse, die sich dadurch auszeichnet, dass man die Koagulierung der Milch durch die Zugabe der Enzymmischung durchführt. Die Enzymmischung kann beispielsweise zur Herstellung von Cheddarkäse verwendet werden.
Bei der Herstellung der erfindungsgemässen Enzymmischung können die alkalischen Peptidasen dadurch entfernt werden, dass man das Filtrat durch ein kationisches Adsorbens in einer lonenaustauschersäule durchlaufen lässt, wobei die negativ geladene alkalische Peptidase von den positiv geladenen sauren Peptidasen sowie von den neutralen Peptidasen getrennt wurde. Die so erhaltene Enzymmischung enthielt saure Peptidasen und neutrale Peptidasen und anorganische Ionen und wurde für die Studien der Koagulation herangezogen. Es wurde gefunden, dass der so hergestellte Quark einen Penetrationswert von 3,5 mm aufwies, der der gleiche war, wie der in Tabelle I angegebene Penetrationswert eines Quarks, der unter Verwendung von Lab gewonnen wurde.
Aus dem mit Hilfe dieses Enzymkomplexes gewonnenen Produkt wurde Käse hergestellt und es wurde gefunden, dass die dabei erhaltenen Käse in vorteilhafter Weise mit Cheddar-Käse vergleichbar waren, der unter Verwendung von Lab hergestellt wurde, wobei das Produkt sowohl am Anfang als auch nach den normalen Reifungszeiten vergleichbar war.
Die erfindungsgemässe Enzymmischung ist ein sehr zufriedenstellendes Ersatzmaterial für Lab.
Eine besonders geeignete erfindungsgemässe Enzymmischung kann erhalten werden indem man den Bacillus subtilis anwendet, der etwa 2 bis 3 Teile neutrale Peptidase pro Teile saure Peptidase liefert Wenn diese Enzymmischung zur Koagulierung von Milch verwendet wird, dann hat es sich gezeigt, dass das dabei erhaltene Koagulat im Vergleich zu allen anderen getesteten Materialien überlegen war, und dass der dabei erhaltene Käse eine ausgezeichnete Qualität aufwies und die Ausbeute gut war und dass ausserdem der Käse keine Neigung zeigte, sich zu verschlechtern oder bitter zu werden, wenn er älter wurde. Es zeigte sich auch, dass es vorteilhaft ist, bestimmte anorganische Ionen dem Enzymkomplex zuzufügen. Zu diesen anorganischen Ionen gehören beispielsweise Magnesium, Mangan, Kalium, Kalzium, Zink und Natrium.
Die erfindungsgemässe Enzymmischung kann aus jeder beliebigen Milch koagulierenden Enzymmischung bakteriellen Ursprungs erhalten werden, die mindestens eine saure und mindestens eine neutrale Peptidase enthält. Eine derartige Enzymmischung kann auch eine unschädliche alkalische Peptidase enthalten, ansonsten muss jedoch eine alkalische Peptidase im wesentlichen entfernt, gehemmt oder inaktiviert werden, so dass sie bei der Herstellung von Käse eine vernachlässigbare Aktivität aufweist.
Verschiedene Verfahren stehen zur Verfügung, um alkalische Peptidasen zu entfernen, zu hemmen oder zu inaktivieren. Eine alkalische Peptidase kann beispielsweise gehemmt werden, indem man einen geeigneten Inhibitor zusetzt, beispielsweise einen Inhibitor der aus Kartoffeln extrahiert wird. Es ist möglich alkalische Peptidasen mit Hilfe eines thermischen Denaturierungsverfahrens zu hemmen, denn die sauren und neutralen Peptidasen weisen eine grössere thermische Stabilität auf, als die alkalischen Peptidasen. Ferner ist es möglich, die alkalischen Peptidasen nach bekannten Verfahren zu entfernen, beispielsweise durch Fällung oder durch Fraktionieren. Ein besonders geeignetes Arbeitsverfahren besteht darin, dass man die alkalischen Peptidasen nach einer Ionenaustauschchromatographie entfernt.
Diese Arbeitsweise wird durch die Tatsache erleichtert, dass die alkalischen Peptidasen insgesamt eine negative Ladung aufweisen, während die sauren und neutralen Basen jeweils eine positive Gesamtladung besitzen.
Das Medium, das zur Züchtung der Bakterien nach dem erfindungsgemässen Verfahren dient, kann jedes geeignete natürliche oder künstliche Medium sein, vorausgesetzt, dass es ein Material enthält, das Kohlenstoff liefert, sowie ein Material das Stickstoff liefert und ausserdem anorganische Salze enthält. Das Material, das Kohlenstoff liefert, kann beispielsweise jedes beliebige Monosaccharid, Disaccharid oder Polysaccharid sein, das von den Bakterien assimiliert wird, wie z.B. Glykose, Fructose, Rohrzucker, Rübenzucker, Lactose und Stärke. Eine grosse Vielzahl an assimilierbaren stickstoffhaltigen Materialien kann verwendet werden, wie z.B.
anorganische Ammoniumsalze, Aminosäuren und eine grosse Anzahl an Protein liefernden Substanzen. Als Beispiele für anorganische Salze seien Magnesiumsalze, Kalziumsalze, Mangansalze und verschiedene Phosphate genannt. Ein besonders geeignetes Medium zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens ist ein solches, das einen geringen Gehalt an abbaubaren Stickstoffverbindungen und Kohlenhydraten aufweist, beispielsweise ein Medium, das nicht mehr als etwa 4% (Gew. -% pro Vol.) insgesamt an Weizenkleie während der Fermentation enthält.
Das Verhältnis an saurer Peptidase zu neutraler Peptidase kann nach einer grossen Anzahl von verschiedenen Verfahren eingestellt werden, und zwar sowohl vor als auch während der Bildung des Enzymkomplexes in dem Kulturmedium, und dieses Verhältnis kann auch dann eingeregelt werden, nachdem sich der Enzymkomplex gebildet hat. Derartige Verfahren zur Änderung des Verhältnisses an saurer Peptidase zu neutraler Peptidase können beispielsweise eine Verändung der Züchtungsbedingungen umfassen, beispielsweise eine Veränderung der Luftmenge, eine Änderung des Rührverfahrens im Gärbehälter und ferner auch eine Fällung oder eine Fraktionierung des aus der Kultur gewonnenen Filtrats und auch andere bekannte Arbeitsverfahren sind anwendbar.
Es zeigte sich, dass für den Fall, dass Bacillus subtilis in einem Medium, das Weizenkleie und Kalziumchlorid enthielt, gezüchtet wurde, sowohl saure Peptidase als auch neutrale Peptidase als auch alkalische Peptidase in dem Filtrat des Kulturmediums enthalten waren, dass aber die Menge an saurer Peptidase im Vergleich zur Menge an neutraler Peptidase etwas geringer war, als diejenige, die zur Bildung eines Quarks einer hohen Qualität erforderlich war. Ausgedehnte Studien bezüglich des Nährmediums zeigten, dass für den Fall, dass als Stickstoff liefernde Verbindung die Aminosäure N-Leuein dem Kulturmedium vor der Züchtung zugesetzt wurde, der Anteil an saurer Peptidase in dem aus dem Zuchtmedium gewonnenen Filtrat erhöht wurde, während der Anteil an neutraler Peptidase und ebenso der Anteil an alkalischer Peptidase vermindert wurde.
Ein bereits beschriebenes Verfahren zur Einstellung des Verhältnisses an saurer Peptidase zu neutraler Peptidase in der Brühe wird durch die Ionenaustauschchromatographie geliefert, denn die Elutionsgeschwindigkeiten der beiden Enzyme sind verschieden, wenn sie aus dem Absorptionsmittel auseluiert werden. Ferner kann eine Einregelung des Verhältnisses an saurer Peptidase zu neutraler Peptidase bei einem Enzymkomplex erreicht werden, nachdem alkalische Peptidase durch differentielle thermische Denaturierung entfernt wurde, denn die thermische Stabilität der sauren Peptidase ist grösser als diejenige der neutralen Peptidase. Es können auch andere bekannte Verfahren zur Behandlung von Enzymen angewandt werden.
Überraschenderweise wurde auch gefunden, dass bei einer Züchtung einer asporischen Mutante eines Bakteriums der Klasse Bacillus in einem Nährmedium, das ein Kohlenstoff-haltiges Material, ein Stickstoff-lieferndes Material und anorganische Salze enthält, saure und neutrale Peptidasen selektiv gezüchtet werden, wobei im wesentlichen alkalische Peptidasen ausgeschlossen werden, und dass die Ausbeute an sauren und neutralen Peptidasen sehr stark, im Vergleich zu den Mengen, die nach bisher bekannten Verfahren erhalten wurden, erhöht ist. Wenn ausserdem das Medium an L-Leucin angereichert ist, dann werden die sauren und neutralen Peptidasen direkt in einem Verhältnis erhalten, das bei einer Vernvendung in der Käseproduktion überaus vorteilhaft ist.
Gemäss dieser Ausführungsform ist es möglich, saure und neutrale Peptidase herzustellen, ohne dass es erforderlich ist, dass man entweder das Verhältnis an sauren zu neutralen Peptidasen verschiebt und ohne dass es notwendig ist, alkalische Peptidasen zu entfernen, zu blockieren oder unwirksam zu machen. Diese Vorteile stellen zusammen mit der erhöhten Ausbeute an sauren und neutralen Peptidasen einen sehr wesentlichen technischen Vorteil dar.
Das L-Leucin kann dem Kulturmedium in reiner Form oder in Form eines Racemats zugesetzt werden oder auch in Form eines geeigneten Nährmediums, das L-Leucin enthält. Die Menge an L-Leucin, die dem Medium zugesetzt wird, kann über einen weiten Bereich variiert werden, es wurde jedoch gefunden, dass 0,01 Gew.-% an L-Leucin, bezogen auf das Volumen des Nährmediums, die optimale Menge darstellen, die zu einer besonders guten Einstellung des Verhältnisses an saurer Peptidase zu neutraler Peptidase zugesetzt wird.
Man sieht jedoch, dass das L-Leucin nur dann notwendig ist, wenn eine Einstellung des Verhältnisses von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase notwendig ist.
Asporische Mutanten, die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendbar sind, können nach einer grossen Anzahl von bekannten Arbeitsverfahren erhalten werden.
Die asporischen Mutanten des Bacillus subtilis wurden leicht aus einem Grundstamm des Bacillus subtilis erhalten, indem man als mutierende Mittel ultraviolettes Licht oder neutrales Acriflavin verwendete.
Ein typisches Verfahren zur Herstellung von Cheddarkäse umfasst die folgenden Arbeitsschritte:
1. Ein Ansatz aus pasteurisierter oder unpasteurisierter Vollmilch wird bei einer Temperatur von 30 bis 320C gehalten und mit einer oder mehreren Arten an Milchsäure bildenden Bakterien geimpft, beispielsweise Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus acidophilus, Streptococcus thermophilus und Lactobacillus acidophilis.
Man lässt die Organismen in der Milch etwa 30 bis 60 Minuten lang wachsen, wodurch man eine Erhöhung der Acidität erreicht. Diese Erhöhung der Milchacidität beträgt normalerweise etwa 0,01 bis 0,02%, wenn die Acidität als titrierbare Acidität gemessen wird.
2. Nachdem das gewünschte Ansteigen der Acidität erreicht wurde, wird ein Milch koagulierendes Mittel, beispielsweise tierisches Lab, in die Milch eingerührt und dann lässt man das Ganze ohne Rühren etwa 30 Minuten lang stehen. Das Koagulieren wird gewöhnlich bei einer Temperatur von etwa 31 0C durchgeführt und es bildet sich dabei ein gelartiges Koagulat.
3. Sobald das Koagulat das gewünschte Ausmass an Festigkeit erreicht hat, wird es in kleine Würfel zerschnitten, die etwa eine Seitenlänge von 4,6 mm oder 9,5 mm aufweisen.
4. Dann werden der Quark und die Molke gerührt und auf eine Temperatur von etwa 39 bis 400C erhitzt.
Diese sogenannte Kochzeit benötigt normalerweise etwa 30 Minuten.
5. Der Quark und die Molke werden dann noch etwa 45 bis 65 Minuten lang kontinuierlich gerührt, während sie bei einer erhöhten Temperatur gehalten werden.
Während dieses Zeitraumes, der in der Folge als < (Halte- stadium bezeichnet wird, beeinflussen die erhöhte Temperatur, die ansteigende Acidität und das Koagulierungsmittel in Kombination miteinander die Verfestigung und das Trocknen der Quarkteilchen und die Absonderung der Molke aus diesen Teilchen.
6. Sobald die Quarkteilchen das gewünschte Ausmass an Festigkeit und Trockenheit erreicht haben, wird die Acidität auf etwa 0,02 bis 0,03% erhöht und man lässt den Quark absetzen und die Molke wird aus dem Behälter abgezogen.
Der gesamte Zeitraum zwischen der Absitzzeit und der Abstechzeit (Zeit des Abziehens) beträgt etwa 21/2 Stunden. Die charakteristischen Endschritte für die Herstellung des Cheddaring Käses werden dann angeschlossen.
Wenn Cheddar Käse nach üblichen Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemässen Peptidasekomplexes als Koagulierungsmittel hergestellt werden, dann zeigte es sich, dass die dabei erhaltenen Käse einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 36,5 bis 38,5% besitzen.
Der Feuchtigkeitsgehalt ist ein sehr wichtiger Index für die Qualität des Cheddar Käses und er wird vorzugsweise bei etwa 35% gehalten. Wenn der Feuchtigkeitsgehalt höher ist, dann werden Käse erhalten, die einen zu schwachen Körper haben und die sich verfärben und schlechten Geruch entwickeln. Daher war es notwendig ein Verfahren zu finden, das es gestattet, den Feuchtigkeitsgehalt des fertigen Käses herabzusetzen.
Wenn der Peptidasekomplex zur Herstellung von Käse verwendet wird, dann bewirkt die neutrale Peptidase in erster Linie das Koagulieren der Milch, während die saure Peptidase in erster Linie für die Verfestigung und das Trocknen des Quarkes verantwortlich ist. Es wurden Studien bezüglich der Faktoren unternommen, die die Aktivität der neutralen und sauren Peptidasen beeinflussen, und es zeigte sich, dass die zwei Peptidasen bei verschiedenen Temperaturen maximale Enzymaktivitäten besitzen. Es zeigte sich so, dass die neutrale Peptidase das Maximum der Aktivität bei 460C besitzt, während die saure Peptidase das Maximum der Aktivität bei etwa 540C besitzt.
Es wurde auch gefunden, dass, auf Grund der Unterschiede in den von der Wärme abhängigen Aktivitätseigenschaften der beiden Peptidasen, ein Temperaturanstieg von 390C auf 430C eine Aktivierung der sauren Peptidase (des verfestigenden Enzyms) von über 30% hervorrief, während die neutrale Peptidase (das koagulierende Enzym) bei diesem Temperaturanstieg um weniger als 5% aktiviert wurde.
Man stellte jedoch fest, dass bei der Herstellung von Cheddar Käse unter Verwendung eines koagulierenden Enzymkomplexes als Gerinnungsmittel der Feuchtigkeitsgehalt des Käses herabgesetzt werden kann, indem man einen Hitzeschock während einer kurzen Zeit während des Haltestadiums anwendet. Die Temperatur des Quarks wird während der kurz dauernden Anwendung der zusätzlichen Hitze (Hitzeschock) auf etwa 40,5 bis 460C erhöht.
Während der Anwendung der kurz dauernden zusätzlichen Hitze soll die Temperatur von der normalen Haltetemperatur ausgehend so rasch wie möglich erhöht werden, und bei dieser erhöhten Temperatur eine kurze Zeit belassen werden, die ausreichend ist, um den ganzen Vorgang anzuregen, und dann soll, je nach den verwendeten Starterorganismen, die Temperatur rasch auf die normale Haltetemperatur abgekühlt werden. Die erhöhte Temperatur liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 42 bis 440C und sie wird vorzugsweise während eines Zeitraumes von nicht mehr als etwa 15 Minuten eingehalten. Üblicherweise wird die erhöhte Temperatur während einer Zeit von etwa 1 bis 10 Minuten aufrecht erhalten.
Besonders gute Resultate wurden erzielt, wenn eine erhöhte Temperatur von etwa 430C während einer Zeit von etwa 3 Minuten aufrechterhalten wurde. Einer der Hauptpunkte, die beachtet werden müssen, wenn man kurzzeitig zusätzliche Hitze anwendet, ist derjenige, dass die Temperatur des Ansatzes auf die gewünschte Temperatur gebracht und dann wieder auf die normale Temperatur gebracht werden soll, damit das gewünschte Ausmass der Anregung des ganzen Vorganges mit einem möglichst geringen Aufwand an Hitze erreicht wird, denn hiedurch wird die durch Hitze hervorgerufene Inaktivierung der Milchsäure produzierenden Bakterien auf ein Minimum herabgesetzt.
Die kurzdauernde Einwirkung von zusätzlicher Hitze wird vorzugsweise während der ersten 15 Minuten des Haltestadiums durchgeführt, nachdem der Ansatz die maximale Kochtemperatur erreicht hat. Jedoch hängt die Auswahl der tatsächlichen Zeit, während der im Verlaufe des Haltestadiums die Anwendung der kurzdauernden zusätzlichen Hitze erfolgt, sehr stark von der Grösse des Behälters, der Grösse und der Aufnahmefähigkeit der Vorrichtung und von weiteren Verfahrensbedingungen ab.
Die Erfindung soll nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert werden, wobei jedoch darauf hingewiesen wird, dass diese lediglich zu einer Erläuterung des Erfindungsgedankens dienen sollen und dass beliebige Variationen bezüglich der angewandten Bakterien, bezüglich der Zusammensetzung des Mediums und bezüglich anderer Verfahrensbedingungen durchgeführt werden können.
Beispiel I
Herstellung des Filtrats des Zuchtmediums. Es wurde ein Impfmedium des Bacillus subtilis hergestellt, indem man den Organismus von einer Agarkultur in ein steriles beimpfbares Medium brachte, das ein Produkt war, das vom Baltimore Biological Laboratory unter dem Handelsnamen < sTrypticase Soy Brot (3,0 Gew.-% pro Vol.) hergestellt wird, und dieses Medium wurde mit 0,01 Gew.-% pro Vol. an Kalziumchlorid verstärkt und mit Hilfe von 1,0 normaler HC1 auf einen pH-Wert von 6,2 gebracht. Das für die Impfung dienende Medium wurde hergestellt, indem man 100 ml davon in 300-ml Erlenmeyer-Kolben gab. Das beimpfte Medium wurde auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung geschüttelt (5,1 cm Schüttellänge bei 125 Umdrehungen pro Minute) und diese Behandlung wurde währen 12 Stunden bei 360C ausgeführt.
Nach dieser Inkubationszeit wurde das Impfmedium auf 2shciger Basis (2 Vol.-% pro Volumen) verwendet, um das zur Herstellung des Filtrats dienende Medium zu beimpfen.
Das zur Herstellung des Filtrats dienende Medium wurde erhalten, indem man die wasserextrahierbaren Nährstoffe der Weizenkleie verwendete. Für die Herstellung dieses Extraktes wurde ein Brei von 3 Gew.-% pro Vol. an Weizenkleie und Wasser unter Druck bei einer Temperatur von 1200C 45 Minuten lang erhitzt. Dann liess man diese Mischung abkühlen und nach dem Absitzenlassen wurde die klare überstehende Flüssigkeit abgezogen und mit Kalziumchlorid (0,01 Gew.-O/, pro Vol.) verstärkt. Das Medium wurde mit Hilfe von 1,0 normaler Salzsäure eingestellt, so dass nach der Sterilisierung der endgültige pH-Wert 6,2 + 0,1 betrug.
Das beimpfte zur Herstellung dienende Medium wurde bei 360C behalten und mit 300 Umdrehungen pro Minute in einen mit Tauchwänden versehenen Gärbehälter, der ein Arbeitsvolumen von 5,0 Litern besass, gerührt. Sterile Luft wurde in einer Geschwindigkeit von 2 Litern pro Minute zugeführt und ein übliches flüssiges Antischaummittel wurde zur Unterdrückung der Schaumbildung angewandt. Die Züchtung wurde in dem System so lange vorgenommen, bis der maximale Gehalt an Enzymaktivität erreicht war, der mit Hilfe eines Milchkoagulierungstests bestimmt wurde und diese Wachstumsperiode betrug im allgemeinen 12 + 1 Stunden.
Die nach der Züchtung erhaltene Brühe wurde dann durch Zentrifugieren geklärt und/oder filtriert und es stellte sich heraus, dass sie 2000 Einheiten an saurer Peptidase, 4740 Einheiten an neutraler Peptidase und 1308 Einheiten an alkalischer Peptidase, jeweils pro ml der Brühe, enthielt.
Beispiel 2
Herstellung des Filtrats des Kulturmediums
Eine Einimpfung des Bacillus subtilis wurde hergestellt, indem man den Organismus aus einer Agarkultur in ein steriles Impfmedium der eTrypticase Soy Brot (3,0 Gew.-% pro Vol.) übertrug, die mit Hilfe von 0,01 Gew.-% pro Volumen an Kalziumchlorid und 0.01 Gew.-% pro Volumen an L-Leucin verstärkt war.
Dieses Medium wurde durch die Zugabe von 1,0 normaler Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,2 gebracht. Das Impfmedium wurde hergestellt, indem man 100 ml dieses Mediums in 300-ml-Erlenmeyer Kolben abfüllte. Das geimpfte Medium wurde auf einer rotierenden Schüttelmaschine (5,1 cm Schüttelweite bei 125 Umdrehungen pro Minute) während einer Zeit von 12 Stunden bei 360C geschüttelt und nach dieser Inkubationszeit wurde das Impfmedium auf Basis von 2 Gew.-gO pro Volumen dazu verwendet, um das Medium, das zur Herstellung des Kulturmediumfiltrates dient, zu beimpfen.
Das zur Herstellung dienende Medium wurde erhalten, indem man die mit Wasser extrahierbaren Nährstoffe der Weizenkleie verwendete. Zur Herstellung dieses Mediums wurde ein 3 Gew.-% pro Volumen enthaltender Brei der Weizenkleie und Wasser unter Druck bei 1200C 45 Minuten lang erhitzt. Die Mischung wurde dann abgekühlt und man liess sie absetzen und das klare überstehende Produkt wurde abgezogen und mit 0,01 Gew.-% pro Volumen an Kalziumchlorid und 0,01 Gew.-% pro Volumen an L-Leucin verstärkt. Das Medium wurde mit 0,1 normaler Salzsäure versetzt, so dass nach der Sterilisierung der endgültige pH-Wert 6,2 1, 0,1 betrug.
Das beimpfte zur Herstellung der Peptidasen dienende Medium wurde bei 360C gehalten und in einem mit Tauchwänden versehenen Gärbehälter mit 300 Umdrehungen pro Minute gerührt, wobei der Gärbehälter ein Arbeitsvolumen von 5,0 Litern besass. Sterile Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von 2 Litern pro Minute zugesetzt und ein normales Antischaummittel wurde verwendet, um die Schaumbildung zu unterdrücken. Das System wurde diesen Züchtungsbedingungen so lange unterworfen bis die maximale Enzymaktivität erreicht wurde, die mit Hilfe von Milchkoagulationstests bestimmt wurde. Diese Züchtungszeit betrug im allgemeinen 12 + 1 Stunden.
Das Zuchtmedium wurde dann durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren geklärt und es wurde gefunden, dass es 2300 Einheiten an saurer Peptidase, 4140 Einheiten an neutraler Peptidase und 987 Einheiten an alkalischer Peptidase, jeweils pro ml der Brühe, enthielt.
Beispiel 3
Herstellung des Filtrats des Züchtungsmediums
Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde angewandt, es wurde jedoch ein anderes Medium für die Impfung verwendet. Dieses andere Beimpfungsmedium enthielt 2,0 Gew.-% pro Vol. eines Caseinpräparates, das bei der Delmar Chemical Ltd. unter dem Handelsnamen Totamin erhältlich ist, sowie 0,01 Gew.-% pro Volumen an Kalziumchlorid und 0,10 Gew.-% pro Volumen an primärem Kaliumphosphat. Nach dem Sterilisieren betrug der schliesslich erreichte pH-Wert 6,10 t 0,1.
Alle anderen Verfahrensschritte des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens wurden unverändert wiederholt und die geklärte Brühe des Zuchtmediums war im wesentlichen gleich derjenigen, die nach Beispiel 2 herge-- stellt wurde.
Beispiel 4
Herstellung des Filtrates des Züchtungsmediums
Die in Beispiel 2 bzw. Beispiel 3 beschriebene Arbeitsweise wurde eingehalten, mit Ausnahme dessen, dass das zur Herstellung der Peptidasen dienende Medium so modifiziert wurde, dass gesamte Weizenkleie, und nicht ein Weizenkleieextrakt in einer Menge von 1,25 Gew.-% Weizenkleie pro Volumen direkt in den Gärbehälter gegeben wurde. Dadurch konnte der Erhitzungsschritt, der zur Extraktion der wasserlöslichen Nährstoffe der Weizenkleie notwendig war, vermieden werden. Alle anderen Bestandteile des zur Herstellung dienenden Mediums blieben unverändert. Die geklärte Brühe des Kulturmediums war im wesentlichen die gleiche wie diejenige, die bei der Verfahrensweise nach Beispiel 2 erhalten wurde.
Beispiel 5
Herstellung des Filtrats des Zuchtmediums
Die Arbeitsweise, die in den Beispielen 2, 3 bzw. 4 beschrieben wurde, wurde eingehalten, mit der Ausnahme dessen, dass das zur Herstellung der Peptidasen dienende Medium so modifiziert wurde, dass die Aminosäure L-Leucin weggelassen wurde und dass anstelle dieser Aminosäure Totamin in einer Menge von 0,25 Gew.-% pro Volumen verwendet wurde. Alle anderen Bestandteile des zur Herstellung der Peptidasen dienenden Mediums blieben unverändert. Die geklärte Brühe des Kulturmediums war im wesentlichen die gleiche, wie die, die nach Beispiel 2 erhalten wurde.
Beispiel 6
Herstellung des Filtrats des Züchtungsmediums
Das in den Beispielen 2, 3 bzw. 4 beschriebene Arbeitsverfahren wurde eingehalten, mit Ausnahme dessen, dass das zur Herstellung der Peptidasen dienende Medium so abgeändert wurde, dass die Aminosäure L Leucin weggelassen wurde und dass 0,25Gew.-% pro Volumen an Zein anstelle dieser Aminosäure verwendet wurde. Zein ist eine Proteinfraktion die aus Mais gewonnen wird. Alle anderen Bestandteile des zur Herstellung der Peptidasen dienenden Mediums wurden unverändert gelassen. Die geklärte Brühe des Züchtungsmediums war im wesentlichen die gleiche, wie diejenige, die nach Beispiel 2 erhalten wurde.
Beispiel 7
Herstellung des Filtrats des Züchtungsmediums
Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass das Züchtungsme dium modifiziert wurde, so dass die Weizenkleie weggelassen wurde und ein Reiskleiekonzentrat in einer Menge von 0,50 Gew.-% pro Volumen anstelle der Weizenkleie verwendet wurde. Diese Reiskleie war ein Produkt, das von der Charles Bowman and Company, Holland, Michigan, vertrieben wird. Alle anderen Bestandteile des Züchtungsmediums wurden unverändert gelassen, und die geklärte Brühe des Zuchtmediums war im wesentlichen die gleiche. wie diejenige, die nach Beispiel 2 hergestellt wurde.
Beispiel 8
Herstellung des Filtrats des Züchtungsmediums
Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit der Ausnahme dessen, dass der Stamm des Bacillus subtilis, der in Beispiel 3 verwendet wurde, durch Bacillus subtilis A.T.C.C. Nr. 465 ersetzt wurde.
Alle anderen Arbeitsweisen des Verfahrens zur Herstellung des Peptidasen enthaltenden Materials blieben unverändert und die geklärte Brühe des Zuchtmediums koagulierte Milch sofort. Es zeigte sich, dass diese Brühe sowohl alkalische Peptidase als auch neutrale Peptidase und saure Peptidase enthält.
Beispiel 9
Herstellung des Filtrats des Zuchtmediums
Die in Beispiel 3 beschriebene Arbeitsweise wurde wiederholt, mit der Ausnahme dessen, dass der in Beispiel 3 verwendete Stamm des Bacillus subtilis durch den Bacillus subtilis A.T.C.C. Nr.6051 ersetzt wurde. Alle anderen Arbeitsweisen des Herstellungsverfahrens wurden unverändert beibehalten und die hiebei erhaltene geklärte Brühe des Züchtungsmediums koagulierte Milch sofort. Es zeigte sich, dass sie alkalische Peptidase, neutrale Peptidase und saure Peptidase enthält.
Beispiel 10
Herstellung des Filtrats des Züchtungsmediums
Die in Beispiel 3 beschriebene Arbeitsweise wurde eingehalten, mit Ausnahme dessen, dass der Stamm des Bacillus subtilis, der in Beispiel 3 verwendet wurde, durch einen Bacillus subtilis A.T.C.C. Nr. 12432 ersetzt wurde. Alle anderen Arbeitsweisen des Verfahrens wurden unverändert wiederholt und die dabei erhaltene geklärte Brühe des Zuchtmediums koagulierte Milch sofort. Es zeigte sich, dass sie alkalische Peptidase, neutrale Peptidase und saure Peptidase enthielt.
Beispiel 11
Herstellung des Endprodukts
Das Filtrat des Zuchtmediums wurde durch Zugabe von verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,9+ 0,2 gebracht und das spezifische Leitvermögen wurde auf 1800 i 100 Mikroohm eingestellt, indem man Natriumchlorid und ionenfreies Wasser zusetzte.
Das so eingestellte Filtrat wurde auf ein Ionen austauschendes Adsorbtionsmittel aufgebracht, vorzugsweise eine Säule eines kationischen Carboxymethylcellulose- äthers, der mit 2 X 10-4 molarer Zinkchloridlösung und 2 X 10-3 molarer Kalziumchloridlösung vorbehandelt wurde. Die vorbehandelte Säule wies bei 220C ein spezifisches Leitvermögen von 1800 + 100 Mikroohm auf und besass einen pH-Wert von 4,9 t 0,2. Die Zugabe des Zinkchlorids und des Kalziumchlorids erfolge deshalb, damit die Aktivitäten und Stabilitäten der Enzyme verbessert wurden.
Sowohl die saure Peptidase als auch die neutrale Peptidase wurde an der Cellulose adsorbiert, während negativ geladenes Material, inklusive irgendwelche verbleibende alkalische Peptidase und ungeladenes Material durch die Säule durchtrat. Etwa 2 Leervolumina des eingestellten Filtrats wurden durch die Säule durchlaufen gelassen und das Filtrat enthielt genügende Mengen an kationischem Material, damit die reaktiven Stellen an der Cellulose abgesättigt waren. Dann wurde die Säule mit angesäuertem Wasser, das einen pH-Wert von 4,9 + 0,2 aufwies und ein spezifisches Leitvermögen von 1800 + 100 Mikroohm besass, gewaschen. Durch diesen Reinigungsschritt wurde nicht adsorbiertes Material aus der Kolonne entfernt. Dann wurde eine zur Elution dienende Lösung, die eine 0,07 molare Natriumchloridlösung mit einem pH-Wert von 5,8 + 0,2 war, durch die Kolonne geschickt.
Die zuerst an der Kolonne gebundene saure Peptidase und die neutrale Peptidase wurden als klare Lösung gewonnen, die dann bei einer Temperatur von 370C und einem Druck von 736 mm konzentriert wurde. Die Endkonzentration wurde so gewählt, dass nach der Zugabe eines Enzym-Stabilisators und eines Hemmstoffes für Mikroben und ausserdem nach der Zugabe von Farbstoffen und Geschmack liefernden Mitteln eine Menge von 85,23 ml genügend Aktivität besass, um 424 kg Milch zu koagulieren.
Beispiel 12
Herstellung von asporischen Mutanten durch Ultra violettbestrahlung
Dieses Verfahren wurde in seinen wesentlichen Zügen von Takahashi im Journal of Bacteriology, 89, Seiten 294 bis 298 (1965) beschrieben. Beide Kulturen des ursprünglichen Stammes des Bacillus subtilis wurden aus Trypti- case Soy Brot gezüchtet, die mit 0,01 Gew.-% pro Volumen an Kalziumchlorid und 0,01 Gew.-% pro Volumen an L-Leucin verstärkt war. Nachdem man 12 Stunden lang gezüchtet hatte, wurden die Zellen durch Zentrifugieren aseptisch abgeschieden. Die so erhaltenen Bakterienpastillen wurden in sterilem destilliertem Wasser erneut suspendiert wobei etwa 1 X 1012 Zellen pro ml in der Suspension enthalten waren.
Gleiche Anteile an 5 mol dieser Suspension wurden in sterile Petri-Schalen gegeben. Die Petri-Schalen wurden dann in 15 cm Entfernung von einer 15 Watt Ultraviolettlichtquelle aufgestellt und einer Ultraviolettbestrahlung während einer Zeit von 30, 60 und 90 Sekunden unterworfen. Nach der Bestrahlung wurden die Proben 30 Minuten lang ins Dunkle gebracht und dann in Serie verdünnt. 0,5 ml Anteile der geeigneten Verdünnungen wurden dann auf Agarplatten gegeben, die das zur Beimpfung dienende Medium darstellten.
Dieser zur Gewinnung bzw. zur Beimpfung dienende Medium war der zur Versporung dienende Agar, der von Schaeffer in seiner Doktorarbeit im Jahre 1961 (Wissenschaftliche Abteilung der Universität Paris, Paris Frankreich) beschrieben wurde. Dieser Agar enthielt normalen Nähragar, der mit 0,025 Gew.-% pro Volumen MgSOi - 7H2O, 0,1 Gew.-% pro Volumen KCI und 0,125 Gew.-% pro Volumen MnCI2 4H1O verstärkt war. Der pH-Wert dieses Agarmediums wurde auf 7,0 eingestellt. Nachdem das Medium in einem Autoklaven bei 1200C 20 Minuten lang behandelt wurde, wurden FeSO4 (10-6 molare Endkonzentration) und CaC12 (5 X 10-4 molare Endkonzentration) aseptisch dem Medium zugesetzt.
Auf diesem Medium bildete sich ein Unterschied in der Färbung aus, wobei die sich versporenden Kolonien eine weisse Färbung aufwiesen, während die asporischen Mikroorganismen, d.h. die sich nicht versporenden Kolonien, eine braune Färbung aufwiesen. Durch dieses Verfahren wird eine rasche Methode zur Abtrennung der asporischen Mutanten geliefert.
Beispiel 13 Herstellzing der asporischen Mutanten durch Verwen dung von Neutral-Acriflavin
Diesem Verfahren wurde im wesentlichen so angewandt, wie es Rogolsky und Slepeckey in Biochem und Biophys Res. Comm 16 Seiten 204-208 (1964) beschrieben haben. Kulturen eines Elternstammes des Bacillus subtilis wurden 12 Stunden lang auf der bereits beschriebenen verstärkten Trypticase Soy Brot als Kultur medium gezüchtet. Aseptisch gewaschene Zellen derartiger Züchtungen wurden dazu verwendet, um ein modifiziertes Spizizen Minimalmedium zu beimpfen.
Dieses Spizizen Minimalmedium enthielt 1,4 Gew.-% pro Volumen an K2HPO4, 0,6 Gew.-% pro Volumen an KH2PO4, 0,2 Gew.-% pro Volumen an (NH)2SO4, 0,1 Gew.-% pro Volumen an CssHsNa307 2H2O, 0,02 Gew.-% pro Volumen an MgSO4 7H2O, 0,002% eines Hefeextraktes und 0,02% Pepton. Dieses Medium wurde auf einen pH-Wert von 7,6 gebracht und 20 Minuten lang bei einer Temperatur von 1 200C im Autoklaven behandelt. Nach dieser Behandlung im Autoklaven wurde sterile Glykose aseptisch zu diesem Medium zugegeben und zwar in einer solchen Menge, dass die Endkonzentration 0,5 Gew.-% pro Volumen betrug.
Zu den in dem oben beschriebenen Minimalmedium wachsenden Kulturen wurde während der logarithmischen Phase des Wachstums Neutralacriflavin zugegeben und die Endkonzentration an diesem die Mutierung hervorrufenden Mittel betrug 6,0 1g pro ml. Die Kolben wurden nach der Zugabe des Acriflavins 24 Stunden lang geschüttelt. Serienmässige Verdünnungen wurden dann durchgeführt und 0,5 ml geeigneter Verdünnungsmittel wurden dem Zuchtmedium zugesetzt. Die asporischen Mutanten wurden in der in Beispiel 12 beschriebenen Weise isoliert.
In Tabelle 3 werden die verschiedenen Peptidasen angeführt, die von typischen Stämmen gebildet wurden, wobei sowohl die Elternstämme als auch die asporischen Stämme des Bacillus subtilis in einem Medium gezüchtet wurden, das Weizenkleie und Kalziumchlorid enthielt.
Tabelle 3
Peptidasen, die nach 12stündigem Wachstum im Zuchtmedium gebildet wurden, wobei Elternstämme und mutierte Stämme des Bacillus subtilis gezüchtet wurden.
Die Aktivitäten werden in Aktivitätseinheiten pro ml des Filtrats angegeben.
TABELLE 3 Organismus saure neutrale alkalische
Peptidase Peptidase Peptidase Bacillus subtilis (Eltern stamm) 2000 4740 1308 Bacillus subtilis (asporischer Stamm) 2075 4680 Spur
Beispiel 14
Herstellung des Filtrats des Züchtungsmediums unter
Verwendung einer asporischen Mutante
Ein Impfmedium wurde aus einem asporischen Stamm des Bacillus subtilis hergestellt, indem man den Organismus von einer Agarkultur in ein steriles zur Beimpfung dienendes Medium überführte. Das zur Beimpfung dienende Medium enthielt 3,0 Gew.-% pro Volumen < (Trypticase Soy Broth , die mit 0,01 Gew.-% pro Volumen Kalziumchlorid und 0,01 Gew.-% pro Volumen L-Leucin verstärkt war und die durch die Zugabe von 1,0 normaler Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,2 gebracht worden war.
Das zur Beimpfung dienende Medium wurde hergestellt, indem man 100 ml dieses Mediums in 300-ml-Erlenmeyer-Kolben gab. Die beimpften Präparate wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine, mit einer Schüttelsweite von 5,1 cm und 125 Umdrehungen pro Minute 12 Stunden lang bei einer Temperatur von 360C geschüttelt und nach dieser Inkubationszeit wurde das so erhaltene Impfmedium dazu verwendet, um das zur Herstellung dienende Medium zu beimpfen, wobei die Beimpfung auf Basis von 2 Vol. -% pro Volumen durchgeführt wurde.
Das Medium, das zur Herstellung der Peptidasen diente, wurde hergestellt, indem man die wasserlöslichen Nährstoffe der Weizenkleie extrahierte. Zur Durchführung dieser Extraktion wurde ein Brei aus 3 Gew.-% Weizenkleie pro Volumen und Wasser unter Druck 45 Stunden lang bei einer Temperatur von 1200C gekocht.
Diese Mischung wurde dann abgekühlt und man liess sie absitzen und das klare darüberstehende Material wurde abgezogen und mit 0,01 Gew.-% pro Volumen Kalziumchlorid sowie 0,01 Gew.-% pro Volumen L-Leucin verstärkt. Das Medium wurde mit 1,0 normaler Salzsäure versetzt, so dass nach der Sterilisierung der endgültige pH-Wert 6,2 + 0,1 betrug.
Das beimpfte zur Herstellung dienende Medium wurde bei einer Temperatur von 66,00C gehalten und in einem mit Tauchwänden versehenen Gärbehälter, der ein Gesamtvolumen von 7,5 Litern aufwies, mit 300 Umdrehungen pro Minute gerührt. Sterilisierte Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von 2 Litern pro Minute zugegeben und normale flüssige Antischaummittel wurden zugesetzt, um die Schaumbildung zu unterdrücken. Die Züchtung wurde in diesem Medium so lange fortgesetzt, bis der maximale Gehalt an Enzymaktivität erreicht wurde, wobei die Enzymaktivität nach dem Milchkoagulierungstest ermittelt wurde. Diese Züchtungszeit betrug im allgemeinen 14 + 1 Stunden. Die Brühe des Züchtungsmediums wurde dann durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren geklärt.
Beispiel 15
Herstellung des Filtrats des Züchtungsmediums
Dieses Herstellungsverfahren wurde wie in Beispiel 14 beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme dessen, dass das zur Herstellung der Peptidasen dienende Medium so modifiziert wurde, dass die Aminosäure L-Leucin weggelassen wurde, und dass 0,25 Gew.-% pro Volumen eines Caseinpräparats zugesetzt wurden, wobei als Caseinpräparat das unter dem Handelsnamen Totamin von der Delmar Chemical Ltd. vertriebene verwendet wurde.
Alle anderen Bestandteile des Mediums blieben unverändert. Die geklärte Brühe des Züchtungsmediums entsprach im wesentlichen derjenigen, die nach Beispiel 14 hergestellt wurde.
Beispiel 16
Herstellung des Filtrats des Züchturzgsunediums
Das in Beispiel 14 beschriebene Herstellungsverfahren wurde durchgeführt, mit Ausnahme dessen, dass das zur Herstellung dienende Medium so modifiziert wurde, dass die Aminosäure L-Leucin weggelassen wurde und dass statt derselben 0,25 Gew.-% pro Volumen Zein verwendet wurden. Zein ist eine Eiweissfraktion des Maises. Alle anderen Bestandteile des Mediums blieben unverändert. Die geklärte Brühe des Züchtungsmediums entsprach im wesentlichen derjenigen, die nach Beispiel 14 hergestellt wurde.
In der folgenden Tabelle 4 werden die Peptidasen angeführt, die von einem mutierten Stamm des Bacillus subtilis gebildet wurden, der aus einem Weizenkleie und Kalziumchlorid enthaltenden Medium, das mit L-Leucin verstärkt war, gezüchtet wurde.
TABELLE 4
Peptidasen, die nach 12stündiger Züchtung aus dem zur Herstellung dienenden Medium erhalten wurden. Die Aktivitäten werden in Aktivitätseinheiten pro ml Filtrat angegeben saure Peptidase neutrale Peptidase alkalische Peptidase
2,350 4,775 Spur
Während der rutinenmässigen Herstellung des Filtrats des Züchtungsmediums wurde festgestellt, dass die Erreichung eines konstanten Wertes der Ausbeute an Produkt, also die Erreichung eines Plateaus bezüglich der Produktausbeute, immer mit dem Einsetzen der Versporung verbunden war. Aus Tabelle 3 sieht man, dass trotz der Tatsache, dass die Bildung der unerwünschten alkalischen Peptidasen zum Grossteil unterdrückt werden kann, dennoch nur ein ganz geringes Ansteigen in der Ausbeute der sauren und neutralen Peptidasen nach einer 12stündigen Züchtung zu beobachten ist.
Da jedoch die Versporung durch die Zeit, während der die Züchtung stattfindet, nicht mehr begrenzt ist, war es möglich, diese Zeit, während der die Züchtung stattfindet, noch zwei Stunden länger auszudehnen, ehe ein konstanter Wert, d.h. das Plateau bezüglich der Ausbeute an Produkt erzielt war.
Während dieser kritischen Zeit stieg die koagulierende Aktivität der gewonnenen Peptidasen auf das Achtfache an.
Bisher wurden nach 12stündiger Züchtungszeit 0,40 ml des rohen Filtrats des Züchtungsmediums benötigt, damit 10,0ml einer angesäuerten Magermilch bei 360C zum Koagulieren gebracht wurden. Durch die verlängerte Züchtungsperiode, die bei Verwendung eines asporischen Stammes möglich war, erhielt man ein rohes Filtrat des Kulturmediums, das eine grössere Koagulierungsaktivität besass und bei dem 0,05ml des Filtrats ausreichend waren, um 10,0mol Milch unter den oben angegebenen Bedingungen zu koagulieren.
Beispiel 17
Vergleich der Proteolyse
Um die Verwendbarkeit des erfindungsgemässen Enzymkomplexes, der wie vorhin beschrieben hergestellt wurde, näher zu erläutern wurden Vergleichsuntersuchungen an Käseabbauprodukten unternommen, wobei die Käse mit Hilfe von verschiedenen koagulierenden Präparaten hergestellt wurden. Unter gleichen Temperaturbedingungen, pH-Werten usw. wurden vier Enzympräparate verwendet, um verschiedene Milchproben zu koagulieren. Nachdem die Proben, wie bereits beschrieben wurde, zentrifugiert wurden, wurde von jeder Probe die Molke entnommen. In den einzelnen Molkefraktionen wurden die durch Enzymeinwirkung freigesetzten Aminosäuren bestimmt und die dabei erhaltenen Werte sind in der unten angeführten Tabelle 2 angegeben.
TABELLE 2 Aminosäuren erhaltene Fraktionen der Molke* in der Molke, Labextrakt angegeben Enzym- Pepsin Trypsin in ppm komplex Asparginsäure 0 2 0 68 Threonin 0 1 2 22 Serin 1 41 5 15 Glutaminsäure 19 27 51 74 Prolin 2 4 6 17 Glycin 4 2 13 19 Alanin 1 1 5 22 Valin 2 0 2 78 Isoleucin 1 11 1 69
Leucin 1 1 2 302 Tyrosin 0 1 2 280 Phenylalanin 1 0 1 395 Lysin 3 10 8 259 Histidin 0 0 2 21 Arginen 1 0 6 234 Gesamtmenge an Aminosäuren in ppm 36 61 106 1875 * Die bei diesen Versuchen verwendeten Enzymaktivitäten wa ren ausreichend, damit 10 ml Milch in etwa 1 Minute zum
Koagulieren gebracht wurden.
Von den 15 Aminosäuren, die als durch Enzymeinwirkung gebildete Abbauprodukte des Caseins gefunden wurden, wurden durch den erfindungsgemässen Enzymkomplex weniger Aminosäuren gebildet, als bei der Verwendung von Pepsin. Man sieht ferner, dass das gesamte Spektrum der gebildeten Aminosäuren bei der Verwendung des erfindungsgemässen Enzymkomplexes demjenigen Spektrum sehr ähnlich ist, das bei der Verwendung von tierischem Lab gebildet wird.
Beispiel 18
Herstellung von Käse (Versuchsmassstab)
73,8 Liter pasteurisierte Vollmilch wurden auf 31 +
10C erhitzt. Sobald diese Temperatur erreicht ist, wurde eine Käsestarter-Kultur in einer Menge von 0,5 bis 1,0 Vol.-% pro Volumen zugesetzt, und die Mischung wurde gründlich gerührt. Man liess die Organismen der Käsestarter-Kultur so lange wachsen, bis die Acidität der Milch 0,17%, bestimmt als Milchsäure, erreicht hatte. Zu diesem Zeitpunkt wurden 15 ml des erfindungsgemässen konzentrierten Enzymkomplexes zugesetzt.
Man rührte die Mischung gründlich durch und liess sie ohne Rühren und in zugedecktem Zustand in einem mit einem Mantel versehenen Gefäss 25 - 30 Minuten lang stehen.
Sodann wurde die koabulierte Milch mit einem Quarkmesser zerschnitten, und es wurden die üblichen Arbeitsverfahren für die Herstellung von Cheddarkäse durchgeführt. Nach dem Pressen wurde der schliesslich erhaltene Käse in die Reifungskammern gegeben, in denen eine Temperatur von 12 + 20C und eine relative Feuchtigkeit von 70 bis 75% herrschte. Die Käse wurden l bis 18 Monate lang reifen gelassen, und bei einer Prüfung der Käse, die zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt wurden, zeigte es sich, dass der Cheddarkäse üblichen Geschmack und übliche Konsistenz besass.
Beispiel 19 Herstellung von Käse in halbtechnischem Massstab
Das in Beispiel 18 beschriebene Arbeitsverfahren wurde durchgeführt, mit Ausnahme dessen, dass 455 Liter pasteurisierte Vol1milch mit 85,2 ccm des erfin dungsgemässen konzentrierten Enzymkomplexes koaguliert wurden. Bei der Herstellung des Cheddarkäses wurde geachtet, dass der Quark eine sehr wünschenswerte glatte seidenartige Struktur besass und dass auch eine vorteilhafte Art des Abbaues des Quarks stattfand. Nach dem Pressen wurde die Ausbeute an Käse bestimmt und es zeigte sich, dass keine bedeutenden Unterschiede zwischen den Käsen bestanden, die nach dem obigen Verfahren hergestellt wurden, und denjenigen, die zu Vergleichszwecken unter Verwendung von Lab erzeugt wurden. Die Käse wurden 90 Tage lang gereift.
Die unter Verwendung des erfindungsgemässen Enzymkomplexes hergestellten Käse, besassen, verglichen mit den Käsen der Kontrollversuche, üblichen Geschmack von Cheddarkäse und übliche Konsistenz.
Beispiel 20 Herstelllmg von Käse im Versuchsmassstab
Vollmilch, die etwa 3,4% Fett enthielt, wurde pasteurisiert und gekühlt. 72,6 kg dieser Milch wurden in ein mit Dampfmantel versehenes Gefäss mit einem Rauminhalt von 60kg gegeben und die Temperatur der Milch wurde auf einen Wert von 31 0C gebracht. Ein Gew.-% und ein halbes Gew.-% der üblichen käuflich erhältlichen Starterkuituren wurden zugesetzt und dieser Reifungsprozess der Milch wurde so lange fortgesetzt, bis eine Acidität von etwa 0,01 bis 0,02 erreicht wurde. Diese Acidität war gewöhnlich nach etwa 30 Minuten erreicht.
Nachdem sich die Säure gebildet hatte, wurden der Milch 15,0 ml eines Peptidasekomplexes zugesetzt. Der Peptidasekomplex war ein Komplex aus neutraler Peptidase und saurer Peptidase, der unter Verwendung des Bakteriums Bacillus subtilis gewonnen wurde. Dieser Peptidasekomplex wies eine solche Aktivität auf, dass 85,2 ccm dieses Komplexes 454 kg Milch koagulierten. Die Koagulierung wurde durchgeführt und man erhielt ein festes Koagulat.
Sobald die Milch koaguliert war wurde sie mit Quarkmessern in Würfel zerschnitten, deren Seitenlänge 0,64 cm betrug. Der zerschnittene Quark wurde langsam gerührt um ein Zerbrechen und ein Zusammenbacken der feinen Teilchen zu verhindern. Die Kochstufe wurde etwa 10 Minuten nach dem Zerschneiden begonnen und der Quark und die Molke wurden während einer Zeit von etwa 30 Minuten auf 39 C erhitzt. Während dieses Halteschrittes wurde eine Temperatur von 390C aufrechterhalten, bis die Acidität auf etwa 0,01 bis 0,15% angestiegen war. Dazu war noch eine zusätzliche Zeit von 25 Minuten notwendig.
Nach dem Ansteigen der Acidität wurde in den Mantel wieder Dampf eingeleitet und die Temperatur des Quarks und der Molke wurde während einer Zeit von etwa 5 Minuten auf 720C erhöht. Die Temperatur wurde etwa 10 Minuten lang bei 720C gehalten und dann wurde der Mantel des Gefässes mit Wasser gekühlt, so dass die Temperatur des Gefässes während einer Zeit von etwa 5 Minuten auf 390C eingestellt wurde. Wenn der Quark fest und trocken war, war die Acidität um 0,03% angestiegen und dann liess man absitzen. Dann wurde die Molke abgezogen und das normale Verfahren zur Herstellung von Cheddarkäse wurde durchgeführt. Der dabei erhaltene Käse wies eine hervorragend gute Konsistenz auf und sein Feuchtigkeitsgehalt betrug etwa 35%.
Beispiel 21 Herstelllfng von Käse im halbtechnischen Massstab
Vollmilch, die etwa 3,4% Fett enthielt, wurde pasteurisiert und abgekühlt. 318 kg dieser Milch wurden in ein übliches mit Dampfmantel umgebenes Käsereigefäss gepumpt, das ein Fassungsvermögen von 454 kg besass. Die in diesem Gefäss befindliche Milch wurde auf eine Temperatur von 31 0C gebracht. 1 Gew.-% und % Gew. % der üblichen käuflich erhältlichen Starterkultur wurden zugesetzt und man liess die Milch so lange reifen, bis ein Anstieg der Acidität von etwa 0,01 bis 0,02% stattgefunden hatte. Dies war im allgemeinen nach etwa 30 Minuten der Fall. Sobald sich die Säure entwickelt hatte, wurden 59,6cm des in Beispiel 20 verwendeten Peptidasekomplexes der Milch zugesetzt.
Es trat Koagulierung auf und man erhielt ein festes Koagulat.
Sobald die Milch richtig koaguliert war, wurde sie zu Würfeln zerschnitten, indem man übliche 0,635 mm (1,4 inch) Quarkmesser verwendete. Der zerschnittene Quark wurde langsam gerührt, um ein Zerbrechen und Zusammenbacken der weichen Teilchen zu verhindern. Die Kochstufe wurde etwa 10 Minuten nach dem Zerschneiden gestartet und der Quark und die Molke wurden während einer Zeit von 30 Minuten auf 390C erhitzt.
Während dieses Haltestadiums wurde eine Temperatur von 390C solange aufrecht erhalten, bis die Acidität um etwa 0,01 bis 0,02% angestiegen war. Hiezu war eine zusätzliche Zeit von etwa 30 Minuten nötig.
Sobald die Acidität angestiegen war, wurde erneut Dampf in den Mantel des Gefässes eingeblasen und die Temperatur des Quarks und der Molke wurde innerhalb von etwa 5 Minuten auf 430C erhöht. Die Temperatur wurde etwa 3 Minuten lang auf einen Wert von 430C gehalten und danach wurde Kühlwasser in den Mantel des Gefässes eingeleitet, wodurch die Temperatur des Gefässinhaltes innerhalb von etwa 7 Minuten auf einen Wert von 390C gesenkt wurde. Sobald die Acidität um etwa 0,3% zugenommen hatte, und der Quark fest und trocken war, liess man den Quark absetzen. Die Molke wurde abgezogen und das übliche Verfahren zur Herstellung des Cheddarkäses wurde durchgeführt. Der dabei erhaltene Käse wies eine hervorragend gute Konsistenz auf und besass einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 35%.
PATENTANSPRUCH I
Von Bakterien hergestellte Peptidase-Enzymmischung, die eine hohe Milch koagulierende Aktivität und eine geringe proteolytische Aktivität besitzt, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymmischung eine saure Peptidase und eine neutrale Peptidase enthält, und im wesentlichen frei von alkalischer Peptidase ist.
UNTERANSPRÜCHE
1. Enzymmischung nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein von Bakterien der Klasse Bacillus hergestelltes Enzymgemisch ist.
2. Enzymmischung nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium eines eines Stammes der Species Bacillus subtilis ist.
3. Enzymmischung nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase im Bereich von etwa 1: 0,5 bis etwa 1: 5,0 liegt.
4. Enzymmischung nach Unteranspruch 3, dadurchgekennzeichnet, dass das Verhältnis von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase im Bereich zwischen etwa 1: 2,0 bis etwa 1: 3,0 liegt.
5. Enzymmischung nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung Ionen von mindestens einem einwertigen Metall und mindestens einem zweiwertigen Metall enthält.
PATENTANSPRUCH II
Verfahren zur Herstellung der Enzymmischung nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Medium, das Kohlenhydrate liefernde Verbindungen, stickstoffhaltige Materialien, essentielle Nährstoffe und anorganische Salze enthält, mit einem Bakterium beimpft, das in der Lage ist, mindestens saure Peptidase und neutrale Peptidase zu liefern, und die bei der Züchtung gebildeten Enzyme anschliessend extrahiert.
UNTERANSPRÜCHE
6. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass anwesende alkalische Peptidase zum Grossteil entfernt, gehemmt oder inaktiviert wird.
7. Verfahren nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Bakterium eines der Klasse Bacillus verwendet.
8. Verfahren nach Unteranspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Bakterium einen Stamm der Species Bacillus subtilis verwendet.
9. Verfahren nach einem der Unteransprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die alkalische Peptidase durch Ionenaustauschchromatographie im wesentlichen entfernt wird.
10. Verfahren nach einem der Unteransprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die alkalische Peptidase durch Zugabe eines Inhibitors im wesentlichen gehemmt wird.
11. Verfahren nach einem der Unteransprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die alkalische Peptidase durch thermische Denaturierung im wesentlichen inaktiviert wird.
12. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man als Bakterium eine asporische Mutante der Klasse Bacillus verwendet.
13. Verfahren nach Unteranspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Bakterienstamm eine asporische Mutante der Species Bacillus subtilis ist.
14. Verfahren nach Patentanspruch II oder einem der Unteransprüche 6 bis 8, oder 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium einen geringen Gehalt an abbaubarem Stickstoff und Kohlenhydraten aufweist.
15. Verfahren nach Patentanspruch II oder einem der Unteransprüche 6 bis 8, oder 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium ein Weizenkleienmedium ist.
16. Verfahren nach Patentanspruch II oder einem der Unteransprüche 6 bis 8, oder 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium mit Kalziumionen angereichert ist.
17. Verfahren nach Patentanspruch II oder einem der Unteransprüche 6 bis 8, oder 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium mit L-Leucin angereichert ist.
18. Verfahren nach Patentanspruch II oder einem der Unteransprüche 6 bis 8, oder 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium mit Mangan, Magnesium und Phosphat angereichert ist.
PATENTANSPRUCH III
Verwendung der Enzymmischung nach Patentanspruch I zur Herstellung von Käse, dadurch gekennzeichnet, dass man die Koagulierung der Milch durch die Zugabe dieser Enzymmischung durchführt.
UNTERANSPRÜCHE
19. Verwendung nach Patentanspruch III zur Herstellung von Cheddarkäse, dadurch gekennzeichnet, dass man eine geeignet gereifte Milch durch die Zugabe der die neutralen u. sauren Peptidasen enthaltenden Enzymmischung koaguliert, verweilen lässt und den Quark zerschneidet, den zerschnittenen Quark bei einer Temperatur im Bereich von etwa 39 bis 400C kocht, den Quark bei der maximalen Kochtemperatur hält, sodann den Quark von der Molke abscheidet, schliesslich den Quark in der für Cheddarkäse üblichen Art salzt, presst und schliesslich reifen lässt, wobei man, während der Zeit, wo die Temperatur im Bereich von 39 bis 400C gehalten wird, eine rasche Temperaturerhöhung der aus Quark und Molke bestehenden Mischung auf einen Bereich von etwa 40,5 bis 460C durchführt, und dann diese Temperatur so lange einhält, bis die gewünschte Zusammenwirkung angeregt ist.
20. Verwendung nach Unteranspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur rasch auf die normale Kochtemperatur erniedrigt wird, nachdem die erhöhte Temperatur von 40,5 bis 460C während der gewünschten Zeit aufrechterhalten wurde.
21. Verwendung nach Patentanspruch III oder Unteranspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Enzymmischung von einem Bakterium der Klasse Bacillus stammt.
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.