DE1642640A1 - Bakteriell gewonnener Enzymkomplex und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Description

Hamburg, den 20. November 1967

Anmelderin: JOPIN LABATT LIMITED, 150 Simooe Street London, Ontario / Kanada

Vertreter: Patentanwalt Dr. Friedrich. Vollmer 2 Flamburg 70, Sohloßsfcraße 6

Für diese Anmeldung werden die Prioritäten vom 1. Dezember I966 aus der amerikanischen Patentanmeldung Serial No. 598 191* vom 21. Juni 1967 aus der amerikanischen Patentanmeldung Serial No. 647 627 und vom 10. März I967 aus der kanadischen Patentanmeldung Serial No. 984 942 in Anspruch genommen.

Bakteriell gewonnener Enzymkomplex und Verfahren zu dessen Herstellung

Die Erfindung bezieht sich auf einen auf bakteriellem Weg gewonnenen Enzymkomplex, der für die Zubereitung von Käse verwendet werden kann, und auf ein Verfahren zur Herstellung des Komplexes sowie auf ein Verfahren zur Herstellung von Käse unter Verwendung des Komplexes. Speziell betrifft die Erfindung einen ml Ichgerinnend wirkenden Eruymkomplex, der, wie gefunden

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wurde, speziell verwendbar ist, um Käse mit ausgezeichneter Textur, guter Ausbeute und hervorragend gleichbleibenden
Geschmackseigenschaften zuzubereiten.

Das tierische Enzym-Präparat, das im allgemeinen aus dem
vierten Magen säugender Kälber extrahiert wird, bezeichnet
man gewöhnlich als "Labferment". Es ist seit langem bekannt, daß dieses Präparat die Fähigkeit hat, Milch zu koagulieren, und man weiß, daß es dann nur wenig proteolytisch auf den so gebildeten Quark wirkt. Diese beiden Eigenschaften sind eine Besonderheit, die allein dem Labferment zukommt, und auf diesen Eigenschaften beruht hauptsächlich der Erfolg, der damit bei der Zubereitung von verschiedenen Käsesorten und Milch-Nachspeisen erzielt werden konnte. Da man jedoch als Rohmaterial für die Herstellung dieses Enzyms die Mägen von säugenden
Kälbern verwenden muß, ist die Menge des verfügbaren Rohmaterials begrenzt, und das Rohmaterial ist vergleichsweise aufwendig.

Allgemein ist bekannt, daß zahlreiche proteolytische Enzyme, die nachstehend als Peptidasen bezeichnet werden, die Fähigkeit haben, Milch zu koagulieren. So ist es möglich, mit Peptidasen tierischen Ursprungs, z.B. Pepsin und Trypsin, ebenso wie mit solchen pflanzlichen Ursprungs, wie beispielsweise Papain und Flcin, Milch zu koagulieren. Da Labferment nur in geringen
Mengen zur Verfügung steht, hat man Pepsin als Streckmittel

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für Labferment benutzt. Obgleich im allgemeinen Pepsin hinsichtlich seiner Aktivität und spezifischen Wirkung als dem Labferment sehr ähnlich angesehen wird, wurde gefunden, daß Käse, der aus solchen koagulierenden Zubereitungen gewonnen worden war, die erhebliche Mengen an Pepsin enthielten, beim Aufbewahren zum Bitterwerden neigte. Dies legt nahe, daß dabei eine Art von Proteolyse eintritt, die von der Labferment-Proteolyse verschieden ist. Trypsin hat den Nachteil, daß es zu stark proteolytisch wirkt, so daß, obgleich es Milch in geeigneter Weise zu koagulieren vermag, durch die nachfolgende starke Proteolyse der gebildete Quark leicht zusammenfällt.

Auch Peptidasen, die mittels Bakterien, z.B. Bacillus subtilis, Bacillus cereus und Pseudomonas fluorescens gewonnen werden, haben milchkoagulierende Aktivität. Bakteriell gewonnene Peptidasen sind beispielsweise beschrieben in der britischen Patentschrift Nr. 565 788 vom 28. November 1944. Da jedoch diese Peptidasen eine hohe proteolytische und eine vergleichsweise geringe milchkoagulierende Aktivität aufweisen, kann man sie praktisch nicht als milchkoagulierende Enzyme einsetzen.

•Es sind zahlreiche weitere Versuche durchgeführt worden, um einen Ersatz für Labferment zu finden, und dabei hat man u.a. die Enzyme untersucht, die von dem Pilzstamm Endothia parasitica gewonnen werden, wie dies beschrieben ist bei Sardinas in der

amerikanischen Patentschrift Nr. 3 275 ^53 vom 27. September I966, und weiterhin hat man ein Enzym geprüft, das aus dem Pilz Mucor pusillus Lindt gewonnen wird, wie dies beschrieben ist von Arima und Mitarbeitern in den amerikanischen Patentschriften 3 I5I 039 und 3 212 905. Jedoch hat das aus Endothia parasitica gewonnene Enzym den Nachteil, daß Endothia parasitica pflanzenkrankheitenerregend ist. Das von Mucor pusillus Lindt produzierte Enzym hat anscheinend den Nachteil, daß damit ein Käse mit korkiger Textur gewonnen wird, der eine lange Reifungszeit erfordert, damit der normale Geschmack entwickelt wird.

Bei einer Untersuchung der Wirkungen von verschiedenen Peptidasen auf Milch wurde beobachtet, daß einige Peptidasen, die eine maximale Aktivität auf Kasein bei einem pH Wert von etwa 7,0 aufweisen, jedoch über einen pH-Bereich von etwa 7,0 * 1,5 wirksam sind, in geeigneter Weise entrahmte Milch koagulieren. Solche Peptidasen werden im Folgenden als neutrale Peptidasen bezeichnet. Milch, die für diese Untersuchungen und alle sonstigen Koagulierungs-Prüfungen verwendet wurde, war mit Milchsäure auf pH 6,5 angesäuert und wurde bei 56⁰C gehalten. Das mittels neutraler Peptidase gewonnene Koagulat wurde mit einem solchen verglichen, das mittels Labferment erzeugt worden war, und es wurde gefunden, daß es weicher, stärker aschig (d.h., daß mehr Quark-Feinteilevorhanden sind) war und eine weniger gummi artige Toxl-ur aufwies. Gewisse andere

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Peptidasen, die nachstehend als saure Peptidasen bezeichnet werden und die eine maximale Aktivität auf 'Hämoglobin im mittelsauren Bereich (pH 4,0 — 2,0) aufweisen, koagulierten Milch nicht. Jedoch v/urde gefunden, daß dann, wenn man eine solche saure Peptidase mit einer neutralen Peptidase zusammenbringt und diese Kombination der Milch zusetzt, das resultierende Koagulat eine bessere Gesamtquaiität aufwies als ein solches, das man bei Verwendung der neutralen Peptidase alleine gewinnen kann.

Eine dritte Gruppe von Peptidasen, die nachstehend als alkalische Peptidasen bezeichnet werden (und eine maximale Aktivität auf Kasein in einem pH-Bereich von 8,5 — i>0 aufweisen), wurde ebenfalls für Untersuchungen betreffend Milch-Koagulation eingesetzt. Es wurde beobachtet, daß man, wenn man solch ein Enzym alleine oder in Kombination mit einer neutralen Peptidase oder in Kombination mit einem Präparat aus einer neutralen und einer sauren Peptidase einsetzt, ein Koagulat gewinnt, das, verglichen mit einem Labfermerit-Koagulat, eine extrem schlechte Gesamtqualität aufweist. Es hat demzufolge den Anschein, daß ein Enzymsystem, das saure Peptidase plus neutraler Peptidase hat mit wenig oder überhaupt keiner alkalischen Peptidase mit Erfolg als Ersatz für Labferment eingesetzt werden kann.

Die Gesamttextur (Glätte, Härte, gummiartiger Charakter) eines Koagulates aus Milch kann der Fachmann auf dem Gebiet der

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Käsezubereitung in geeigneter Weise erkennen. Eine solche Beurteilung ermöglicht jedoch, wenn überhaupt, nur wenig quantitative Zahlenwerte für Vergleichszwecke. Um solche Vergleichsdaten zu erhalten, wurde das folgende Gerinnungsversuchs-Verfahren entwickelt: Eine bestimmte Menge an Milch, die wie zuvor angegeben vorkonditionlert war, wurde mit einem Enzym-Präparat koaguliert. Das Koagulat wurde geschnitten, und man ließ die Synärese JO Minuten lang ablaufen. Die gesamte Masse an Molke und Quark wurde dann 10 Minuten zentrifugiert, wobei mit einer vergleichsweisen Zentrifugalkraft (Schwerkraft) bei 1225 gefahren wurde. Nach dem Zentrifugieren wurde der Quarkkuchen einer Penetrations-Prüfung unterworfen. Für diese

x)
Prüfung ein Penetrometer (Precision Scientific Co. - ASTM specification D 2I7) mit einem Penetrationskegel einer Abmessung (ASTM specification D IA03) verwendet. Für alle /ersuche wurde die Standard-Penetrationszeit von 5 Sekunden eingehalten. Labferment-Quark und Labfermentahnliche Quarke zeigten minimale Penetration, angegeben in Millimetern der tatsächlichen Penetration, x) wurde

Typische Penetrationswerte für Quark, der mittels verschiedener koagulierender Präparate (Kombinationen von im Handel erhältlichen Produkten) gewonnen worden war, sind in Tabelle I zusammengestellt:

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Tabelle I

Enzym-Präparate

Penetration

Labferment

Pepsin

Trypsin

im Handel erhältliche neutrale Peptidase

im Handel erhältliche neutrale plus im Handel erhältliche saure Peptidasen

im Handel erhältliche neutrale plus im Hanüel erhältliche saure plus im Handel erhältliche alkalische Peptidasen

im Handel erhältliche alkalische Peptidase

3,5 mm 3,5 mm 7,0 mm

5.4 mm

4.5 mm

5,8 mm 6,2 mm

Danach wurde Bacillus subtilis auf einem Weizenkeime-Calciumchlorid-Medium gezüchtet, und das klare KuItur-Filtrat wurde auf Peptidasen-Komponenten geprüft. Das Prüfungsνerfahren war eine Modifikation der Anson-Methode, wie sie dargestellt ist bei Hussain & McDonald - Can. J. Microbiol. 4.237-242 (1958) wobei als Substrate νjtaminfreies Kasein und standartisiertes Hämoglobin (Nutritional Biochemieais Corp.) verwendet wurden. Daü Verfahren wurde weiterhin in der Weise abgeändert, daß Sucejηat-Puffer in dem sauren (Hämoglobin) Bereich und Tris-MaIeat-Puffer in dem neutralen und alkalischen (Kasein) Bereich eingesetzt wurden. Der Versuch mit neutraler Peptidase in Anwesenheit von alkalischer Peptidase wurde durch Inhibierung

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der letzteren mit Kartoffel-Inhibitor, der gemäß der Methode von Watanabe-Nippon Nogei-Kagaku Kaishi 32 260-262 (1958) extrahiert worden war, vervollständigt. Die Aktivität der neutralen Peptidase wurde durch Chelat-Bildung mit Äthylendiamintetraessigsäure inhibiert, und dann wurde die Chelatorunempfindliche alkalische Peptidase bestimmt.

Diese Versuchs-Durchführungen zeigten, daß das Kulturfiltrat wenigstens zwei normalerweise mit der Züchtung des Bacillus subtilis assoziierte Peptidasen enthielt, und zwar alkalische Peptidase und neutrale Peptidase. Es wurde gefunden, daß zusätzlich zu diesen üblichen Peptidasen auch saure Peptidase mit einer maximalen Aktivität im mittelsauren Bereich vorhanden war. Es konnte gezeigt werden, daß die saure Peptidase hinsichtlich Aktivität und Stabilität abhängig ist von zweiwertigen Kationen (insbesondere Calcium und Zink). Sie wurde durch Chelat-bildende Mittel inhibiert. Dieses Enzym konnte nur dann nachgewiesen werden, wenn wenig Maskierungspuffer in dem Peptidase-Versuchssystem benutzt wurde. Die Anwesenheit von drei Peptidasen in dem Kulturfiltrat wurde sowohl mittels Zelluloseazetat als auch mittels Scheiben-Elektrophorese bestätigt.

Aufgrund der zuvor beschriebenen Erkenntnisse, daß die Gesamtqualität eines Mi Ich-Kongulates, daß mit handelsüblichen Peptidasen gewonnen wurde, verbessert werden kann., wenn nur saure

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Peptidase und neutrale Peptidase vorhanden sind, wurden Maßnahmen vorgenommen, um die Quantität an alkalischer Peptidase in dem Piltrat zu reduzieren. Die alkalische Peptidase wurde in an sich bekannter Weise dadurch entfernt, daß man das Piltrat durch ein kationisches Adsorptionsmittel in einer Ionenaustauscherkolonne hindurchfließen ließ, in der die negativ geladene alkalische Peptidase von den positiv geladenen sauren und neutralen Peptidasen abgetrennt wurde.

Der dabei erhaltene Enzym-Komplex, der aus saurer Peptidase und neutraler Peptidase plus anorganischen Ionen entsteht, wurde für Koagulations-Uritersuchungen eingesetzt. Es wurde gefunden, daß damit hergestellter Quark einen Penetrationswert von 3j5 mm hatte, also den gleichen Wert wie mit Labferment hergestellter Quark, wie dies in Tabelle I veranschaulicht ist. Es wurden mit dem Enzymkomplex Käse zubereitet, und es wurde gefunden, daß dieser Käse sich hervorragend vergleichen ließen mit Cheddar-Käse, der mitteLs Labferment zubereitet war, und zwar sowohl, zu Beginn als auch nach normalen Reifungszelten.

Es wurde demzufolge erfindungsgemäß gefunden, daß man einen hochbefriedigenden Ersatzstoff für Labferment aus milchgerinnenden bakteriellen Peptidasen, beispielsweise solchen, die aun dem Stamm Bacillus gewonnen werden, herstellen kann.

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Solche Peptidasen lassen sich so behandeln, daß man einen Komplex einer sauren Peptidase und einer neutralen Peptidase gewinnt, der praktisch frei von alkalischer Peptidase ist. Die sauren und neutralen Peptidasen können in der Verhältnismenge von ein Teil saurer Peptidase zu zwischen etwa 0,5 bis etwa 5>0 Teilen neutraler Peptidase eingesetzt werden, und besonders gute Ergebnisse lassen sich dann erhalten, wenn das Mengenverhältnis ein Teil saure Peptidase zu zwischen etwa zwei bis etwa drei Teilen neutraler Peptidase beträgt.

Pin erfindungsgemäßer, besonders geeigneter Enzymkomplex ist ein solcher, den man aus dem Bakterium Bacillus subtilis gewinnt, mit dem etwa zwei bis drei Teile neutrale Peptidase i--3 Teil saure Peptidase erzeugt werden. Wenn dieser Enzym-Komplex zum Koagulieren von Milch eingesetzt wird, so 1st, wie gefunden wurde, das resultierende Koagulat allen anderen geprüften Produkten überlegen, und der damit zubereitete Käse hatte eine ausgezeichnete Qualität und Ausbeute und zeigte darüberhinaus keinerlei Tendenz, sich beim Altern zu zersetzen oder bitter zu werden. Es wurde ferner gefunden, daß es vorteilhaft ist, einige anorganische Ionen dem Enzymkomplex zuzusetzen. Als solche anorganische Ionen-Zusätze lassen sich beispielsweise Magnesium, Mangan, Kalium, Calcium, Zink und Natrium verwenden.

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Der erfindungsgemäße Enzymkomplex läßt sich von beliebigen bakteriellen Enzymkomplexen mit milchgerinnender Wirkung, die wenigstens eine saure und eine neutrale Peptidase enthalten, gewinnen. Solch ein Enzym kann auch eine unschädliche alkalische Peptidase enthalten, gegebenenfalls muß diese im wesentlichen entfernt, inhibiert oder inaktiviert werden, so daß sie eine vernachlässigbar geringe aktive Wirkung während der Zubereitung des Käses hat.

Es stehen zahlreiche Methoden zur Entfernung, Inhibierung oder Inaktivierung der alkalischen Peptidase zur Verfügung. Man kann beispielsweise dadurch inhibieren^ daß man einen geeigneten Inhibitor, beispielsweise einen aus Kartoffeln extrahierten Inhibitor, zusetzt. Es ist möglich, die alkalische Peptidase durch thermische Denaturierung zu inaktivieren, da die sauren und neutralen Peptidasen einen höheren Grad thermischer Stabilität aufweisen als die alkalische Peptidase. Weiterhin ist es auch möglich, die alkalische Peptidase durch bekannte Arbeitsweisen, beispielsweise durch Ausfällung oder Fraktionierung zu entfernen. Eine besonders geeignete Methode ist die Abtrennung der alkalischen Peptidase durch Ionenaustauscher-Chromatographie. Diese Methode wird vereinfacht durch die Tatsache, daß die alkalische Peptidacc- eine reine negative Ladung trägt, während die sauren und die neutralen Peptidasen je reine positive Ladungen aufweisen.

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Als Medium für die Züchtung der Bakterien im Zusammenhang mit der Erfindung kann jedes geeignete natürliche oder künstliche Medium verwendet werden, vorausgesetzt, daß es wenigstens eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält. Als Kohlenstoffquelle kann man ein beliebiges Monosaccharid, Disaccharid oder Polysaccharid einsetzen, das die Bakterien zu assimilieren vermögen, beispielsweise Glucose, Fructose, Saccharose, Lactose und Stärke. Es läßt sich auch eine große Vielzahl von assimilierbaren Stickstoffquellen einsetzen, beispielsweise anorganische Ämoniumsalze, Aminosäuren und eine Vielzahl von Protein-Substanzen. Als Beispiele für anorganische Salze können erwähnt werden Magnesiumsalze, Calciumsalze, Mangan salze und zahlreiche Phosphate. Ein besonders für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignetes Medium ist ein solches, das einen niedrigen Gehalt an fermentierbarem Stickstoff und Kohlenhydrate aufweist, beispielsweise ein Medium, das nicht mehr als etwa 4 % (Gewicht/Volumen) ganzer Weizenkeime während der Fermentation enthält.

Die VerhäTtnismenge von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase kann man durch verschiedene Arbeitsweisen sowohl vor als auch während der Bildung des Enzymkomplexes in dem Kulturmedium und auch, nachdem der Komplex gebildet worden ist, einstellen. Zu solchen Arbeitsweisen zur Änderung der Verhältnismenge von saurer Peptidase zu neutraler Peptidaee gehören die Änderungen der Parameter, das ist Luft oder Rührgeschwindigkeit* In dem 3sbrüi'ⁱ.mgs-B<?hM."^{! v},^v_Tl Ausfällung oder Fraktionierung des Kultur-

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filtrates, sowie sonstige bekannte Arbeitsmethoden.

Es wurde gefunden, daß mems, wenn man Bacillus subtilis in einem Weizenkeime und Calciumchlorid enthaltenden Medium züchtet, die beiden Substanzen saure Peptidase und neutrale Peptidase und auch alkalische Peptidase in dem Kulturfiltrat erhalten werden, daß jedoch die Menge an saurer Peptidase im Vergleich zu der Menge an neutraler Peptidase etwas geringer als für eine qualitativ hochwertige Quark-Bildung erforderlich, ist. Ausgedehnte Nährwert-Studien ergaben, daß die anteilige Menge an saurer Peptidase in dem KuIturf Lltrat erhöht und gleichzeitig die anteiligen Mengen an neutraler Peptidase und alkalischer Peptidase erniedrigt werden können, wenn man vor der Züchtung dem Kulturmedium eine Quelle für die Aminosäure L-Leucin zusetzt.

Eine bevorzugte Methode zur Einstellung des Mengenverhältnisses von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase in der Nährlösung bietet sich durch Ionenaustauscher-Chromatographie zufolge der verschiedenen Eluier-Geschwindigkeiten der beiden Enzyme von dem Adsorbenz an. Eine weitere Methode zur Einstellung des Mengenverhältnisses von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase besteht darin, daß man den Enzymkomplex, nach Reduktion jeglicher alkalischer Peptidase, mittels verschiedener thermischer Denaturierung behandelt, was dadurch möglich wird, daß die saure Peptidase im Vergleich zu der neutralen Peptidase eine

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bessere thermische Stabilität aufweist. Es können ferner alle sonstigen bekannten Arbeitsweisen für die Behandlung von Enzymen benutzt werden.

Es wurde ferner überraschend gefunden, daß saure und neutrale Peptidasen selektiv unter praktischem Ausschluß von alkalischer Peptidase gezüchtet werden können, wenn man einen asporulanten Mutanten eines Bakteriums des Stammes Bacillus auf einem Nähr-Medium züchtet, das eine Kohlensfcoffquelle, aine Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält, und daß die Ausbeute an sauren und neutralen Peptidasen gegenüber der mittels üblicher Methoden gewonnenen, erheblich höher liegt. Wenn man darüberhinaus das Medium mit einer Quelle von L-Leucin anreichert, dann erhält man die sauren und neutralen Peptidasen direkt in einer Verhältnismenge, die für die Zubereitung von Käse ganz besonders geeignet ist.

Demzufolge gestattet diese Ausführungsform die direkte Gewinnung von sauren und neutralen Peptidasen, ohne daß es notwendig ist, entweder die Verhältnismenge von saurer zu neutraler Peptidase auszubalancieren oder alkalische Peptidase zu entfernen, zu inhibieren oder zu inaktivieren. Diese Vorteile ergeben zusammen mit den höheren Ausbeuten an sauren und neutralen Peptidasen einen erheblichen technischen Portschritt.

Das L-Leucin kann dem Nähr-Medlum in reiner Form, in racemischer Form oder in einem geeigneten L-Leucin enthaltenden Nährstoff

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zugegeben werden. Die Menge des zugesetzten L-Leucins zu dem Medium kann in einem weiten Bereich variieren, wobei als optimale Menge, die für die maximal vorteilhafte Einstellung der Verhältnismengen von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase zuzusetzen ist, etwa 0,01 % (Gewicht/Volumen) L-Leucin ermittelt wurden. Es sollte selbstverständlich beachtet werden, daß das L-Leucin nur dann erforderlich ist, wenn es notwendig wird, das Gewichtsverhätnis von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase einzuregulieren.

Asporulante Mutanten zur erfindungsgemäßen Verwendung können durch eine Vielzahl von bekannten Arbeitstechniken gewonnen werden. Die asporulanten Mutanten von Bacillus subtilis lassen sich in geeigneter Weise aus einem Ursprungsstamm (parent strain) von Bacillus subtilis unter Verwendung von ultraviolettem Licht oder neutralem Acriflavin als mutagenetische Mittel gewinnen.

Ein typisches Cheddar-Käse-Zubereitungsverfahren weist die folgenden Stufen auf:

1. Ein Ansatz von pasteurisierter oder unpasteurisierter Vollmilch wird bei ^Q bis 32°C gehalten und mit einer oder mehreren Arten von Milchsäure produzierenden Bakterien, wie beispielsweise Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus acidophilus, Streptococcus thermophilus und Lactobacillus aeidophilis, beimpft. Man läßt die Organismen in der Milch efea bis 6o Mini:tsn lang wachsen und cuafcsi ©ntwiotelt. :f:Le»i öl.·; .

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erhöhte Acidität. Diese Zunahme der Acidität der Milch beträgt normalerweise etwa 0,01 bis 0,02 %_s bestimmt als titrierbare Acidität.

2. Nachdem der gewünschte Anstieg der Acidität erreicht worden ist, rührt man ein milchkoagulierendes Mittel, beispielsweise tierisches Labferment, in die Milch ein und läßt das System dann ohne Rühren etwa J>0 Minuten lang stehen« Die Koagulation wird gewöhnlich bei einer Temperatur von etwa JtI C geführt, und es bildet sich ein gelartiges Koagulat.

j5. Nachdem das Koagulat den gewünschten Festigkeitsgrad erreicht hat, schneidet man es in kleine Würfel von etwa 6,35 oder 9j25 mm.

4. Der Quark und die Molke werden dann gerührt und auf eine Temperatur von etwa J59 bis MO C erwärmt. Für dieses Erwärmen

ρ ist üblicherweise eine Zeitspanne von etwa J>0 Minuten erforderlich,

5« Der Quark und die Molke werden kontinuierlich über eine Zeitspanne von etwa 45 bis 65 Minuten \?eiter gerührt, während man sie bei der erhöhten Temperatur hält. Während dieser Zeitspanne (die nachstehend als Haltezeit bezeichnet wird) kombinieren sich die Wirkungen der erhöhten Temperatur, der erhöhten Acidität und des Koagulierungsmittels, so daß das Festwerden und Trocknen der Quarkteilchen und die Abscheidung der Molke von diesen Teilchen beeinflußt werden.

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6. Nachdem die QuarkteiLehen den gewUnschben Fesbigkeibs- und Trocken-Grad erreichb haben und die Acidibäb um ebwa 0,02 bis 0,03 '/0 angesbiegen ist, Läi3b man den Quark absibzen und ziehb die Molke aus dem Bottich ab,

7. Die Gesambzeib des Absebzens und Abziehens (Dränagezeit) beträgb ebwa 2 L/2 Stunden. Danach folgen die charakteristischen Endstufen der Cheddar-Käse-Zubereibung.

V/enn man Cheddar-Käse auf UbLiehe Weise zubereitet, und dabei den erfindungsgemaßeri PepbLdase-KompLex aLs KoagulierungsmibbeL verwendet, dann hat, wie gefunden wurde, der resultierende Käse einen Feuchtigkeitsgehalt von ebwa j>6,5 bis 38,5 $· Der Feuchtigkeitsgehalt ist ein sehr* bedeutendes Merkmal für die Qualität bei Cheddar-Käse, und vorzugsweise wird er bei etwa 35 % gehalten. V/enn dLe Feuchtigkeitsgehalte höher liegen, so kommt es leicht vor, daß die Käse einen zu schwachen Körper haben, leicht verfärben und schlechten Geschmack besitzen. Demzufolge war es notwendig, eine Arbeitsweise zu finden, mit der sich der Feuchtigkeitsgehalt des fertigen Käses vermindern läßt.

V/enn man den Pepcidase-Komplex bei der Zubereitung von Käse benutzt, dann Lst dLe neu bra Le Peptidase Ln e;rster LLnLe bei der MLLchkoaguLation beteiligt, während die saure PeptLdase vorzugsweise für das Festwerden und Trocknen des Quarkes

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wirksam wird. Es wurden Untersuchungen durchgeführt im Hinblick auf die Paktoren, die die Aktivitäten der neutralen und sauren Peptidasen beeinflussen, und es wurde gefunden, daß die beiden Peptidasen maximale enzymatische Aktivitäten bei verschiedenen Temperaturen aufweisen. So hat, wie gefunden wurde, die neutrale Peptidase ihr Aktivitätsmaximum bei etwa 46°C, während die maximale Aktivität der sauren Peptidase bei etwa 5^°C liegt.

Es wurde ferner gefunden, daf3 infolge der verschiedenen Wärmeaktivitätscharakteristiken dieser beiden Peptidasen eine Temperaturerhöhung von 39°C auf ¹Yj)⁰Q eine Aktivierung der sauren Peptidase (des verfestigenden Enzyms) um etwa 30 % ergibt, während die neutrale Peptidase (das koaguliereride Enzym) um weniger als 5 % aktiviert wurde.

Es wurde jedoch gefunden, daß bei der Zubereitung von Cheddar-Käse unter Verwendung eines milchkoagulierenden Enzymkomplexes der Feuchtigkeitsgehalt des Käses dadurch erniedrigt werden kann, daß man, während der Haltezeit kurzzeitig zusätzliche Wärme zuführt. Während der Durchführung dieser kurzzeitigen Beaufschlagung mit zusätzlicher Wärme erhöht man die Temperatur¹ des Quarks auf etwa 40,5 bis 46°C.

Während dieser Beaufschlagung mit zusätzlicher Wärme sollte die Temperatur der üblichen Haltezeittemperatur so schnell wie möglich erhöht werden, die Masse bei der erhöhten Temperatur

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nur so kurze Zeit, wie zur Anregung der Synärese erforderlich, gehalten werden und dann je nach dem verwendeten Ausgangsorganismus, schnell auf die normale Haltezeit-Temperatur abgekühlt werden. Die erhöhte Temperatur liegt zweckmäßig im Bereich von etwa k2. Ms 44°C, und bevorzugt hält man nicht länger als etwa 15 Minuten auf dieser Temperatur. Im allgemeinen läßt man die erhöhte Temperatur für eine Zeitspanne von etwa 1 bis 10 Minuten einwirken. Besonders gute Ergebnisse wurden bei einer erhöhten Temperatur von etwa 43°C, die etwa 3 Minuten lang gehalten wurde, erzielt. Der wichtigste Punkt, der bei Anwendung einer kurzzeitigen Beaufschlagung mit zusätzlicher Wärme realisiert werden soll, besteht darin, daß die Temperatur des Ansatzes auf die gewünschte Höhe angehoben und dann wieder auf die normale Hähe zurückgeführt wird, damit eine ausreichende Stimulierung der Synärese mit möglichst geringer Zufuhr von Wärme erzielt wird, da dadurch die Inaktivierung der milchsäureproduzierenden Bakterien durch Wärme so niedrig wie möglich gehalten wird.

Die kurzzeitige Beaufschlagung mit zusätzlicher Wärme wird vorteilhaft während der ersten I5 Minuten der Haltezeit durchgeführt, nachdem der Ansatz die maximale Erwärmungstemperatur erreicht hat. Jedoch kann man den tatsächlichen Zeitpunkt für die Beaufschlagung mit der zusätzlichen Wärme innerhalb der Haltezeit in Abhängigkeit von der Größe des Ansatzes, der Größe und Kapazität der Vorrichtung, usw. variieren.'

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Die nachfolgenden Beispiele dienen der nichtbegrenzenden Erläuterung der vorliegenden Erfindung, und es können darin beliebige Abänderungen hinsichtlich der eingesetzten Bakterien, der Zusammensetzung des Mediums und dergleichen durchgeführt werden, ohne daß dies die tatsächliche Erfindung beeinträchtigt.

Beispiel 1 - Zubereitung des Kultur-Filtrats

Eine Impfsubstanz mit Bacillus subtilis wurde in der Weise gewonnen, daß Organismen von einer schrägen Agarkultur auf ein steriles Saatmedium aus einem von dem biologischen Laboratorium Baltimore unter der Handelsbezeichnung Tryptiease Soy Broth erhältlichen Produkt (3*0 % Gewicht/Volumen), verstärkt mit Calciumchlorid (0,01 % Gewicht/Volumen) und mit 1,0 η HCl auf einen pH-Wert von 6,2 eingestellt, übergeführt wurden. Das Saatmedium wurde durch Einbringen von 100 ml des Mediums in JOO ml fassende Erlenmeyer-Kolben zubereitet. Das beimpfte Saatpräparat wurde in einem RotationsschUttler (5j1 cm Schub bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 125 UpM) 12 Stunden lang bei J>6 C geschüttelt. Nach dieser Inkubationszeit wurde die Saat in einer Menge von 2 % (Volumen/Volumen) zum Beimpfen eines Produktionsmediums eingesetzt.

Das Produktionsmedium wurde unter Verwendung von mit Wasser extrahier bar en Nährstoffen aus Weizenkeiinen zubereitet. Dazu wurde ein Slurry von Weizenkeimen (."5,0 % Gewicht/Volumen) und

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Wasser unter Druck bei 120⁰C 45 Minuten lang erhitzt. Dann wurde das Gemisch abgekühlt, man ließ es absitzen, und danach wurde .die klare überstehende Flüssigkeit abgezogen und mit Calciumchlorid (0,01 % Gewicht/Volumen) verstärkt. Das Medium wurde mit 1,0 η HCl so einregultert, daß nach dem Sterilisieren der End-ph-Wert 6,2 —0,1 betrug.

Das beimpfte Produktionsmedium wurde bei j56°C gehalten und mit einer Geschwindigkeit von 300 UpM in einem mit Prallblechen versehenen Fermentator mit 5^0 Litern Arbeitsvolumen gerührt. Mit einer Geschwindigkeit von 2 Litern je Minute wurde sterilisierte Luft zugegeben, und zur Unterdrückung des Schäumens wurden übliche flüssige Antischaummittel hinzugefügt. Man ließ das System sich entwickeln, bis eine maximale enzymatische Aktivität erreicht war (was mittels Milchkoagulationstests geprüft wurde), und diese Entwicklungszeitspanne lag im allgemeinen bei 12—1 Stunden. Die Kulturbrühe wurde dann durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren gereinigt, und es wurde gefunden, daß sie 2000 Einheiten an saurer Peptidase, 4740 Einheiten anneutraler Peptidase und I308 Einheiten an alkalischer Peptidase Je Milliliter der Brühe enthielt.

Beispiel 2 - Zubereitung von Kultur-Filtrat

Eine Impfsubstanz mit Bacillus subtills wurde in der Welse gewonnen, daß Organismen von einer schrägen Agarkultur auf ein steriles Saatmedium aus Trypticase Soy Broth (5,0 % Gewicht/ Volumen), verstärkt mit Calciumchlorid (0,01 % Gewicht/Volumen)

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und L-Leucin (0,01 % Gewicht/Volumen) sowie mit 1,0 η HCl auf einen pH-Wert von 6,2 eingestellt, übergeführt wurden. Das Saatmedium wurde durch Einbringen von 100 ml des Mediums in 300 ml fassende Erlenmeyer-Kolben zubereitet. Das. beimpfte Saatpräparat wurde in einem Rotationsschüttler (5,1 cm Schub bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 125 UpM) 12 Stunden lang bei 36⁰C geschüttelt. Nach dieser Inkubationszeit wurde die Saat mit einer Menge von 2 % (Gewicht/Volumen) zum Beimpfen eines Produktionsmediums eingesetzt.

Das Produktionsmedium wurde unter Verwendung von mit Wasser extrahierbaren Nährstoffen aus Weizenkeimen zubereitet. Dazu wurde ein Slurry von Weizenkeimen (3>0 % Gewicht/Volumen) und Wasser unter Druck bei 120⁰C 45 Minuten lang erhitzt. Dann wurde das Gemisch abgekühlt, man ließ es absitzen, und danach wurde die klare überstehende Flüssigkeit abgezogen und mit Calciumchlorid (0,01 % Gewicht/Volumen) und L-Leucin (0,01 % Gewicht/ Volumen) verstärkt. Das Medium wurde mit 1,0 η HCl so einreguliert daß nach dem Sterilisieren der End-pH-Wert 6,2 —0,1 betrug.

Das beimpfte Produktionsmedium wurde bei 36⁰C gehalten und mit einer Geschwindigkeit von 300 UpM in einem mit Prallblechen versehenen Fermentator mit 5*0 Litern Arbeitsvolumen gerührt. Mit einer Geschwindigkeit von 2 Litern je Minute wurde sterilisierte Luft zugegeben, und zur Unterdrückung des Schäumens wurden übliche flüssige Antischaummittel hinzugefügt. Man ließ das

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System sich entwickeln, bis eine maximale enzymatische Aktivität erreicht war (was mittels Milchkoagulationstests geprüft wurde), und diese Entwicklungszeitspanne lag im allgemeinen bei 12—1 Stunden. Die Kulturbrühe wurde dann durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren gereinigt, und es wurde gefunden, daß sie 23OO Einheiten an saurer Peptidase, 4l4O Einheiten an neutraler Peptidase und 9^7 Einheiten an alkalischer Peptidase je Milliliter der Brühe enthielt.

Beispiel 3 - Zubereitung von Kultur-Filtrat

Es xvurde wie in Beispiel 2 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde ein anderes Saatinedium verwendet. Dieses unterschiedliche Saatmedium enthielt 2,0 % (Gewicht/Volumen) einer Zubereitung aus Kasein, die von der Firma Delmar Chemical Ltd. unter der Handelsbezeichnung Totamine erhältlich ist, Calciumchlorid (0,01 % Gewicht/Volumen) und Kaliumdihydrogenphosphat (0,10 % Gewicht/ Volumen). Nach dem Sterilisieren betrug der End-ph/Wert 6,10 — 0,1. Alle andere Verfahrensstufen blieben unverändert, und die geklärte Kulturbrühe war im wesentlichen die gleiche, wie sie nach der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrensweise erhalten wurde.

Beispiel 4 - Zubereitung von Kultur-Filtrat

Ea wurde wie in den Beispielen 2 oder 3 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde ein modifiziertes Produktionsmedium verwendet, und zwar wurden ganze Weizenkeime in einer Menge von 1,25 % CGewicht/ Volumen) direkt in den Fermentator gegeben. Dadurch mirel© ΰ~2-~-.

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¹ . C-:

BAD ORIGINAL

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für die Extraktion der wasserlöslichen Nährstoffe erforderliche Erhitzungsstufe eliminiert. Alle sonstigen Bestandteile des Produktionsmediums blieben die gleichen. Die geklärte Kulturbrühe war im wesentlichen die gleiche, wie die nach der im Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise gewonnene.

Beispiel ^ - Zubereitung von KuItur-Piltrat Es wurde wie in den Beispielen 2, J oder 4 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde das Produktionsmedium in der Weise modifiziert, daß die Aminosäure L-Leucin fortgelassen und an deren Stelle Totamine (0,25 $ Gewicht/Volumen) verwendet wurde. Alle sonstigen Bestandteile des Produktionsmediums blieben die gleichen. Die geklärte Kulturbrühe war im wesentlichen die gleiche wie die gemäß der in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise gewonnene.

Beispiel 6 - Zubereitung von Kultur-Filtrat

Es wurde wie in den Beispielen 2, j5 oder 4 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde das Produktionsmedium in c3er Weise modifiziert, daß die Aminosäure L-Leucin fortgelassen und an deren Stelle Zein (0,25 % Gewicht/Volumen), eine Proteinfraktion aus Mais, verwendet wurde. Alle sonstigen Bestandteile des Produktionsmediums waren die gleichen. Die geklärte KuItürbrühe war im wesentlichen die gleiche wie die gemäß der in Beispiel2beschriebenen Arbeitsweise gewonnene.

- 25 -

1 0¹'·- ;■ / 1529

Beispiel 7 - Zubereitung yon Kultur-Piltrat

Es wurde wie in Beispiel ~j beschrieben gearbeitet, jedoch wurde das Produktiorismedium in der V/eise modifiziert, daß Weizenkeime fortgelassen und an deren Steile Reiskeimkonzenbrat (0,50 % Gewicht/VoLumen) eingesetzt wurde, Dieses Letztgenannte Produkt war von der Pirma Charles Bowman and Company, Ho LLand, Michigan, bezogen worden. AlLe sonstigen Bestandteile des ProduktLonsmediums bLieben unverändert, und die geklärte KuLturbrühe war im wesentlichen die gLeiche wie die gemäß der in Beispiel 2 beschriebenen Arbe i csweise gewonnene.

Beispiel 8 - Zubereitung von KuLtür-PiLtrat

Es wurde wie in Beispiel J5 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde der zuvor eingesetzte BaciLLus subtil is Stamm ersetzt durch Bacillus subtiiis A.T,C.C. Mo, 465. Alle sonstigen Produktlonsmaßnahmeri blieben unverändert, und die geüärte Kulturbrühe koagulierte in geeigneter Welse Milch, und es wurde ermittelt, daß sie alkalische Peptidase, neutrale Peptidase und saure Peptidase enthielt.

Beispiel 9 - Zubereitung von KuLtur-FLltrat

Es wurde wie in Beispiel ) beschrieben gearbeitet, Jedoch wurde anstelLe des zuvor eingesetzten Bacillus subtiiis Stammes BaciLLus subtiiis A,T.C,C, No, 605L verwendet, AlLe sonstigen Verfahrensmaünahrneri bleiben unverändert, und die geklärte Ku I. tür brühe koaguLLerte In geeigneter Weise Milch, und es konnte gezeigt werden, daß sie alkalische Peptidase, neutrale Peptidase und saure Peptidase enthielt. 1 O ^li i; ? ^fi / 1 B 2 9 ßAD ORIGINAL

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BeLspiel 10 - Zubereitung von Kultur-Filtrat

Es wurde wie in Beispiel ^ beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle des zuvor eingesetzten Bacillus subtiLls Stammes Bacillus subtilis A.T.C.C. No. 12432 verwendet. Alle sonstigen Produktionsmaßnahmen blieben unverändert, und die geklärte KuLturbrlihe koagulierte in geeigneter Welse MiLch, und es konnte gezeigt werden, daß sLe alkalische Peptidase, neutrale Peptldase und saure Peptidase enthielt.

Beispiel 11 - Zubereitung von fertigem Produkt

KuLturfiltrat wurde mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 4,9 -" 0,2 eingesteilt_fund die spezifische Leitfähigkeit wurde durch Zusatz von Natriumchlorid oder entionisiertem Wasser auf l800 — 100 Mikro-Siemens eingestellt. Das elnreguLlerte Piltrat wurde einem Ionenaustauseher-Adsorbans, vorzugsweise einer Säule aus kationischem Carboxymethylcelluloseäther, der mit 2 χ 10 molar Zinkchlorid und 2 χ 10 ^J molar Calciumchlorid äquilibriert war, aufgegeben. Die äquilibrlerte Säule hatte bei 22°C eine spezifische Leitfähigkeit von 1800 - 100

Mikro-Siemens, und der pH-Wert betrug pH 4,9 — 0,2. Zur Verstärkung der Enzym-Aktivitäten und -Stabilitäten wurden ZLnIt- und Calciumchloride zugesetzt.

Sowohl saure PeptLdase als auch neutrale PeptLdase wurden an der Zellulose adsorbiert, während negativ geLadenes Material

- 27 -

109825/1529

16A2640

(einschließlich rückständiger alkalischer Peptidase) und nichtgeladenes Material durch die Säule hindurchgingen. Etwa das zweifache Leervolumen an eingestelltem Filtrat wurde durch die Säule hindurchgegeben, das Piltrat enthielt ausreichende Menge an kationischem Material, um die reaktiven Stellen an der Zellulose abzusättigen. Dann wurde die Säule mit angesäuertem Wasser (pH k,9 — 0,2) mit einer spezifischen Leitfähigkeit von l800 — 100 Mikro-Siemens ausgewaschen. In dieser Reinigungsstufe wurden aus dem Säulenbett nichtadsorbierte Materialien ' entfernt. Danach wurde eine Eluierlösung aus 0,07 molar Natriumchlorid mit pH 5,8 - 0,2 durch die Säule hindurchgeleitet. Die zuvor gebundene saure Peptidase und neutrale Peptidase wurden als klare Lösung zurückgewonnen, und diese Lösung wurde dann bei einer Temperatur von 37°C und einem Druck von Jj6 mm konzentriert. Das Endkonzentrat hatte eine solche Beschaffenheit, daß nach Zugabe von Enzym-Stabilisatoren und mikrobiologischen Inhibitoren sowie Farbe und Geschmack hervorbringenden Mitteln etwa 85 g der Flüssigkeit eine ausreichende Aktivität aufwiesen, um k^k kg i Milch zu koagulieren.

Beispiel 12 - Gewinnung von asporgenen Mutanten durch ultraviolett Bestrahlung

Es wurde im wesentlichen die gleiche Arbeitsweise verwendet, wie sie von Takahashi im Journal of Bacteriology^ 89,29^ bis 298 (1965) beschrieben wurde. Kulturbrühen des Ursprungstamms von Bacillus subtilis wurden auf mit 0,01 % (Gewicht/Volumen) Calciumchlorid und 0,01 % (Gewicht/Volumen) L-Leucin verstärkter

28 - ifii;- ■; / 1 B?i

BAD ORtGlNAL

4 26 40

Trypticase Soy Broth gezüchtet. Nach 12-stündiger Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugieren aseptisch gesammelt.

Die Bakterienidigelchen wurden wieder in sterilem destilliertem

12 V/asser suspendiert, und man erhielt annähernd 3 χ 10 Zellen ,je ml. Jeweils 5 ml Teilmengen dieser Suspension wurden in sterile Petrishalen eingegeben. Dann wurden i» die Petrischalen 15 cm von einer 15 Watt ultraviolett Lichtquelle entfernt aufgestellt und der ultravioletten Bestrahlung J>O_}6Q und 90 Sekunden lang unterworfen. Ilach der Bestrahlung wurden die Proben JO Minuten lang im Dunkeln aufgestellt, und dann wurden sie serienweise verdünnt, und 0,5 ifll Teilmengen von geeigneten Verdünnungen wurden dann auf Agarplatten, die das Gewinnungsmedium (Siebung) enthielten, verteilt.

Als Gewinnungsmedium wurde der von Schaeffer, Dissertationsarbeit, 1961, Wissenschaftliche Fakultät der Universität Paris, Paris, Prankreich beschriebene Sporolationsagar eingesetzt. Dieser enthielt normalen Hähragar, verstärkt mit 0,025 % (Gewicht/Volumen) MgSO^TH₂O, 0,1 % (Gewicht/Volumen) KCl und 0,125 % (Gewicht/ Volumen) MnCIp *4HpO. Der pH-Wert dieses Agar-Mediums wurde auf 7/0 eingestellt. Wach Behandeln im Autoklaven bei 120⁰C während 20 Minuten wurden dem Medium aseptisch PeSO^(10 M Endkonzentration) und CaCl^(5 x 10 M Endkonzentration) zugesetzt. In diesem Medium entwickelte sich eine Farbdifferenz, wobei die sporenden Kolonien eine weiße Färbung aufwiesen, während das Ar-porulans (das sind die nichtsporenden Kolonien) eine braune Farbe hatten. Dadurch hatte man eine schnelle Methode für die k ti on von aoporu] anteil Mutanten zur Hand.

,.,, -29"- 1S^!5 /1529

16 4 26

Beispiel 13 - Gewinnung von asporgenen Mubariben durch Neutra1-AcrlfLav Ln

Es v/urde Lm we£sentLLcheri so gearbeitet,, wie dLes von RogoLsky und flLepeckey, BLochern, and BLophys. Res, Comm 16 204 - 208 (196-1·) bes ehr Leben worden ist, Kulturen des Haupts tammes von Bacillus subtLLLs wurden 12 stunden lang auf dem zuvor beschrLebenen und verstärkten Medium von Tryptioasis Soy Broth gezüchtet. Es wurden anbisepbisch ausgewaschene Zellen dieser Kulturen zum Beimpfen eines modifizierten tfpLzisen-Mlnimal-Medium verwendet. Dieses letztgenannte Medium" enthleLt: l,^l\- % (Gewicht/VoLumen) K^IIPO^, 0,6 ;t (Gewicht/Volumen) KilgPO^, 0,2 % {Qe-vilchfc/Volumen) (HH_2j^)_pS0^, 0,1 fo (Gewicht/Volumen) CgH₅ Ma-O₇ '2H₂O, 0,02 % (Gewi ch b/Vo Lumen) Mg30^ *7H_;)C)·, 0,002 fo Hefeexbrakb und 0,02 \i PüpGona, eLngestalLt auf pH 7,6 und bei 120⁰C 20 Minuten lang Im Autoklaven behändeLt, Nach der Behandlung Lm Autoklaven wurde dem Medium antiseptisch sterlLe Glukose (0,5 % Cfewicht/Vo Lumen Eridkonzenbrab Lon) zugesetzt,

Heutral-Acrlflavln v/urde den sich entwickelnden Kulturen in dem oben angegebenen MLnimai-fledLum wahrend der logarithmischen Phase zugesetzt, und die Endkonzentrat ionon dLeses Mutagens betrugen 6,0/U ,je ttiL, Die KoLnen wurden naoh Zusatz von Acr'LfL-ivLn i'A iitunderi Lang --^snhiit, ta L^, D-ina^h wurden SfU'LiiiiweLse VerdUrmunr.en h';rge;ii,5:L 1.0, und 0,S ml dor Je;/»! Lirtin Verdilnnungen v/urden auf dus .«}?;·,/Lnriunrfjmi.'diiuii HUfg5ibr^;i'-ht, in ; aspotuLanteri Mutanb=:ri wur'diui wie In BüüjpLel Id bHsc;hrI.i.'be;n i.iio

1 0 a c : ^rJ /15 2 9

1 6 A 2 6 4 Q

In Tabelle III sind die Spektren der Peptidase angezeigt, die sowohl für den UrSprungsstamm aLs auch für die asporogenen Kulturen von Bacillus subtilis, die auf Weizenkeim- und Calclumchlorid-Medium gezüchtet worden waren, veranschaulicht.

Tabelle EEI

A Peptidase-Spektren, hergestellt nach 12-stündiger Züchtung auf dem Produktionsmedium von Ursρrungsstamm und mutiertem iJtamm von Bacillus subtilis,
Die Aktivitäten sind als ELriheLten je ml des Filtrates angegeben.

Saure Neutrale Alkalische;

Organismus Peptidase Peptidase Peptidase

Bacillus subtilis (Ursprungsstamm) 2000 4γ4ο 1308

Eiaclllus subtilis (Asporulans-

Stamm) 2075 4 680 Spur

Beispiel 14 - Zubereitung von Kultur-Piltrat (unter Verwendung von Asporulans Mutant)

Eine Impfsubs tanz mit einem asporulantem Stamm von Bacillus subtilIs wurde in der Weise gewonnen, daf3 Organismen von einer schrägen Agarkultur auf ein steriles Saatmedtum aus ;>,C) ;i Trypt.Lcase Soy Broth (GewLcht/VoLumen), verstärkt mit 0,01 ;·» Calciumchlorid (GewLoht/Volumein) und 0,OL # L-Leucin (Gewicht/ VoLumen), mit L,0 η HCl auf einen pH-Wert von 6,2 eingestellt,

109 i. i B/1529 ^&AD

16A264Q

übergeführt wurden. Das Saatmedium wurde durch Einbringen von 100 ml des Mediums in JOO ml fassende Erlenmeyer-Kolben zubereitet. Das beimpfte Saatpräparat wurde in einem Rotationsschüttler (5,1 cm Schub bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von I25 UpM) 12 Stunden lang bei 36⁰C geschüttelt. Nach dieser Inkubationszeit wurde die Saat in einer Menge von 2 % (Volumen/ Volumen) zum Beimpfen eines Produktionsmediums eingesetzt.

Das Produktionsmediiim wurde durch Extraktion der wasserlöslichen Nährstoffe aus Weizenkeimen zubereitet. Dazu wurde ein ^>,0 #iger (Gewicht/Volumen) Slurry von Weizenkeimen und Wasser unter Druck 45 Minuten lang bei 12O⁰C gekocht. Das Gemisch wurde dann abgekühlt, man ließ es absitzen, und danach wurde die klare überstehende Flüssigkeit abgezogen und mit 0,01 % Calciumchlorid (Gewacht/Volumen) und 0,01 % L-Leucin (Gewicht/Volumen) verstärkt. Das Medium wurde mit 1,0 η HCl so einreguliert, daß nach dem Sterilisieren der End-pH-Wert 6,2 — 0,1 betrug.

Das beimpfte Produktionsmedium wurde bei 36⁰C gehalten und mit einer Geschwindigkeit von JOO UpM in einem mit Prallblechen versehenen Permentator mit 7*5 Litern Gesamtvolumen gerührt. Mit einer Geschwindigkeit von 2 Litern je Minute wurde sterile Luft zugegeben, und zur Unterdrückung des Schäumens wurden übliche flüssige Antischaummittel zugefügt« Man ließ das System nich entwickeln, bis eine maximale enzymatisch© Aktivität erreiche war (was mittels Milchkoagula ti ons tests geprüft wurde.),

BADORIGiNAU

1 64-0

und diese Entwicklungszeitspanne lag im allgemeinen bei 14 — 1 Stunden. Die Kulturbrühe wurde dann durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren geklärt.«

Beispiel 15 - Zubereitung von Kultur-Filtrat

Es wurde wie in Beispiel 14 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde das Produktionsmedium in der Weise modifiziert, daß die Aminosäure L-Leucin fortgelassen und durch 0,25 $ (Gewicht/ Volumen)eines Präparates aus Kasein, das unter dem Handelsnamen Totamine von der Firma Delmar Chemical Ltd. erhältlich ist, eingesetzt wurde. Alle sonstigen Bestandteile des Produktionsmediums blieben die gleichen. Die geklärte Kulturbrühe war im wesentlichen die gleiche wie die gemäß der in Beispiel 14 beschriebenen Arbeitsweise gewonnene.

Beispiel 16 - Zubereitung von Kultur-Filtrat

Es wurde wie in Beispiel 14 beschrieben gearbeitet, jedoch mit dem Unterschied, daß das Produktionsmedium in der Weise modifiziert wurde, daß die Aminosäure L-Leucin fortgelassen und durch Zein (0,25 % Gewicht/Volumen), einer Proteinfraktion aus Mais, einsetztwurde. Alle sonstigen Bestandteile des Mediums blieben die gleichen. Die geklärte Kulturbrühe war im wesentlichen die gleiche wie die gemäß der in Beispiel 14 beschriebenen Arbeitsweise gewonnene.

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1-0 n.-'.'h/.15 2.9

\ 16Α26Λ0

. -33-

In der nachstehenden Tabelle IV 1st das Spektrum einer Peptidase angegeben, die dadurch gewonnen wurde* daß ein mutierter Stamm von Bacillus subtilis auf einem mit L-Leucin verstärkten Medium aus Weizenkeimen und Calciumchlorid gezüchtet worden war,

Tabelle. ...Iy . ■

Peptidase-Spektrum, gewonnen nach 12-stündIgem Züchten auf dem Produktionsmedium,
Die Aktivitäten sind als Einheiten je ml des Filtrates angegeben.

Saure Peptidase Neutrale Peptidase Alkalische Peptidase 2,350 Ψ ,775' Spuren

Während der routinemäßigen Hersteilung des KuI turf11 brates war stets eine Lage an Produkfcausbeute mit SporuLabionsanfalL ge- ^ koppelt, Aus Tabelle III kann man erkennen, daß, obgleLch die unerv/linschte alkalische Peptidase v;e it gehend unterdrückt ist, geringer Äusbeutegewinn an sauren und neubraLen Peptidasen■ nach 12-stündiger Züchtung vorhanden 1st, Da die EntwLcklimgszeibspan» ne nicht mehr' durch Sporn la tion begrenzt ist, war es jedoch möglich, diese Zeitspanne weitere awöi Stunden auazudehneri,. bevor eine Lage an Prodiikfcauabaute abgenommen wurde, Während dieser kritischen Zeitspanne erfoLgte eine 8-fache Zunahme der Koagulattonsak-tivib-üb bei den gewonnenen Peptidasen,

1 0 9 ή 1 ^v> I \ δ 2 9

1 6A264Q

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Bisher wurden nach 12-stündiger Züchtung 0,40 ml des rohen KuI-turfiltrates zum Koagulieren von 10,0 ml angesäuerter entrahmter Milch bei j56 C benötigt. Durch die ausgedehnte Züchtungsphase, verbunden mit dem asporulanten Stamm, wurde ein rohes Ku1turf11-trat mit verstärkter Koagulationsaktivität gewonnen, und es waren 0,05 ml des Filtrates ausreichend, um unter den oben'angegebenen Bedingungen 10,0 ml Milch zu koagulieren,

Beispiel 17 - Vergleich der Proteolyse

Der besondere Vorzug des erfindungsgemäßen Enzymkomplexes, der wie zuvor beschrieben gewonnen worden war, wurde weiterhin durch Vergleichsuntersuchungen demonstriert, Diese wurden mit Kasein-Produkten, die mit verschiedenen Koagulationspräparaten gewonnen worden waren, durchgeführt. Unter gleichen Bedingungen hinsichtlich Zeit, Temperatur, pH-Wert und dergleichen wurden vier Enzympräparate eingesetzt, um einzelne Milchproben zu koagulieren. Nach dem Zentrifugieren der Proben (wie zuvor beschrieben) wurde die Molke von jeder Probe gesammelt. Es wurden die in jeder Molkefrakbion enzymatisch freigesetzten Aminosäuren bestimmt, und die erhaltenen Werte sind in der nachfolgenden Tabelle II aufgeführt:

164264Q

Tabelle II

Aminosäure in Molke (Werte in ppm)

Molke-Frakti onen

(D

Labferment- Enzymextrakt komplex Pepsin Trypsin

Asparaginsäure	0 ■	2	0	68
Threonin	0	• 1	; ; ' 2	22 ■
Serin	1	1	"5	1S
Glutaminsäure	19	27	51:	74
Prolin	2	■■■.■■ 4	6	17
Glycin	4	2	13	19
Alanin -	1	1	;;■-■:-- 5	22
Valin	2	0	2	78
Isoleucin	1	. 11	' 1	69
Leucin	■ . ι ' ■	1	2	302
Tyrosin	0	" 1	2	280
Phenylalanin	1	0	1	395
Lysin	3	10	8	259
Histidin	0	0	■ ·. 2	21
Arginin	1	0	6	234
Gesamtmenge an Aminosäuren	36 ■■,	61	106	1875

(1) Die ausgewählten Enzymaktivitäten waren ausreichend, um 10 ml Milch in etwa 1 Minute zu koagulieren«

-ΟίΚ-ν 5/-15 2-

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- 36 - .- _,- ■■■-■■ :

(breakdown products) Von den 15 Aminosäuren, die als enzymatische Produkte/von Kasein bestimmt wurden, produzierte der erfindungsgemäße Enzymkomplex weniger Aminosäuren als Pepsin. Das Gesamtspektrum an Aminosäuren, das von dem erfindungsgemäßen Enzymkomplex produziert wurde, kommt, wie man sieht, dem von tierischem Labferment produzierten sehr nahe.

£ Beispiel 18 - Herstellung von Käse (Versuchsmaßstab)

Pasteurisierte Vollmilch (72,8 Liter) wurde auf. ?1 + 1°C erhitzt. Nachdem diese Temperatur-erreicht worden--war, wurde eine Käse-Ansatzkultur (0,5 bis 1,0 % Volumen/Volumen) hinzugegeben, und ' das Gemisch wurde gut durchgerührt. Man ließ den Änsatzorganismus sich entwickeln, bis die Acidität der Milch 0,17 %s berechnet als Milchsäure, erreicht, hatte. Zu diesem Zeitpunkt wurden 15 ml von konzentriertem Enzymkomplex gemäß der vorliegenden Erfindung zugegeben. Die Mischung wurde gut durchgerührt, und dann ließ man sie unbedeckt und ohne zu bewegen 25 bis 3>0 Minuten in einem ummantelten Behälter stehen.

Dann wurde die koagulierte Milch mit einem Quarkmesser geschnitten, und es wurde nach der üblichen Arbeitsweise für die Zubereitung von Cheddar-Käse^ weiter verfahren. Nachdem Pressen wurde der fertige Käse in eine auf einer Temperatur von 12 + 2⁰C gehaltene und eine relative Luftfeuchtigkeit von 70 bis 75 % aufweisende Reifungskammer eingestellt. Man ließ die Käse über Zeiten von 1 bis 18 Monate reifen, und eine Bewertung der Käse nach verschie-

" - " 1098^5/1529

denen Zeitspannen ergab, daß sie den üblichen Geschmack und die übliche Textur von Cheddar-Käse hatten,

Beispiel 19 - Zubereitung von Käse (halbtechnischer Maßstab) Es wurde wie in Beispiel 18 beschrieben gearbeitet, jedoch wurden 455 Liter pasteurisierte Vollmilch mit 85,2 ecm konzentriertem Enzymkomplex gemäß derVorliegenden.Erfindung koaguliert. Während * der Cheddar-Zubereitung wurde beobachtet,, daß der Quark eine sehr wünschenswerte glatte seidige Textur aufwies und auch eine hervorragende Art von Quarkbruch auftrat, Nach dem Abpressen wurde die Ausbeute an Käse berechnet, und es wurde gefunden, daß zwischer den oben beschriebenen Käseprodukten und den mit Labferment gewonnenen Kantrollprodukten keine merkliche Differenz bestand. Die Käse wurden" 90 Tage lang reifen gelassen; die Käseprodukte, die mit dem erfindungsgemäßen Enzymkomplex hergestellt worden waren, besaßen normalen Cheddar-Geschmack und -Textur^ verglichen mit den Kontroll-Käse-Produkten. ·

Beispiel 20 -(Herstellung von Käse - Versuchsmaßstab) Vollmilch, die-etwa 3Λ% B'ett enthielt, "wurde pasteurisiert und abgekühlt, 72,6 kg dieser Milch, wurden in einen mit einem Dampfmantel versehenen Behälter einer Kapazität von 90 kg eingebracht, und die Temperatur der Milch wurde auf Jl⁰C erhöht, Es wurden 1 I/2 fo (Gewichtsprozent) gebräuchlicher, im Handel erhältlicher Ausgangs-Kultur hinzugegeban., und man ließ die Milch reifen, bis eine Aclditätszuriahme von etwa O₃Ol bis 0,02 % erfolgt war, wozu

-«& _Q 109825/1529

1 6 4 2 6 4 Q

■■; ■:■ ■ ■ ^: - 38 - :-■■■ "■' :■ :■;■;■. . .■;;; ν

etwa JO Minuten benötigt wurden, Nach der Säureentwicklung .wurden der Milch 15j0 ml eines Peptidase-Komplexes zugesetzt. Der Peptidase-Komplex war ein Komplex aus neutraler Peptidase und saurer Peptidase, der von dem Bakterium Bacillus, subtilis gewonnen worden war und eine solche Aktivität hatte, daß 85,2 ecm davon 454 kg Milch zu koagulieren vermochten. Es erfolgte Koagulation, und es wurde ein festes Koagulat produziert.

Nachdem die Milch ausreichend koaguliert war, wurde sie mit Quarkmessern, in Würfel'.mit 0,64 cm Kantenlänge geschnitten. Der geschnittene Quark wurde langsam gerührt, um ein Brechen und eine Mattenbildung der weichen Teilchen zu verhindern, Die Kochstufe wurde 10 Minuten nach dem Schneiden begonnen, und Quark und Molke wurden innerhalb einer Zeitspanne von etwa 30 Minuten auf 39 C " erwärmt. Während der Haltezeitspanne wurde eine Temperatur von; 39⁰C aufrechterhalten, bis die Acidität um etwa 0,01 - 0,015 % angestiegen war. Dazu war eine zusätzliche Zeit von etwa₌ 25 Minuten erforderlich.

Nach der Aciditatszunahme wurde wieder Dampf in den Mantel eingebracht, und die Temperatur des Quarkes und der Molke wurde innerhalb etwa 5 Minuten auf 42⁰C erhöht, Die Temperatur vmrde 10-Minuten lang bei 42⁰C gehalten, danach wurde Kühlwasser in den Mantel eingefüllt, und die Temperatur des Behälters wurde innerhalb von etwa 5 Minuten auf 39°C eingestellt, Nachdem der Quark-fest und trocken war, hatte sich die Acidität um 0,03 % erhöht, und dann

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. . 164264Q

ließ man absitzen·. Danach wurde die Molke abgezogen/¹ und es wurde in üblicher Weise die Cheddar-Zubereitung vorgenommen. Der resultierende Käse hatte eine ausgezeichnete Textur und wies einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 35 % auf* ■

Beispiel 21 -.(Herstellung von.Käse - halbtechnischer Maßstab) Vollmilch, die etwa 3,4 % Fett enthielt, wurde pasteurisiert und .gekühlt. 318 kg dieser Milch wurden in einen rechteckigen, mit einem Dampfmantel ausgerüsteten Käse-Behälter mit einer Kapazität von 454 kg eingepumpt, und die Temperatur der Milch wurde auf 3I⁰C eingestellt« 1 1/2 % (Gewichtsprozent) gebräuchlicher, im Handel erhältlicher Ausgangskultur wurde zugegeben, und man ließ die Milch reifen* bis eine Aciditätszunahme von etwa OiOl - 0,02 $ stattgefunden hatte, was in etwa >0 Minuten erreicht wurde. Nach dieser Entwicklung wurden der Milch 59.»6 ecm des in Beispiel 20 verwendeten Peptidase-Komplexes zugegeben. Es erfolgte Koagulation, und es wurde ein festes Koagulat produziert. .

Nachdem die Milch ausreichend koaguliert war, wurde sie mit Quarkmessern in Würfel mit 0,64 cm Kantenlänge geschnitten. Der geschnittene Quark wurde langsam gerührt, um Brechen und Mattenbildung der weichen Teilchen zu vermeiden. Die Kochstufe wurde 10 Minuten lang nach dem Schneiden angesetzt, und der Quark und die Molke wurden innerhalb einer Zeitspanne von etwa 30 Minuten auf 39°C erhitzt. Während der Haltezeitspanne wurde eine Temperatur von 39⁰C aufrechterhalten, bis eine Aciditätszunahme von etwa 0,01 - 0,02$.

1 0 9 V7 BV 1 5 2 9

ierf olgt· war, was eine zusätzliche Zeit von «etwa 30 Minuten erforderte..

Nachdem die Azidität angestiegen war, wurde der Dampfmantel erneut mit Dampf beaufschlagt, und die !Temperatur des Quarkes und der Molke wurde innerhalb von etwa' 5 Minuten auf 43°C erhöht. Die Temperatur wurde etwa 3 Minuten auf 43°e gehalten;, danach wurde KShI-wasser in den Mantel eingebracht, und die Temperatur des Behälter-

ο inhaltes wurde innerhalb von etwa 7 Minuten auf 39 C gesenkt.

Nachdem die Acidität um 0,03 % zugenommen und der Quark fest und trocken geworden war, ließ man ihn absitzen. Dann wurde die Molke abgezogen, xind es wurde wie beim üblichen Cheddar-Verfahren weitergearbeitet. Der resultierende Käse hätte eine ausgezeichnete Textur und wies einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 35 ^ auf.

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- 41 ■-.

Claims (1)

1. T6A264Q

   - 41 Patentansprüche

   1. Bakteriell hergestellter Peptidase-Enzym-Komplex mit hoher Milchkoagulationsaktivität und geringer proteolytischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß der Enzymkoraplex eine saure Peptidase und eine neutrale Peptidase enthält und im wesentlichen frei von alkalischer Peptidase ist.

   2. Enzymkomplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er von einem Bakterium der Art Bacillus gewonnen ist.

   j5. Enzymkomplex nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er von einem Bakterium eines Stammes der Species Bacillus subtilis gewonnen ist.

   4. Enzymkomplex nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß darin das Mengenverhältnis von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase im Bereich zwischen etwa 1:0,5 bis 1:5*0 liegt.

   5. Enzymkomplex nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß darin das Mengenverhältnis von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase im Bereich zwischen etwa 1:2,0 bis l;j5,0 liegt.

   42 - 10 98 25/1 5 29

   164284:0

   6. Enzymkomplex nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß darin wenigstens ein einwertiges Metallion und wenigstens ein zweiwertiges Metallion zusätzlich vorhanden sind.

   7. Verfahren zur Herstellung eines Enzymkomplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 aus saurer und neutraler Peptidase, der eine hohe Milchkoagulationsaktivität und eine geringe proteolytische

   m Aktivität aufweist, und wobei ein Kohlenstoffquellen, stickstoffhaltiges Material und essentielle Spuren an Nährstoffen und anorganischen Salzen enthaltendes Medium mit einem Bakterium beimpft wird, das wenigstens eine saure Peptidase und neutrale Peptidase zu produzieren vermag, undman die Entwicklung stattfinden läßt, bis eine ausreichende Menge an Enzymkomplex produziert, ist, und danach die gebildeten Enzyme extrahiert, dadurch gekennzeichnet, daß man alle alkalische Peptidasen-, die vorhanden sind, praktisch vollständig entfernt, inhibiert oder inaktiviert.

   8. Verfahren nach Anspruch 7* dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium ein solches der Art Bacillus einsetzt.

   9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als BakteriumeimStamm der Species Bacillus subtilis einsetzt.

   10. Verfahren nacft einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gdcennzeichnet, daß man die alkalische Peptidase durch Ionenaustauscherchromatographie entfernt.

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   - 4J5 -.■■;■■

   . . ■■ 1:842640

   11, Verfahren nach -einem der Ansprüche 7 Ms'f, dadurch, gekennzeichnet, daß man die alkalische Peptidase durch Zugabe eines In-Oiitoitors Inhibiert»

   12. . Verfahren nach einem der Ansprüche 7 Ms 9, dadurch gekennzeichnet, daß. man die alkalische Peptidase durch thermische Denaturierung inaktiviert.

   15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 1^.» dadurch gekennzeichnet.., daß. man als Bakterium einen asporolanten Mutanten der Art Bacillus einsetzt.

   14» Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 1*5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wenig fermentierbaren Stickstoff ja.nd Kohlenhydrat enthaltendes Medium einsetzt. ·

   1-5·· Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man Bis Medium ein Weizenkeim-Medium einsetzt.

   16. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium einsetzt, das mit Gälciumionen angereichert ist.

   17. Verfahren nach Anspruch I5 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium einsetzt, das mit L-Leuein angereichert ist.

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   18» ■ Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis VJ, dadurch gekennzeichnet* daß man ein Medium einsetzt, das mit Mangan, Magnesium und Phosphat angereichert ist.

   19. Verfahren zur Herstellung von Käse durch Koagulieren von Milch und Zusatz eines Enzyms dazu, dadurch gekennzeichnet, daß man als koagulierendes Enzym einen bakteriell hergestellten Peptidase-Enzym-Komplex mit hoher milchkoagulierender Aktivität und geringer proteolytischer Aktivität, der eine saure Peptidase und eine neu-

   ™ trale Peptidase.enthält und praktisch frei von alkalischer Peptidase ist, einsetzt.

   20. Verfahren zur Herstellung von Cheddar-Käse durch QuarilMldung, geeignetes Reifenlassen der Milch durch die Aktivität eines aus saurer und neutraler Peptidase bestehenden Enzymkomplexes, Absetzenlassen und Schneiden des Quarks, Erhitzen des geschnittenen Quarks auf eine Temperatur von etwa 29 bis 4O⁰G, Halten des Quarks' auf dieser maximalen Erhi tzungs temperatur, Trennen des Quarks von

   fe der Molke, Cheddar-Zubereitung, Salzen, Pressen und schließlich Härtenlassen des Quarks, dadurch gekennzeichnet, daß man während eines Teiles der Haltezeit zusätzlich Wärme aufgibt, und dabei die Temperatur des Quarkes und der Molke schnell auf etwa 4o,5 bis 46 C erhöht und diese Temperatur für eine zur Stimulierung der Synerese ausreichende Zeitspanne aufrechterhält.

   21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man, nachdem die Temperatur von etwa 40,5 bis 46⁰C über die gewünschte Zeitspanne aufrechterhalten worden ist, schnell, auf die normale 'Erhitzungstemperatur abkühlt. 109825/1529

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   '22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man einen von einem Bakterium der Art Bacillus gewonnenen Enzymkomplex verwendet. -

   23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man einen von dem Bakterium eines Stammes der Species Bacillus subtilis gewonnenen Enzymkomplex verwendet.

   24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Enzymkomplex verwendet, in dem das Mengenverhältnis von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase im Bereich zwischen etwa 1:0,5 bis etwa 1:5,0 liegt.

   25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Enzymkomplex verwendet, bei dem das Mengenverhältnis von saurer Peptidase zu neutraler Peptidase im Bereich zwischen etwa 1*2,0 zu etwa 1:3,0 liegt.

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