DE2524822C3 - Neutrale Protease, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zum Aufschluß von animalem Gewebe und zur Suspensionszellkultur - Google Patents

Description

2. Verfahren zur Herstellung der neutralen Protease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Bacillus polymyxa ATCC 21993 unter aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Nährmedium bei Temperaturen von 20 bis 37° C und pH-Werfen von 5 bis 8 züchtet, die Protease aus der Gärniaische abtrennt und nach üblichen Methoden reinigt.

3. Verwendung der neutralen Protease gemäß Anspruch 1 zum Aufschluß von animalem G ewebe und zur Suspensionszellkultur.

Die Verwendung von Zellkulturen bei der Arbeit mit menschen- und tierpathogenen Virusarten hat neben der Molekularbiologie der Virologie den größten Stimulus in den letzten Jahren gegeben. Mit Hilfe von Zellkulturen konnten nicht nur zahlreiche neue Einblikke in die Biologie einer Virusinfektion gewonnen werden, es sind darüber hinaus auch bedeutende Fortschritte auf den Gebieten der Epidemiologie, Pathogenese, Diagnose und Bekämpfung der durch Viren hervorgerufenen Erkrankungen bei Mensch und Tier erzielt worden. Die Produktion und Anwendung wirksamer und ungefährlicher Impfstoffe unter Verwendung von Zellkulturen charakterisieren diese Entwicklung am treffendsten.

Der entscheidende Fortschritt für die Zellzüchtung und damit für die Züchtung von Viren in Zellkulturen war die Einführung der Trypsinierungstechnik durch MosconaundMoscona-Schon 1916hatten Peyton R ο u s und F. S. J ο η e s versucht, Explantatkulturen mit Trypsin zu behandeln. Die nach Trypsinierung erhaltenen Zellen und Gewebefragmente vermehrten sich auf einer neuen Plasmakultur. Diese Beobachtung wurde durch V ο g e I a a r und Ehrlichman bestätigt, denen es gelang, Zellen mit Trypsin von der Unterlage aus sogenannten Rollerkulturen abzulösen und sie weiter zu vermehren.

Die Bedeutung dieser Versuche wurde jedoch erst in dem Augenblick klar erkannt, als man durch Behandlung von Geweben mit 3prozentigem Trypsin (in einer physiologischen Salzlösung ohne Calcium- und Magnesiumionen) Einzelzellen erhielt, die nach Aussaat wieder zu einem geschlossenen Zellrasen auswuchsen. Jetzt griffen Dulbecco, Frisch und Jenthoff, Youngner, Chang und R i η a I d i η i sehr schnell nacheinander die Trypsinierungstechnik auf, entwickelten sie weiter zur quantitativen Züchtung von Zellen und schließlich zur »Einschlicht«- oder »Monolayerkultur«. Die Möglichkeit, größere Zellmengen aus frischem Gewebe durch wiederholte Trypsinandauung zu isolieren und dann direkt auf der Glasoberfläcrie zur Vermehrung zu bringen,, hat zusammen mit der Verwendung von Antibiotika die Methodik wesentlich vereinfacht und der Zellzüchtung einen starken Auftrieb gegeben. Besonders gut eigneten sich derartig gezüchtete »Monolayers« für die Virusvermehrung, die durch den dabei auftretenden cytopathischen Effekt in einfacher Weise kontrolliert werden konnte.

Gleichzeitig mit der Trypsinierungstechnik wurde die Suspensionszellkuitur entwickelt. Hierbei werdein ZeI-len durch ständige Bewegung in Su-pension genalten, wodurch man wesentlich höhere Zellzahlen erhält als bei stationären Kulturen. Diese Suspensionski Ituren bewiesen darüber hinaus, daß für die Vermehrung von Zellen ihr Festsetzen an der Glasoberfläche nicht notwendig ist

Die enzymatische Aufschließung von animalem Gewebe ist mit Proteasen versucht worden. Am häufigsten wird heute Trypsin verwendet. Bei der Wärme- oder Kurzzeittrypsinierung nach R a ρ ρ a port wird die Trypsinierung kurzzeitig bei 37°C durchgeführt. Durch das hochaktive Enzym werd;;n die Zellen aus der Matrix herausgelöst. Bei der Kälte oder Langzeittrypsinierung nach B ο d i a η erfolgt die Trypsinierung bei Temperaturen von 4 bis 6⁰C. Elei 'dieser

•>5 Temperatur geht der Gewebeaufschluß nur sehr langsam vor sich, und es; muß entsprechend länger trypsiniert werden.

Neben Trypsin kann Pancreatin, Elastase, F'apain oder Hyaluronidase eingesetzt werden, Kollagenase

ho und Pronase, eine von Streptomyces gebildete bakterielle Protease, sind ebenfalls für den Zellaufschluß verwendet worden; vgl. Ä. Mayr, et al., Viroiojnsche Arbeitsmethoden, Bd. I, Günter Fischer Verlag, Stuttgart, 1971,Seiten43 bis 73.

h'i Zur selektiven Züchtung von speziellen Zellen, die in einem Gewebe vorkommen, wurden auch verschiedene Enzyme und Kationenabspalter (Komplexbildner, chelating agents) eingesetzt. Rap ρ a port et al. veiwen-

deten Natriumtetraphenyiborat, einen Komplexbildner für Kaliumionen, zur Äufsdiließung von Mäuseleber und zur Herstellung von Leberparenchymzellen. L a s f a r q u e s stellte eine Gruppe von Epithelzellen durch Langzeitbehandlung von Brustdrüsengewebe einer Maus mit bakterieller Kollagenase her. Hierbei werden die Zellen des Bindegewebes geschädigt.

Abgesehen von Pronase und Kollagenase werden die vorgenannten Enzyme aus tierischen Quellen gewonnen. Diese Enzyme sind daher hinsichtlich ihrer Herkunft beschränkt und schwierig zu isolieren. Deshalb sind sie ziemlich teuer. Außer den vorgenannten allgemeinen Nachteilen hat Trypsin den Nachteil, daß Zellklumpen verbleiben, daß es durch Serum inhibiert wird, sein pH-Optimum relativ eng ist, nämlich in einem pH-Bereich von 7,2 bis 7,4 liegt, daß es beim Inkubieren rasch desaktiviert wird und bei einer bestimmten Trypsinkonzentration die Zellen geschädigt werden. Die Verwendung von Kollagenase ist auf Gewebe beschränkt, die Kollagen enthalten. Ferner besteht die Gefahr, daß rohe Enzyme aus tierischen Zellen Mycoplasmen enthalten. Pronase hat den Nachteil, daß es häufig von unterschiedlicher Qualität ist, was sich auf die Reproduzierbarkeit ungünstig auswirkt Ferner wurde beim Arbeiten unter bestimmten Bedingungen auch Zellschädigung beobachtet.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Enzym zu schaffen, das sich zum Aufschluß von animalem Gewebe und zur Suspensionszellkultur eignet, ohne die vorstehend beschriebenen Nachteile aufzuweisen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstände.

Nach beendeter Züchtung werden die Bakterienzellen aus der Gärmaische abgetrennt. Es wird eine Proteaselösung erhalten, aus der nach üblichen Methoden das Enzym isoliert wird, beispielsweise durch Aussalzen, Fällung mit einem Lösungsmittel oder Konzentrieren unter vermindertem Druck. Der größte Teil der aktiven Protease wird durch Aussalzen der konzentriert-η Proteaselösung mit 60- bis 80prozentig gesättigter Ammoniumsulfatlösung ausgefällt. Die Ausfällung kann auch mit 75prozentigem Methanol, 70prozentigem Äthanol, 60prozentigem Aceton oder 70prozentigem Isopropanol durchgeführt werden. In diesem Fall beträgt die Ausbeute an aktiver Protease 88%, 80%, 70% bzw. 75%. Die erhaltene rohe Protease kann bei einer Temperatur von 5°C und einem pH-Wert von 4 bis 9 während etwa 7 Tagen ohne nennenswerten Stabilitätsverlust aufbewahrt werden. Das gleiche ist der Fall bei 24stündiger Lagei r.vng bei 27° C.

Nachstehend sind die wichtigsten chemischen und physikalischen Eigenschafton der Protease der Erfindung zusammengestellt.

(a) Funktion:

Die Protease wirkt als neutrale Protease.

(b) Substratspezifität:

Die Protease hat eine milde proteolytische Aktivität gegenüber Casein.

(c) pH-Aktivitätsoptimum und Stabilitätsbereich:

Das pH-Optimum der pföUälytisehcn Aktivität gegenüber Casein liegt bei 8,5; die Protease ist im pH-9ereich von 4,0 bis 9,0 sehr stabil.

(d) Aktivitätsbestimmung:

Die Bestimmung erfolgt nach der Methode von A η so η und wird ausgedrückt in Einzelheiten Hämoglobin.

(e) Aktiver Temperaturbereich:

Die Protease zeigt Aktivität im Temperaturbereich von 20 bis 75°C, Das Temperaturoptimum liegt bei 6O⁰C.

(f) Bedingungen der Inaktivierung durch den pH-Wert und die Temperatur:

Die Aktivität geht bei einem pH-Wert von unterhalb 3,0 und oberhalb 10,0 vollständig verloren. Ferner erfolgt ein irreversibler Aktivitäts-

in verlust durch lOminütiges Erhitzen auf 65°C.

(g) Hemmung und Aktivierung:

Die Aktivität wird durch Kationenabspalter, wie Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), Citronensäure, o-Phenanthrolin, 2,2'-Dipyridyl und Natrium-

i fluorid, sowie durch Oxidationsmittel, wie N-Brom-

succinimid (NBS) und Jod, gehemmt Durch Zusatz von Metallionen, wie Ca⁺+, Mn+-··, Mg'· +, Fc⁺*, Fe+ + + oder Al +· + +, wird die Aktivität verstärkt,
(h) Gewinnung von kristallisierter Protease:

2f) Die rohe Protease wird in 0,002 M Calciumacetatlösung gelöst. Unlösliche Substanzen werden durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Das Filtrat bzw. der Überstand wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 40% versetzt Die

2ϊ entstandene Fällung (nicht aktive Fraktion) wird abfiltriert oder abzentrifugiert Das Fütrat bzw. der Überstand wird mit weiterem Ammoniumsulfat bis zu einer 70prozentig gesättigten Lösung versetzt

jo Die entstandene Fällung wird abfiltriert oder abzentrifugiert. Die hierbei erhaltene Fällung wird in 0,002 M Calciumacetatlösung gelöst Die Lösung wird in einem Ceiiophanschiauch oder einer Schweinsblase gegen 0,002 M Calciumacetatlösung

j) dialysiert Die Dialyse wird bei 5° C durchgeführt. Nach 3 Tagen bilden sich innerhalb der semipermeablen Membran Kristalle. Nach 7 Tagen wird das kristalline Material abzentrifugiert und in 0,002 M Calciumacetatlösung suspendiert. Die

■10 Suspension wird bei tiefer Temperatur tropfenweise mit verdünnter Natronlauge versetzt Unmittelbar darauf wird die erhaltene Lösung mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt, und unlösliche Substanzen werden

•n abzentrifugiert. Sodann wird der pH-Wert des Überstandes auf 6,8 eingestellt. Oie erhaltene Lösung wird zur Kristallisation der Protease bei tiefer Temperatur stehengelassen,
(i) Molekulargewicht:

-)» Das Molekulargewicht der Protease beträgt nach

Bestimmung mit der Ultrazentrifuge 35 900.
(j) Kristallstruktur.

Die Kristallstruktur der Protease ist noch nich: vollständig geklärt. Die nach der Reinigungsmetho-

V) ae (h) erhaltenen Kristalle sehen stab- oder

nadelähnlich aus.
(k) Elementaranalyse:

C 46,57%; H 7,17%; O 31,57%; N 14,48% und S 0,21%.

«ι Die Protease Her Erfindung greift Peptidbindungen in der oxidierten B-Kette von Insulin an folgenden 12 Stellungen an:
Phe(i)-Vai(2),His(5)-Leu(6),
His(10)-Leu(ll),Glu(13)-Ala(14),

h-, Ala(14)-Leu(15), Leu(15) Tyr(16).

Tyr(16)-Leu(17). l.eu(17)-Val(18).
Gly(23)-Phe(24), Phe(24)-Phe(25)
Phe(23)-Tyr(26) und Lys(29)-Ala(3O).

Außer den vorgenannten Eigenschaften hat die neutrale Protease der Erfindung folgende Eigenschaften im Vergleich mit Trypsin, das bisher zur Aufschließung von animalem Gewebe und zur Suspensionszellkultur verwendet wurde:

In Abwesenheit von Serum, Calcium- und Magnesiumionen wird Gewebe von Trypsin wirksam aufgeschlossen. Serum enthält Trypsininhibitorcn. Infolgedessen ist es nicht möglich, übliche, serumhaltige Kulturmedien zurTrypsinierung zu verwenden. Kulturmedien, die ksin Serum und keine Calcium- und/oder Magnesiumionen enthalten, sind jedoch für Zellen ungeeignet, da die Zellen in diesen Kulturmedien geschädigt werden. Die Aktivität der neutralen Protease der Erfindung wird dagegen durch Serum. Calcium- und/oder Magnesiumionen nicht nennenswert gehemmt. Die Aktivität der Protease kann durch Verdünnen der Proteaselösung leicht abgebrochen werden, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinflussen. Bei Verwendung von Trypsin

Tabelle

	Protease aus	Bacillus
	polynnxa
	Stumm NCIR	Stamm
	H15« (Hler	ARC
	81 >9	2149!
pH-Optimum	6,0-7.2	8,0-8.-3
in pH-Stabilität	5,6-5,8	4.0- 9.0
Tem peraturopti mum	37 C	52° C
Thermostabilität	< 35 C	<40 C
Aktivitätsbeeinflussung	keine	Inhibicrinij!
durch N-Bromsiiccinimid	Inhibierung

/urn OeweücaüfsCniüu iiiüäScii die Arbeitsbedingungen, wie die Behandlungsdauer und die Enzymkonzentration. in einem engen Bereich gehalten werden. Bei Verwendung der neutralen Protease sind die Arbeitsbedingungen im allgemeinen breit, und es tritt nicht leicht eine Zellschädigung ein, selbst wenn die Arbeitsbedingungen außerhalb der jeweiligen Behandlungsdauer und Konzentrationsbereiche liegen. Diesgestatteteineinfacheres und wirksameres Verfahren bei der Aufschließung von Gewebe verschiedener Organe zur Herstellung von Zellkulturen und zum Ablösen und Dispergieren von Zeilkulturen, die an der Oberfläche der Kulturgefäße haften und wachsen.

Die Protease der Erfindung ist weiter dadurch gekennzeichnet, daß ihre Aktivität bei 37⁰C über einen langen Zeitraun aufrechterhalten bleibt. Hierdurch ist es möglich, eine Suspensionszellkultur durch Zusatz de Protease zum Kulturmedium durchzuführen. Bisher konnten Suspensionszellkulturen nur dann durchgeführt werden, wenn bestimmte permanente Zellstämme verwendet wurden, und es war erforderlich, das Kulturmedium zu rühren, um die Zellen von der Oberfläche des Kulturgefäßes abzulösen. Bisweilen war es auch notwendig, eine viskose Substanz sowie eine grenzflächenaktive Verbindung zuzugeben, um die Suspendierung der Zellen zu erleichtern und ihre Verklumpung zu vermeiden. Es wurde versucht. Trypsin zur leichteren Suspendierung der Zellen und zur Suspensionszellkultur zu verwenden, doch wurde Trypsin durch das Protein im Serum inhibiert und seine Aktivität ging bei der Züchtungstemperatur rasch verloren. Trypsin kann also nur unter sehr eingeschränkten Bedingungen verwendet werden, nämlich für eine Suspensionszellkultur, die kein Serum enthält. In einem Kulturmedium, das die Protease der Erfindung enthält, wachsen die suspendierten Zellen, und es gelingt, die Suspensionszellkultur in einem üblichen Kulturmedium ohne Verwendung einer viskosen Substanz und einer grenzflächenaktiven Verbindung durchzuführen.

Aus der Zeitschrift Applied Microbiology, Bd. 26 (1973), S. 185-190, und J. Appl. Chem. BiotechnoL Bd. 23 (1973), S. 401 -406, ist es bekannt, daß Bacillus polymyxa Stamm NCIB 8158 und 8159 bei der Züchtung in einem Stärke-Pepton-Medium extracellular Protease bilden. In Tabelle I sind die unterschiedlichen Eigenschaften der von den bekannten Stimmen und dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm erzeugten Proteasen zusammengefaßt.

Der Stabilitätsbereich der Protease der Erfindung ist breiter als der Stabilitätsbereich der Protease aus NCIB 8158 oder 8159. Ferner ist die Protease der Erfindung bei Temperaturen bis zu 40⁰C stabil, die bekannte

ι tüiläjl* jCuGCii ΓΓύΓ lmS 35°

Protease der Erfindung im Gegensatz zur bekannten Protease leicht in reiner Form kristallisieren.

Aus den F i g. 1 bis 7 ercibt sich die Überlegenheit der Protease der Erfindung gegenüber der bekannten neutralen Protease Trypsin.

Fig. 1 zeigt die Ausbeute an freien lebensfähigen L-929-Zellen, die bei lOminütiger Behandlung von Einschichtkulturzellen bei 37°C mit MEM-FCS-(9 : I)-Lösunge erhalten wurden, die die Protease der Erfindung (Kurve a) bzw. Trypsin (Kurve b) bei verschiedenen Konzentrationen erhalten werden (MEM = Eagle's minimum essential medium; FCS = foetal calf serum).

Fig. 2 zeigt die Ausbeute an freien lebensfähigen Zellen, die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten wurden, jedoch mit der Ausnahme, daß PBS anstelle vom MEM-FCS als Medium verwendet wurde (PBS = phosphate buffered saline).

Fig. 3 zeigt die Beziehung zwischen der Behandlungsdauer und der Ausbeute an freien lebensfähigen L-929-Zellen, die durch Behandlung von Einschichtkulturzellen bei 37° C während verschiedener Zeiten mit einer PBS-Lösung erhalten wurde, die Trypsin in einer Konzentration von 50 E/ml (Kurve a), 200 E/ml (Kurve b)\snd 1000 E/ml (Kurve ^enthielt.

Fig. 4 zeigt die Beziehung zwischen der Behandlungszeit und der Ausbeute an freien lebensfähigen L-929-Zellen, die durch Behandlung von Einschichtkulturzellen bei 37'C während verschiedener Zeiten mit MEM-FCS-(9 : 1)-Lösung erhalten wurden, die die Protease der Erfindung in einer Konzentration von 50 E/ml (Kurve a). 200 E/ml (Kurve b) und 1000 7/ml (Kurve cjenthielt.

Fi g. 5 zeigt die Gesamtzahl der gewachsenen Zellen pro Reagenzglas (Kurve a) und die Ausbeute an freier lebensfähigen Zellen (Kurve b), die bei einer stationären Suspensionskultur bei 37° C während 2 Tagen in einer M EM-FCS-Lösung erhalten wurde, die die Protease der Erfindung in verschiedener Konzentration enthält Die Kurve c zeigt die Zahl der ursprünglich in da« Reagenzglas eingesäten Zellen.

Fig.6-1 zeigt eine Phasenkontrast-Mikrophotographie in 240facher Vergrößerung von L-929-Zellen, die durch stationäre Suspensionskultur bei 37° C während 2 Tagen in einer MEM-FCS-{9:1)-Lösung erhalter wurden, die die Protease der Erfindung in einei Konzentration von 200 E/ml enthält

Fig.6-2 zeigt eine Phasenkontrast-Mikrophotogra-

phie in 24Ofacher Vergrößerung von L-929-Zellen, die durch eine stationäre Suspensionskultur bei 37"C während 2 Tagen in einer MEM-FCS-(9 : 1)-Lösung erhallen wurden, die keine Protease enthielt.

Fig. 7 zeigt Wachstumskurven von L-929-Zellen, die durch stationäre Suspensionskultur bei 37"C in einer MEM-FCS-(9 : 1) Lösung mit 200 E/ml Protease der Erfindung (Kurve a) bzw. ohne Protease (Kurve b) erhalten wurden. In beiden Fällen wird das Kulturmedium jeden dritten Tag erneuert.

Fig. 8 zeigt die Wachstumskurven von L^-Zellen, die durch stationäre Suspensionskultur bei 37"C in einer MEM-FCS-(^ : I)-Lösung mit 200 E/ml Protease der Erfindung (Kurve a) und ohne Protease (Kurve b) erhalten wurden. In beiden Fällen wird das Kulturmedium jeden dritten Tag erneuert.

In den Beispielen wird das Verfahren zur Herstellung der Protease, ein Verfahren zum Aufschluß von animalem Gewebe, ein Verfahren zum Dispergieren

I/nil C~"i f*W f*V\(*-J t*\\ Γ* η linrl nirt Uni-foUpnn

kultur unter Verwendung der neutralen Protease erläutert.

Beispiel 1

Es werden 100 Liter eines Nährmediums verwendet, das 40 Liter eines Extrakts von entfetteten Sojabohnenkuchen, 0,5 Liter Maisquellwasser, 3,5 kg Glucose und 0,01 M CaCI; enthält. Der Extrakt wurde durch Extraktion einer 5prozentigen Suspension von entfettetem Sojabohnenkuchen mit einer verdünnten alkalischen Lösung und Aufschluß mit alkalischer Protease vor de η Filtern hergestellt. Das Nährmedium wird mit einem Stamm von Bacillus polymyxa ATCC 21993 beimpft. Nach 40stündiger Submerskultur in einem 200 Liter fassenden Fermentationsgefäß bei 30⁰C (Belüftung 100 Liter/min; Rührgeschwindigkeit 200 U/min) hat die proteolytische Aktivität der Kulturflüssigkeit ihr Maximum, nämlich 4000 E/ml, erreicht. Die Zellen und unlösliche Stoffe der Kulturflüssigkeit werden nach Zusatz von Calciumphosphat als Filtrierhilfe durch Filtration abgetrennt, und das Filtrat wird unter vermindertem Druck konzentriert. Nach dem Fraktionieren mit Isopropanol (35 bis 70%) werden 700 g Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 428 000 E/g erhalten. Die Aktivitätsausbeute beträgt 70% d. Th.

Beispiel 2

Aufschluß von Herzgewebe von Hühnerembryonen
und Primärkultur

Das Herz eines 10 Tage bebrüteten Hühnerembryos wird mit einem Skalpell in 2 Teile zerschnitten. Jedes Teil wird sodann in kleinere Stücke zerschnitten. Die zerkleinerten Stücke werden in I ml der nachstehend in Tabelle I aufgeführten l'roteaselösungcn dispergierl Die erhaltenen Lösungen werden in ein Reagenzgla abgefüllt und 30 Minuten bei 37"C bebrütet. Nach de Bebrütung werden 4 ml eines gemischten Kulturmedi ums aus 9 Teilen Eagles-MEM und I Teil fötalen Kälberserum (FCS) zugegeben und mit einer Pipetti vermischt. Es wird eine Suspension freier Zeller erhalten. Das Gemisch wird I Minute stehengelassen damit sich kleine Gewebereste absetzen können. Di< überstehende Zellensuspension wird in ein andere; Reagenzglas gegeben und 10 Minuten bei 700 U/mir zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird ver worfen, und die sedimentierten Zellen werden in 4 m eines gemischten Kulturmediums aus 4,5 Teiler F-12-Medium von Ham (F 12), 4.5 Teilen MEM und 1 Teil FCS dispergiert. Die erhaltene Dispersion wird ir ein Glasgefäß mit einem Durchmesse! von 5 err gegeben und 2 Tage bei 37°C stationär in einer feuchter Luftatmosphäre bebrütet, die 5% Kohlendioxid enthält D;c iiü ersten Reagenzglas /üiüükgcuiicutiieii kleiner Gewebereste werden mit 4 ml des gleichen gemischter Kulturmediums vermischt und in ein GlasgefäC gegeben. Das Gemisch wird in gleicher Weise stationär bebrütet.

Nach der Bebrütung wird das Medium verworfen, und die Zellen werden mit 70prozentigem Äthanol — ohne sie von der Glasoberfläche des Kulturgefäßes abzustreifen — fixiert und mit einer Kristallviolettlösung gefärbt.

Diejenige Kultur, in der die dispergierten Zellen eine einzige Zellschicht (Monolayer) ausbilden, werden mit »+ +« bezeichnet. Die Kultur, in der die Zellen keine einzige Zellschicht ausbildeten, sondern an der Glasoberfläche des KulturgefäOes hafteten, wurden mit » + « bezeichnet. Die Kultur, in der die Gewebestücke dispergiert wurden und Zellen über die Glasoberfläche von den Gewebestücken auswuchsen, wurde mit »-f + « bezeichnet. Die Kultur, in der die Gewebestücke verklumpten und Zellen auf der Glasoberflächc nicht so stark wuchsen, wurde mit » + « bezeichnet.

Die Menge der bei der Behandlung des Gewebes mit der neutralen Protease sowohl in der MEM-FCS-Lösung als auch in einer Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) war praktisch die gleiche, wie sie bei der Behandlung des gleichen Gewebes mit Trypsin in PBS erhalten wurde. Bei der Behandlung des Gewebes mit Trypsin in PBS bildete sich ein viskoses Koagulal von Gewebestücken. Es ist bekannt, daß ein derartiges Koagulat durch Zellschädigung hervorgerufen wird. Bei der Behandlung des Gewebes mit der Protease in serumhaltigem Medium erfolgt keine derartige Koagulation, und zahlreiche Zellen aus den behandelten Gewebestücken wachsen über die Glasoberfläche; vgl. Tabelle II.

Äiir.liche Ergebnisse werden bei Verwendung von Herzgewebe aus einem Rattenembryo erhalten.

Tabelle II

Züchtungsbedingungen	E/ml	Kulturmedium	1)	Auswertung	Kultur drr
Enzym			Ο	Kultur der	Gewebestücke
	1000	MEM-FCS (9 :		dispergierten Zellen	+ +
1 erfindungsgemäße Protease	2000	MEM-FCS (9 :		+	+ +
2 erfindungsgemäße Protease	1000	PBS		+ +	+
3 erfindungsgemäße Protease	2000	PBS	+	+
4 crfindungsgcrnäßc Protease	1000	PBS	+ +	+
5 Trypsin			+

809 634/370

lortscl/ιιημ

/1 k 111 μ η »j s 11 c 111 π μ ιι ιι μ ι ■ 11
I ιι/\ ιη

6 Trypsin

7 Trypsin

8 Trypsin

ml Kuli'

2Γ/00 PBS

1000 MEM-FCS (9: I)

2000 MEM-FCS (9: I)

10

AlISU LTMIIIl!

kiillnr 'Jcr Kiillnr dir

ΐΜ'ι|)(.Ί·μ-LTIl¹II ( il¹« L-I)OSiIh

/I¹IIlMl

Anmerkung:

(-) bedeutet, dall eine Züchtung bei Verwendung von MKM-ITS mit Trypsin nicht möglich ist, da "trypsin durch das S.i im

in dem MliMTCS-Kulturmediiim gehemmt wird.

Beispiel 3

Aufschluß des Körpers eines Hiihnerembryos, seine Prirnärkultur und Subkultur

7 Körper von 11 Tage bebrüteten Hühnerembryonen, von denen die Eingeweide und Extrimitäten entfernt wurden, werden zerkleinert und durch den Kanülenansatz einer Injektionsspritze gepreßt. 10 ml der Gewebefragmente werden mit 50 ml einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung versetzt, die Calcium- und Magnesiumionen enthält (Dulbeccos PBS). Das erhaltene Gemisch wird gründlich verrührt, und jeweils 10 ml des Gemisches werden in 5 Erlenmeyer-Kolben gegossen. In die Erlenmeyer-Kolben werden jeweils 10 ml einer Proteaselösung gegeben, die durch Auflösen der neutralen Protease der Erfindung oder Trypsin in Dulbeccos PBS hergestellt wurde. Die Konzentration der Lösungen ist nachstehend in Tabelle III angegeben. Der Inhalt der Erlenmeyer-Kolben wird 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die erhaltene Proteaselösung, die Gewebefragmente und suspendierte lebende Zellen enthält, wird sodann durch ein Sieb aus Edelstahl der lichten Maschenweite 105 Mikron filtriert. Das Filtrat wird 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert. Das Zellsediment wird in einem gemischten Kulturmedium aus MEM, Tryptosephosphat (TPP) und Kälberserum (CS) in einem Mengenverhältnis von 9:0,5:0,5 dispergiert. Das Medium wird nachstehend als MEM-TPP-CS bezeichnet. Es wird eine Zellsuspension erhalten. Die Zellkonzentration wird durch Erythrosin-B- Färbung bestimmt (vgl. Tabelle 111).

In der Primärkultur werden 5 ml der MEM-TPP-CS-Lösungmit5 · 10⁶ Zellen, die durch Behandlung mit den Proteaselösungen erhalten wurden, in eine Kunststoffschale mit einem Durchmesser von 5 cm gegeben. Die Schalen werden 4 Tage bei 37° C in feuchter Luftatmosphäre mit 5% Kohlendioxid inkubiert. Anschließend wird das Medium jeder Schale verworfen, und die in Tabelle IV angegebenen Proteaselösuni en werden zu den restlichen Zellen gegeben. )ie erhaltenen Lösungen werden inkubiert, und die an lcr

h^Qf*^p

Zell

en wer

den

Bildung einer Zellsuspension abgestreift. Die Konzentration der lebenden Zellen in der Suspension wird durch die Erythrosin-B-Färbung bestimmt (vgl. Tabelle IV).

Für die Subkultur werden 5 ml der Zellsuspension mit einer Zellkonzentration von 1 · 10⁶ durch entsprechende Verdiinnung der in der Primärkultur erhaltenen Zellsuspension mit MEM-TPP-CS-Lösung hergestellt. Diese Zellsuspension wird in ein Gefäß gegeben und in gleicher Weise wie die Primärkultur bei 37°C bebrütet. Auf diese Weise wird die Suokultur durchgeführt, bis die tertiäre Kultur erhalten wird. In jeder Stufe wird die Konzentration der lebenden Zellen in der Zellsuspension bestimmt.

In den Versuchen wurde festgestellt, daß die Zahl der lebenden Zellen in der Zeüsuspension mit der Protease der Erfindung immer größer war als die Zahl der lebenden Zellen bei Verwendung von Trypsin. Die maximale Konzentration wird erhalten, wenn die Protease der Erfindung in einer Konzentration von 500 E/ml verwendet wird (vgl.Tabelle in).

Bei Primärkultur und den Subkulturen ist die 2'ahl der lebenden Zellen in den Zellsuspensionen, bei denen Trypsin zum Ablösen der Zellen von der Oberfläche der Kulturgefäße verwendet wurde, nicht immer erhöhL Bei den Primär- und Tertiärkulturen ist die Zellkonzentration sogar vermindert Somit ist die Züchtung in Gegenwart von Trypsin instabil. Andererseits nimmt die Konzentration der lebenden Zellen in den Protease enthaltenden Zellsuspensionen ständig zu (vgl. Tabelle IV, V und VI).

In Dulbiccos PBS-Lösung ist die Zahl der Zellen bei Verwendung von Protease nicht geringer als bei Verwendung von Trypsin.

Tabelle HI

Test

Nr.

Behandlungsbedingungen

Enzym zum Dispergieren der Gewebefragmente

	Zahl der
	suspendierten
Enzymkonzentration	lebenden Zellen
	pro Hühner-
	embryo
0,125%	6,7 xlO7
1000 E/ml	UxIO8
500 E/ml	2^xIO8
100 E/ml	1,6XlO8
50 E/ml	1,6x10«

1 Trypsin

2 erfindungsgemäße Protease

3 erfindungsgemäße Protease

4 erfindungsgemäße Protease

5 erfindungsgemäße Protease

Il

Tabelle IV
Primärkultur

lest
Nr.

Behandliingsbcdingiingcn
linzyn.

Tabelle V
Sckundarkultur

Knzymkon/cn-1 is I ion

In ein Gefäß Zellkonzen-

übertragene tration nach

Zahl lebeiulcr 4tägiger

Zellen Züchtung

Trypsin 0,125% 5,0x10" 4,5xlO^h

erfindungsgemäße Protease 1000 E/ml 5.0x10" 5,2x10"

erfindungsgemäße Protease 500 E/ml 5,0x10" 8,0x10"

erfindungsgemäße Protease 100 il/rnl 5.0x!0" 6.1x10"

erfindungsgemäße Protease 50 F-Vr.il 5,0x10" 8,JxIO"

Tesi
Nr.

ßehandliingshedingungcn

Trypsin

erfindungsgemäße Protease

erfindungsgemäße Protease

	In ein Gefäß	Zellkonzen-
	übertragene	(ration nach
F.n/.ym-	Zahl lebender	4iägiger
konzentration	Zellen	Züchtung
0,125%	l.Ox 10"	1,6 χ 10"
1000 E/ml	l.Ox 10	1.3 χ 10"
50 E/ml	l.Ox 10"	1,7 χ 10"

Tabelle Vl
Tertiärkultur

Test

Nr.

Behandlungsbeiiingungcn
Enzym

l-nzynikon/entration

In ein Gefäß Zellkon/.en-

übertragene tration nach

Zahl lebender 4lägigcr

Zellen Züchtung

Trypsin

erfindungsgemäße Protease

erfindungsgemäße Protease

0,125%	1,0x10"	6,3Ox	10"'
1000 E/ml	l,0x 10"	1,25 χ	10"
50 E/ml	I1Ox 10"	1,25 χ	10"

Beispiel 4

Herstellung einer Zeiisuspension aus einer

fi.inschichtzellkultur von Mäusefibroplasten

des Stammes L-929

Vor der Behandlung mit der Protease werden L-Zellen in einem TD40-Kulturgefäß gezüchtet, das MEM-FCS (9 :1) als Kulturmedium enthält. Die auf der Oberfläche des Gefäßes gewachsenen Zellen werden mit einem sterilen Gummischaber vom Boden der Zuchtgefäße abgeschabt. Die erhaltene Zellsuspension wird in kurze Reagenzröhrchen gegeben und bei 37°C stationär gezüchtet. Hierbei wachsen Zellen an der Glasoberfläche. Nach 2tägiger Züchtung wird das Kulturmedium in einigen der Reagenzröhrchen durch 1 ml PBS oder MEM-FCS-(9 :1)-Lösung ersetzt, die Protease enthält Die Reagenzröhrchen werden bei 37° C inkubiert. Nach einer bestimmten Zeit werden 0,2 ml einer 0,4prozentigen Erythrosin-PBS-Lösung in das Reagenzröhrchen gegeben, und die Zahl der freien lebenden Zellen hn Reagenzröhrchen wird in einer Blutkörperchenzählkammer bestimmt Die Gesamtzahl der Zellen im Reagenzröhrchen wird ebenfalls nach der Kristallviolett-Färbemethode bestimmt, um die Zahl der freien lebenden Zellen mit der der Gesamtzahl zu vergleichen.

Bisher wurde zur Ablösung der Zellen von der Oberfläche eines Kulturgefäßes eine PBS-Lösung mit Trypsin in einer Konzentration von etwa 200 E/ml 4i) verwendet. Deshalb wird Trypsin als Vergleich verwendet.

PBS- oder MEM-FCS-(9:1)-Lösungen mit unterschiedlicher Proteasekonzentration im Bereich von 50 bis 2000 E/ml und PBS- oder MEM-FCS-(9 :1)-Lcsun-

·»■■> gen mit Trypsin unterschiedlicher Konzentration im Bereich von 50 bis 2000 E/ml werden bei der lOminütigen Behandlung einer Einschichtzellkultur bei 37°C untersucht. Die Ausbeute an freien lebenden Zellen bei der Behandlung mit Protease enthaltender

■jo PBS-Lösung und Trypsin enthaltender PBS-Lösung beträgt in beiden Fällen 30% selbst bei optimaler Proteasekonzentration, während die Ausbeute an freien lebenden Zellen bei der Behandlung mit Protease enthaltender MEM-FCS-Lösung und Trypsin enthaltender MEM-FCS-Lösung in beiden Fällen etwa 100% beträgt (vgl. F i g. 1 und 2). Aus F i g. 1 ist ersichtlich, daß die Ausbeute an lebenden Zellen bei der Behandlung mit Protease enthaltender MEM-FCS-Lösung mit zunehmender Proteasekonzentration allmählich zunimmt, während die Ausbeute an lebenden Zellen bei der Behandlung mit Trypsin enthaltender MEM-FCS-Lösung zunächst niedrig bleibt und sodann zunehmender Trypsinkonzentration rasch zunimmt

Die Beziehung zwischen der Ausbeute an freien lebenden Zellen und der Behandlungszeit (0 bis 60 Minuten) wird unter Verwendung einer MEM-FCS-Lösung mit Protease in Konzentrationen von 50 E/ml, 200E/mI und 1000 E/ml und einer PBS-Lösung mit

Trypsin in einer Konzentration von 50 E/ml, 200 E/ml und 1000 E'mI untersucht. Fig.3 zeigt die Beziehung zwischen der Behandlungszeit und der Ausbeute an freien lebenden Zellen, die bei der Behandlung einer Einschichtzellkultur bei 37° C mit der Trypsin enthaltenden PBS-Lösung erhalten wurde. Fig.4 zeigt die Beziehung zwischen der ßehandlungszeit und der Ausbeute an freien lebenden Zellen, die bei der Behandlung einer Einschichtzellkultur bei 37° C mit der Protease enthaltenden MEM-FCS-Lösung erhalten wurde. Aus Fig.3 ist ersichtlich, daß die Ausbeute an freien lebenden Zellen bei Behandlung mit der Trypsin enthaltenden PBS-Lösung ein Maximum innerhalb 10 Minuten erreicht Bei Verlängerung der Behandlungszeil nimmt die Ausbeute rasch ab. Aus Fig.4 ist andererseits ersichtlich, daß bei der Behandlung der Zellen mit der Protease enthaltenden MEM-FCS-Lösung bei Konzentrationen von 200 E/ml und 1000 E/ml praktisch sämtliche Zellen in Form von freien lebenden Zellen abgelöst werden, und die Ausbeute der freien lebenden Zellen nicht nennenswert abnimmt, selbst wenn die Behandlungszeit verlängert wird. Es wurde jedoch festgestellt, daß die MEM-FCS-Lösung mit 50 E/ml Protease nicht in der Lage war, die Zellen von der Oberfläche des Kulturgefäßes innerhalb 60 Minuten abzulösen, und daß die Zellen auch noch nach 48 Stunden nicht abgelöst waren.

Außer fötalem Kälberserum kann der MEM-Lösung Kü'berserum, Rinderserum oder Pferdeserum zugegeben werden. Auch mit diesen Proteaselösungen lassen sich Zellsuspensionen herstellen. Zur Subkultur der freien lebensfähigen Zellen, die durch Behandlung mit der Protease der Erfindung erhalten wurden, wird die Proteasekonzentration auf weniger als 50 E/ml durch Verdünnen der Proteaselösung oder durch Abzentrifugieren der Zellsuspension vermindert Bei der folgenden Subkultur wachsen die Zellen erneut an der Oberfläche eines Kulturgefäßes.

Die Ausbeute an freien lebenden Zellen aus L-Zellen, die an der Oberfläche eines Kulturgefäßes haften, bei Behandlung mit Protease in einem Serum enthaltenden Medium ist also höher als bei der Behandlung mit Trypsin in PBS. Bei Verwendung der Protease der Erfindung läßt sich die optimale Konzentration und Behandlungszeit leicht bestimmen.

Beispiel 5

Suspensionskultur von Mäustfibroplasten
des Stammes L-929

Gemäß Beispiel 4 wird eine Zellsuspension von L-Zellen in MEM-FCS-(9 : IJ-Lösung hergestellt Ein Kulturmedium der Zellsuspension und der Protease der Erfindung wird in kurze Reagenzröhrchen in einer Menge von 1 ml pipettiert und 2 oder 3 Tage bei 37° C inkubiert Die Zahl der freien lebenden Zellen und die Gesamtzahl der Zellen wird in gleicher Weise wie in Beispiel 4 bestimmt Bei der darauffolgenden Züchtung wird das Reagenzröhrchen, das die Zellsuspensior enthält, 10 Minuten bei 700 U/min zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wird mit einer Pipette entfernt Das Zellsedinient wird mit 1 ml einer frischer MEM-FCS-Lösung versetzt, die die Protease det

ίο Erfindung enthält, und erneut bei 37°C gezüchtet Die nachfolgende Züchtung wird durch Verdünnen dei Zellsuspension mit einem frischen Medium in einem Mengenverhältnis von 1 :1 oder 1 :2 fortgesetzt, wenr die Zahl der Zellen zunimmt

Aus Fi g. 6-1 ist ersichtlich, daß in einem Kulturmedium, das die Protease der Erfindung enthält, die Zellen ir dispergiertem Zustand wachsen, während in einen: Kulturmedium, das keine Protease enthält, die Zellen ar der Glasoberfläche wachsen (vgL F i g. 6-2).

Aus F i g. 5 ist ersichtlich, daß die Ausbeute an freier lebenden Zellen 103% bzw. 101% der gesamten Zeller beträgt, wenn die Zellen 2 Tage mit einer MEM-FCS-Lösung behandelt werden, die die Protease dei Erfindung in einer Konzentration von 100 E/ml bzw

2ϊ 200 E/ml enthält Es haften praktisch keine Zellen an dei Glasoberfläche (vgl. F i g. 6-1). Andererseits beträgt die Ausbeute an freien lebenden Zellen weniger als 2% wenn die Proteasekonzentration 25 oder 50 E/ml beträgt. Die Ausbc:ite an freien lebenden Zellen bei

jii Verwendung eines Kulturmediums ohne Protease liegi ebenfalls unter 2%.

Das Wachstum der L-Zellen in suspendierten-Zustand in einer MEM-FCS-(9 :1)-Lösung mit dei Protease der Erfindung bei Suspensionskultur wire

Γ) bestimmt Zur Kontrolle wird das Wachstum dei L-Zellen im gleichen Medium ohne Protease wie bei dei Replikakulturmethode bestimmt. Aus Fig. 7 ist ersichtlich, daß das Wachstum der Suspensionskultur be Verwendung der Protease der Erfindung zwar etwa«

an inhibiert ist im Vergleich zu dem Wachstum in dei Einschichtzellkultur ohne Protease, daß jedoch da; Wachstum stetig zunahm.

Bei Fortsetzung der Suspensionskultur während 1 Monats in einem Kulturmedium, das 200 E/ml Protease "> der Erfindung enthält, entwickelt sich ein Substamm, dei als L-S2 bezeichnet wird. Die Wachstumskurve diese; Substammes L-S2 nach 4monatiger Suspensionskultui sind in Fig.8 angegeben. Wenn die L-S2-Zellen in eir Kulturmedium ohne Protease gegeben werden, wach-

w sen sie an der Glasoberfläche des Kulturgefäßes unc setzen sich daran fest.

In einem Protease der Erfindung und Serurr enthaltenden Kulturmedium ist es also möglich, eine Suspensionskultur durchzuführen, und Zellen ohne Rühren oder Schütteln wachsen zu lassen.

S llliiti /cicliniiimcn

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Neutrale Protease mit milder proteolytischer Aktivität gegenüber Casein mit folgenden Eigenschäften:

a) das pH-Aktivitäts-Optimum der proteolytischen Aktivität gegenüber Casein liegt bei 8,5;

b) sie ist im pH-Bereich von 4,0 bis 9,0 sehr stabil; ι ο

c) sie besitzt Aktivität im Temperaturbereich von 20 bis 75"C, ihr Temperaturoptimum liegt bei 60⁰C;

d) vollständiger Verlust der Aktivität erfolgt bei einem pH-Wert unterhalb 3,0 und oberhalb 10,0;

e) \reversibler Aktivitätsverlust erfolgt durch Kiminütiges Erhitzen auf 65° C;

f) ihre Aktivität wird durch Äthylendiamintetraessigreure, Citronensäure, o-Phenanthrolin, 2,2'-Dipjvidyl, Natriumfluorid, N-Bromsuccinimid und Jvid gehemmt;

g) ihre Aktivität wird durch Ca⁺⁺, Mn ⁺ +, Mg⁺+, Fe + +, Fe + + + und Al+ + + verstärkt;

h) ihr Molekulargewicht, bestimmt durch Ultrazentrifugenmessung, beträgt 35 900;

i) Elementaranalyse: 46,57% C, 7,17% H, 31,57%

0,14,48% N und 0,21% S;
k) sie greift Peptidbiindungen in der oxidierten B-Kette von Insulin an folgenden Stellungen an:

Phe(i)-Val(2), HiS(S¹I-LeU(O),

HiS(IO)-LeU(Il)₁GiU(IS)-AIa(H),

Ala(14)-Leu(15), Leu(15)-Tyr(16),

Tyr(16)-Leu(17), Leu(17)-Val(l8),

Gly(23)-Phe(24), Phe(24)-Phe{25),

Phe(25)-Tyr(26) und Lys(29)-AIa(30).