DE69634090T2

DE69634090T2 - Verfahren zur verhinderung der aktivität des chymopapain- und ppainenzyms mit tierischen polysacchariden

Info

Publication number: DE69634090T2
Application number: DE69634090T
Authority: DE
Inventors: Catherine Lee; Cynthia Zerfass; Thanh Tan DINH; T. Minh MA
Original assignee: Edwards Lifesciences Corp
Current assignee: Edwards Lifesciences Corp
Priority date: 1995-10-19
Filing date: 1996-10-18
Publication date: 2005-05-19
Anticipated expiration: 2016-10-19
Also published as: ATE285471T1; WO1997014784A1; EP0857202A1; DE69634090D1; CA2234715C; US5670358A; EP0857202B1; CA2234715A1; JPH11513569A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf proteolytische Enzymzusammensetzungen und Prozeduren zum Aufschließen von Bindegewebe. Spezieller ist die vorliegende Erfindung auf Verfahren zum Verhindern von proteolytischer Enzymaktivität gerichtet. In einem ihrer spezielleren Aspekte, bezieht sich diese Erfindung auf Verfahren, die verwendet werden, um eine optimale Steuerung beim reproduzierbaren Aufschließen von Bindegewebe und Isolieren von lebensfähigen Zellen aus dem aufgeschlossenen Gewebe sicherzustellen.
Beschreibung des relevanten Stands der Technik
Viele Zellisolations- und Bindegewebsaufschlussprozesse verwenden proteolytische Enzymzusammensetzungen. Gleichermaßen schließen viele medizinische Prozeduren die Verwendung von proteolytischen Enzymen ein, um ungewollte oder unerwünschte Gewebe, so wie Narben, Brandgewebe oder vorgefallene Bandscheiben, aufzuschließen und zu entfernen. Um das Ablösen von Zellen von Bindegewebe zu erleichtern, muss eine ausreichende Menge an Enzymen verwendet werden, um den gewünschten Grad an Aufschluss bereitzustellen. Um sicherzustellen, dass ausreichender Aufschluss auftritt, kann ein Überschuss an Enzymen verwendet werden.
Die Zellen, die isoliert werden, können jedoch durch bestimmte enzymatische Aktivität nachteilig beeinflusst werden, insbesondere durch die Aktivität von proteolytischen Enzymen, welche durch eine breite Spezifizität charakterisiert sind. Normales Gewebe kann ungewollt aufgrund der Aussetzung gegenüber Enzymen ebenfalls nach jeder Prozedur beschädigt sein. Viele Enzymzusammensetzungen, die für die Zelldissoziation und -isolation oder für die Gewebebehandlung verwendet werden, enthalten entweder Chymopapain oder Papain. Beide Enzyme weisen Aktivität gegenüber einem großen Bereich von Proteinen auf.
Es ist notwendig, unerwünschte enzymatische Aktivität so schnell wie möglich zu stoppen, nachdem die Zellen einmal von dem sie enthaltenden Gewebe abgelöst sind, insbesondere dann, wenn sich die Isolations- und Reinigungsverfahren über einen ausgedehnten Zeitraum erstrecken können. Anderenfalls können die Zellintegrität und -funktion durch den sich fortsetzenden enzymatischen Abbau der Zelloberflächen beeinträchtigt werden, was in wesentliche Schäden bei den Zellen resultieren kann, wie beispielsweise Zellmembranabbau oder Verlust von Zelloberflächenrezeptoren.
Es ist gleichermaßen notwendig, die enzymatische Aktivität schnell zu reduzieren, sobald ungewollte Gewebe zersetzt sind, um den Schaden für umgebendes normales Gewebe zu minimieren.
Obwohl Enzym-katalysierte Reaktionen allgemein dadurch angehalten werden können, dass die Enzyme von der Reaktionsmischung getrennt werden, dass der pH-Wert der Reaktion geändert wird oder dass Komponenten der Reaktion ausgefällt werden, können diese Verfahren recht drastisch sein und signifikante Veränderungen bei den Reaktionskomponenten verursachen. Es wäre wünschenswert, die enzymatische Aktion in einer Weise anzuhalten, die, wenn überhaupt, wenig Auswirkungen auf die freigesetzten Zellen oder andere Reaktionskomponenten als das verwendete Enzym oder die verwendeten Enzyme hat.
Entsprechend ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Steuern von Enzym-katalysierten proteolytischen Reaktionen bereitzustellen.
Es ist ein anderer Gegenstand dieser Erfindung, Verfahren zum Aufschließen von Bindegewebe in einer reproduzierbaren und steuerbaren Weise bereitzustellen.
Es ist ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Freisetzen und Isolieren von lebensfähigen Zellen mit vorhersagbaren und reproduzierbaren Ausbeuten und Qualitäten bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, lebensfähige und wirksame Zellen für verschiedene medizinische Verwendungen bereitzustellen.
Es ist ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die Schäden bei anderen, nicht das Ziel darstellenden Gewebekomponenten zu minimieren.
Weitere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus einer Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung deutlich werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung erreicht die obigen Gegenstände durch Bereitstellen von Inhibitoren für Papain und Chymopapain, die verwendet werden können, um die Enzymaktivität anzuhalten oder zu reduzieren, wenn dies erwünscht ist. Die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung sind Polysaccharide tierischen Ursprungs in Konzentrationen, die wirksam sind, um enzymatische Papain- bzw. Chymopapainaktivität zu behindern. Die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung sind hochspezifisch in ihrer inhibitorischen Aktivität und behindern keine anderen Sulfhydrylproteasen, wie beispielsweise Clostripain oder andere Breitspektrumproteasen, wie beispielsweise Trypsin.
Es liegt auch im Bereich der vorliegenden Erfindung, die Inhibierungstechniken der vorliegenden Erfindung für das Isolieren lebensfähiger Zellen, wie beispielsweise Leberzellen oder Bauchspeicheldrüseninselzellen, zu verwenden. Diese Prozesse schützen wirksam Zellen, die vom Gewebe freigesetzt sind, um die Isolation von hochwirksamen und lebensfähigen Zellen in hoher Ausbeute zu ermöglichen.
Ein beispielhafter Prozess der vorliegenden Erfindung umfasst das enzymatische Aufschließen von Bindegewebe durch Bereitstellen einer Enzymzusammensetzung, die Papain oder Chymopapain oder eine Mischung von Papain und Chymopapain enthält, in einer Menge, die ausreichend ist, um Bindegewebe zu hydrolysieren und gewünschte lebensfähige Zellen von solchem Gewebe zu freizusetzen. Das Kontaktieren des Bindegewebes mit der Enzymzusammensetzung erzeugt ein wolkig erscheinendes System, das auf wesentliche Gewebehydrolyse hinweist.
Es ist wesentlich, die enzymatische Aktivität in dem Medium, das die isolierten lebensfähigen Zellen enthält, so schnell wie möglich, nachdem die Zellen von dem Gewebe freigesetzt wurden, anzuhalten oder zumindest wesentlich abzubremsen, um die Zellintegrität beizubehalten. Dies wird dadurch bewirkt, dass exzessiver Aufschluss verhindert wird. Der Enzyminhibierungsprozess der vorliegenden Erfindung kann zu diesem Zweck verwendet werden. Nach der Zugabe eines Inhibitors gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen im Großen geschützt und die Ausbeute der lebensfähigen Zellen wird erhöht.
Genauer verwendet ein bevorzugter Prozess der vorliegenden Erfindung die obigen Schritte nach der Hydrolyse des Bindegewebes um die lebensfähigen Zellen zu schützen und zu isolieren, wie beispielsweise Leberzellen und Bauchspeicheldrüseninselzellen. Vorteilhafterweise werden die Zellen von dem zersetzten Bindegewebe in höherer Ausbeute geborgen, und sie weisen eine verbesserte Lebensfähigkeit auf, wenn sie mit Zellen verglichen werden, die nicht unmittelbar durch Verwenden des Enzyminhibierungsprozesses der vorliegenden Erfindung geschützt wurden. Der Prozess der vorliegenden Erfindung ist durch die erhöhte Anzahl von lebensfähigen gesunden Zellen, die erhalten werden, charakterisiert.
Die erhöhte Ausbeute sowie die erhöhte Lebensfähigkeit und Integrität der gemäß dem Prozess der vorliegenden Erfindung isolierten Zellen wird leicht durch Labortesttechniken aufgezeigt. Die Zellfunktion und -lebensfähigkeit kann durch ihre biologische Funktion demonstriert werden, wie beispielsweise die Produktion von Insulin durch Bauchspeicheldrüseninselzellen als Antwort auf Glukosekonzentrationsänderungen in Kulturmedium. Diese Antwort ist durch das Verhältnis von Insulinproduktion in der Gegenwart von Glukose gegenüber einem Basislinienwert charakterisiert.
Die größere Lebensfähigkeit und Anzahl von nutzbaren Zellen, die gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung isoliert werden, sind insbesondere wichtig für Anwendungen, die verschiedene medizinische Prozeduren einschließen, wie z. B. das Transplantieren von Leberzellen oder Bauchspeicheldrüseninselzellen in Individuen, die an Leber- oder Bauchspeicheldrüsenerkrankung leiden.
In einem anderen exemplarischen Prozess wird die Enzyminhibierung verwendet, um normales Gewebe nach dem enzymatischen Aufschluss von unerwünschtem Gewebe in der Nähe des normalen Gewebes zu schützen.
BESCHREIBUNG VON BEISPIELHAFTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt Prozesse bereit, die zu einer besseren Steuerung beim Aufschließen von physiologischem Bindegewebe in einer Vielzahl von therapeutischen und Laboranwendungen in der Lage sind. Diese Anwendungen reichen von therapeutischen Behandlungsprozeduren in vivo bis zu Techniken, die das Freisetzen und Isolieren von Zellen, die in Bindegewebe eingebettet sind, für anschließende Labor- oder klinische Anwendungen einbeziehen.
Die Prozesse der vorliegenden Erfindung sind zum Reproduzieren/Isolieren von hoch lebensfähigen Zellen aus Geweben geeignet, die aus Proteinen, Glykoproteinen und extrazellulären Matrixmaterialien bestehen. Diese Inhibitoren können auch angewandt werden, um Bereiche zu behandeln, um einen übermäßigen Aufschluss zu verhindern, wenn diese Enzyme zum Entfernen von ungewollten Geweben verwendet werden. Die Fachleute werden voraussetzen, dass die Fähigkeit, die Hydrolyse über einen weiten Bereich von Proteinen und Proteinmischungen sorgfältig zu steuern, die Lehren der vorliegenden Erfindung bei einer Anzahl von Gewebeentfernungsbehandlungsverfahren sowie sowohl bei in vivo als auch bei in vitro Zellisolationsprozeduren umfänglich anwendbar macht.
Prozesse der vorliegenden Erfindung finden insbesondere Anwendung bei Zelldissoziationsprozeduren einschließlich Laborzellkulturverfahren und verwandten Zellisolationstechniken. Als ein Merkmal der vorliegenden Erfindung werden Zellen effektiv und reproduzierbar aus einem Wirt von unterschiedlichen proteinartigen Bindegeweben isoliert und können in höherer Ausbeute mit verbesserter Konservierung der Zellmembranen geerntet werden. Darüber hinaus haben diese Zellen eine bessere Lebensfähigkeit als Zellen, die unter Verwendung von Prozessen des Stands der Technik isoliert werden. Aus diesem Grund sind die Zusammensetzungen und Prozesse der vorliegenden Erfindung insbesondere zum Isolieren hoch lebensfähiger Zellen, die in Bindegewebe eingebettet sind, für die nachfolgende Verwendung in verschiedenen klinischen Prozeduren geeignet, wie beispielsweise dem Transplantieren von Leberzellen oder Bauchspeicheldrüseninselzellen in Individuen, die an Leber- oder Bauchspeicheldrüsenerkrankungen leiden.
Bevorzugte beispielhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwenden Enzymlösungen, die Papain oder Chymopapain oder Mischungen davon in einer physiologisch kompatiblen Flüssigkeit enthalten. Geeignete physiologisch kompatible Flüssigkeiten umfassen phosphatgepufferte Salzlösungen und ähnliche gepufferte Elektrolytlösungen mit Osmolaritäten, die mit physiologischem Gewebe kompatibel sind. Eine insbesondere geeignete kommerziell erhältliche Elektrolytlösung ist Plasmalyte^®-Elektrolytlösung erhältlich von Baxter-Hyland mit einem gepufferten pH-Wert von 7,4 und einer Osmolarität von 194 mosmol/L, die mit kontrollierten Konzentrationen von Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Chlorid-, Acetat- und Glukonationen erreicht wird. Eine andere geeignete Elektrolytlösung ist Medium 199. Wie unten illustriert ist, werden Zusätze, so wie humanes Serumalbumin und Serum, in vielen Anwendungen bevorzugt.
Die Fachleute werden voraussetzen, dass die Konzentration oder Menge jedes Enzyms, das in den Lösungen vorliegt, mit der Menge und des Typs des zu hydrolysierenden Gewebes variiert. Die wohlbekannten Prinzipien von Enzymaktivität sind anwendbar, und einfache Experimente, die Techniken einbeziehen, welche zum Optimieren von Enzymreaktionen und Gesamtaktivität vorgesehen sind, stellen die notwendigen Informationen bereit, um die wirksame Hydrolyse der Menge und des Typs von ausgewähltem Bindegewebe zu bewirken.
Zum Beispiel für Anwendungen, die auf das Aufschließen von Bindegewebe und das Isolieren von Leberzellen und Bauchspeicheldrüseninselzellen gerichtet sind, die in das Gewebe eingebettet sind, können beispielhafte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eine Lösung von ungefähr 0,15 nkat/ml bis etwa 0,55 nkat/ml gereinigtes Papain oder Chymopapain in einer geeigneten pH-gepufferten, physiologisch kompatiblen Flüssigkeit umfassen. Die nkat/ml-Einheit ist definiert als Nanomol Substrat, die pro Sekunde von 1 ml Enzymlösung unter den verwendeten Testbedingungen hydrolysiert werden. Zum Zweck der vorliegenden Erfindung wurden die Enzymaktivtätstests bei 37°C in Tricin-Puffer, 50 mM, 10 mMCaCl₂ enthaltend, durchgeführt.
Chymopapain, das ein proteolytisches Enzym ist, welches von Papaya-Latex extrahiert wird, ist kommerziell in einem trockenen lyophilisierten Zustand aus einer Anzahl von Quellen einschließlich Sigma Chemical in St. Louis, Missouri, erhältlich. Chymopapain ist in rohen, teilweise gereinigten und höher gereinigten Formen, die sich in der Menge an Papain, Lysozympeptidase A und sensibilisierenden Antigenen, die in der Zubereitung gefunden werden, unterscheiden, erhältlich. Chymopapain, das zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen keine anderen proteolytischen Enzymverunreinigungen als Resultat des Reinigungsprozesses aufweist. Chymopapain aus den meisten kommerziellen Quellen, welches unter Verwendung bekannter chromatographischer Reinigungsprozesse gereinigt worden ist, stellt Chymopapain bereit, das in der Praxis der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Alternativ kann gereinigtes Chymopapain unter Anwendung z. B. des Prozesses, der in dem US-Patent Nr. 4,719,108 beschrieben ist, zubereitet werden. Papain, ein anderes von Papaya enthaltenes Enzym.
Ein beispielhaftes Gewebesystem zum Demonstrieren der Eigenschaften der vorliegenden Erfindung ist Bindegewebe. Allgemein ist Bindegewebe, das Zellen zusammenhält, eine komplexe Mischung von Collagen, anderen extrazellulären Proteinen, Glykoproteinen und Mucopolysacchariden.
Deshalb umfassen die Prozesse der vorliegenden Erfindung weithin das Bereitstellen einer Enzymzusammensetzung und das in Kontakt Bringen der Zusammensetzung mit ausgewähltem Gewebe für einen Zeitraum und bei einer Temperatur, die ausreichend sind, um das Gewebe im Wesentlichen zu hydrolysieren, um den unerwünschten Teil zu entfernen oder um die Isolation der gewünschten Zellen zu ermöglichen, und das Verhindern der enzymatischen Aktion nach ausreichendem Gewebeaufschluss für die Zellfreisetzung und -isolation.
Bevorzugte beispielhafte Prozesse gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung umfassen das Aufschließen von Bindegewebe zum Zweck des Entfernens von unerwünschtem Gewebe oder das Freisetzen und Isolieren von Zellen, die in das Bindegewebe eingebettet sind. Der Prozess der vorliegenden Erfindung stellt hoch lebensfähige Zellen bereit, die insbesondere nützlich für Gentherapie und das Transplantieren in Menschen oder Tiere für therapeutische Zwecke sind. Zum Beispiel können Bauchspeicheldrüsenzellen aus Spenderbauchspeicheldrüsen isoliert und in Menschen oder Tiere zum Zwecke der Behandlung von Bauchspeicheldrüsen-bezogenen Krankheiten transplantiert werden. Zusätzlich können Leberzellen aus Leber gemäß bekannten Prozeduren unter Verwendung von Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung isoliert werden.
Ein am meisten bevorzugter Prozess der vorliegenden Erfindung umfasst das Bereitstellen einer Mischung von Enzymen, in denen Papain oder Chymopapain eine der Komponenten ist, das Kontaktieren von Bindegewebe mit der Enzymmischung für einen Zeitraum und bei einer Temperatur, die ausreichend sind, um das Bindegewebe im Wesentlichen zu hydrolysieren und um lebensfähige Zellen, die in das Gewebe eingebettet sind, freizusetzen, und das unmittelbare Behindern der verbleibenden enzymatischen Aktivität durch Hinzugeben einer Konzentration an Inhibitor, die ausreichend ist, um solche enzymatische Aktivität anzuhalten oder wesentlich zu verlangsamen. Der Inhibitor kann vor der Zentrifugation und dem Abpipettieren des Überstands von den Zellen zugegeben werden, falls dies erwünscht ist, um während dieses Prozesses Schäden an den Zellen zu reduzieren. Bevorzugte beispielhafte Prozesse umfassen weiterhin das Spülen der Zellen mit einer physiologisch kompatiblen Flüssigkeit vor ihrer Bewertung und Verwendung.
Die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung können als Polysaccharide tierischen Ursprungs charakterisiert werden, die die Fähigkeit des Behinderns der enzymatischen Aktivität von Papain und Chymopapain haben und die nicht toxisch und anderweitig kompatibel mit lebensfähigen Zellen sind. Glykogen, entsulphatiertes Heparin und Hyaluronsäure sind Polysaccharide, von denen herausgefunden wurde, dass sie diese Eigenschaften zeigen. Sie sind sämtlich natürliche Bestandteile von Säuretierkörpern. Glykogen tritt in der Leber und in ausgeruhter Muskulatur auf. Entsulphatiertes Heparin tritt in Leber- und Lungengeweben und in den meisten Zellen von verschiedenen Säugetierarten auf. Hyaluronsäure tritt in der Nabelschnur, in der Glaskörperflüssigkeit, in der Synovialflüssigkeit und in pathologischen Gelenken auf. Kommerziell erhältliche Chymopapain- und Papaininhibitoren, die sehr teuer sind, sind keine natürlichen Gewebebestandteile. Sie sind toxisch und können immunogen sein. So sind sie für eine in vivo-Verwendung nicht geeignet.
Jedes dieser natürlich auftretenden Polosaccharide ist ein wirksamer Inhibitor von Papain- und Chymopapainaktivität. Als sie jedoch gegen andere gemeinhin verwendete Proteasen, wie beispielsweise Trypsin oder Chlostripain, eine Sulphydrylprotease ähnlich wie Papain und Chymopapain, getestet wurden, wurde herausgefunden, dass die enzymatische Aktivität entweder überhaupt nicht oder nur zu einem sehr geringen Maß beeinträchtigt war, verglichen mit derjenigen, die von Papain und Chymopapain gezeigt wurde.
Die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung sind nicht toxisch und mit lebensfähigen Zellen kompatibel. Sie können in Zellkulturen verwendet werden, da sie nicht mit der Zellvermehrung und -funktion kollidieren, oder in vivo einschl. der Verwendung bei Zelltransplantationen. Sie können in jeglicher Konzentration verwendet werden, die die Zelllebensfähigkeit, Zellfortpflanzung oder Zellfunktion nicht negativ beeinflusst. Im Allgemeinen werden die Zellen umso aktiver sein, je mehr die enzymatische Aktivität verhindert wird. Zellfortpflanzungsprofile zeigen eine Abhängigkeit der Zellfortpflanzung von der Inhibitorkonzentration. Da entsulphatiertes Heparin und Hyaluronsäure saure Gruppen enthalten, können sie in der Form ihrer nicht toxischen Salze, wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Magnesium- und Kalziumsalze von entsulphatiertem Heparin oder dem Natirumsalz von Hyaluronsäure, verwendet werden. Konzentrationen so niedrig wie ungefähr 0,5% entsulphatiertes Heparin, 0,5% Hyaluronsäure oder 0,5% Glykogen können verwendet werden. Diese Enzyminhibitoren können allgemein in den Bereichen von etwa 0,5% bis 10% verwendet werden.
Wie oben allgemein erwähnt wurde, werden Leberzellen und Bauchspeicheldrüseninselzellen, die aus hydrolysierten Geweben gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung isoliert werden, in höheren Ausbeuten isoliert und weisen eine größere Lebensfähigkeit auf, als Zellen, die durch Prozesse des Stands der Technik isoliert werden, bei denen es der Enzymaktivität gestattet wird, sich – wenn auch nur in begrenztem Umfang – nach der Zellisolation vorzusetzen. Darüber hinaus werden, da die Enzymzusammensetzungen, die bei den Prozessen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, gereinigt sind, in dem Fall, dass isolierte Zellen für therapeutische Zwecke implantiert werden oder bei anderen in vivo-Verwendungen eingesetzt werden, jegliche zusammen mit ihnen transplantierten Restenzymzusammensetzung keinen nachteiligen Effekt erzeugen. Die überlegenen physikalischen und funktionalen Eigenschaften der Zellen, die gemäß dem Prozess der vorliegenden Erfindung isoliert werden, werden durch höhere Ausbeuten an Zellen mit erwarteten Eigenschaften demonstriert, wie sie durch bekannte Zellzählverfahren bestimmt werden.
Andere Techniken schließen die Verwendung von Verfahren ein, bei denen ein bestimmtes Substrat mit den Zellen inkubiert wird, um das Substrat in ein gefärbtes Produkt umzuwandeln. Die optische Dichte der lysierten Zellen bei 570 nm, die proportional zur Anzahl der lebensfähigen, funktionalen Zellen ist, wird dann mit einem Spektrometer bestimmt.
Die resultierenden, überlegenen physikalischen und funktionalen Eigenschaften von Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert werden, machen sie besonders nützlich für das Transplantieren. Die hohe Lebensfähigkeit und die hohe funktionelle Fähigkeit dieser Zellen stellt ein Transplantat bereit, das weniger stark zu einem funktionalen Ausfall neigt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann unerwünschtes Gewebe von normalem Gewebe entfernt werden, indem eine wässrige Lösung von Chymopapain, Papain oder einer Mischung davon in einer physiologisch kompatiblen Elektrolytlösung bereitgestellt wird, die auf einen pH-Wert von ungefähr 7,0 bis 7,4 gepuffert ist; indem das unerwünschte Gewebe mit der Enzymlösung für einen Zeitraum und bei einer Temperatur kontaktiert wird, die ausreichend sind, um das unerwünschte Gewebe zu hydrolysieren; indem hydrolysiertes Gewebe von normalem Gewebe in Kontakt mit diesem entfernt wird und indem das normale Gewebe, von dem das unerwünschte Gewebe entfernt worden ist, mit einer Lösung gespült wird, die Glykogen, Hyaluronsäure oder entsulphatiertes Heparin in einer Konzentration enthält, die ausreichend ist, um die enzymatische Chymopapain- bzw. Papainwirkung zu behindern.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden nicht limitierenden Beispiele besser verstanden werden, die die Verwendung der von Tieren abgeleiteten Polysaccharidmaterialien der vorliegenden Erfindung beim Inhibieren verschiedener Enzyme illustrieren. In diesen Beispielen wurden die Aktivitäten von Chymopapain und Papain durch einen Test bestimmt, der ein synthetisches BAPNA, M-Benzoyl-L-Arginin-p-Nitroanilidsubstrat unter Messen der Erhöhung der Absorption bei 415 nm verwendet. Die Aktivität von Chlostripain wurde durch einen Test bestimmt, der ein synthetische BAEE, M-Benzoyl-L-Argininethylestersubstrat unter Messen der Erhöhung der Absorption bei 253 nm verwendet. Die Aktivität von Trypsin wurde durch einen Test unter Verwendung BAPNA bestimmt.
Die folgenden Beispiele zeigen die Reduktion bei der Aktivität von verschiedenen Enzymen in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an Glykogen.
Beispiel 1
Die Proteaseaktivität wurde für die Enzyme Trypsin, Chymopapain, Papain und Clostripain durch Messen der Reaktionsrate für die Hydrolyse von synthetischen Substraten bestimmt. Die Erhöhung der Absorption bei 415 nm wurde zum Messen der Reaktionsraten von Trypsin, Chymopapain und Papain auf einem BAPNA-Substrat verwendet. Die Erhöhung der Absorption bei 253 nm wurde für die Messung der Reaktionsrate von Clostripain verwendet. Trypsin-, Chymopapain- und Papainaktivitäten wurden bei 37°C in Trincin-Puffer, 50 mM, 10 mM CaCl₂ enthaltend, bestimmt. Clostripainaktivität wurde bei Raumtemperatur bestimmt. Chymopapain, Papain und Clostripain wurden vor dem Test mit L-Cystein- oder Dithiothreitol-reduzierendem Mittel aktiviert. Die Konzentration des reduzierenden Mittels in der Substratlösung wurde durch Zugabe von reduzierendem Mittel zu der Substratlösung bei 5 mM gehalten.
Glykogen wurde in dem Testpuffer auf eine Endkonzentration auf 1% aufgelöst. Die prozentuale Inhibierung wurde aus dem Verhältnis der Enzymaktivität in der Gegenwart des Inhibitors zu der Aktivität einer Kontrolle erhalten, zu der kein Inhibitor zugegeben wurde. Die Resultate sind in Tabelle I gezeigt.
TABELLE I INHIBIERUNG DURCH GLYKOLEN
Aus den voranstehenden Daten kann ersehen werden, dass eine Konzentratin von 1% Glykogen keinen inhibierenden Effekt auf Clostripain hat und nur zu ungefähr 1% bei der Verhinderung der enzymatischen Trypsinaktivität wirksam war. Von Glykogen wurde herausgefunden, dass es als Inhibitor von Chymopapain- und Papainaktivität 10 bis 20-mal so effektiv ist wie als Inhibitor von Trypsinaktivität.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Reduktion der Aktivität von verschiedenen Enzymen in der Anwesenheit von entsulphatiertem Heparin.
Beispiel 2
Die Prozedur des Beispiels 1 wurde wiederholt, außer dass anstelle von Glykogen eine 0,5%-Lösung von entsulphatiertem Heparin als Inhibitormaterial verwendet wurde. Die Resultate sind in Tabelle II gezeigt.
TABELLE II INHIBIERUNG DURCH ENTSULPHATIERTES HEPARIN
Die vorangehenden Resultate zeigen, dass entsulphatiertes Heparin bei einer Konzentration von 0,5% nur ein Zehntel so wirksam beim Inhibieren von Clostripain wie beim Inhibieren von Chymopapain und Papain und weniger als halb so effektiv beim Inhibieren von Trypsin wie beim Inhibieren von Chymopapain und Papain war.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Reduktion der Aktivität von verschiedenen Enzymen bei der Anwesenheit von Hyaluronsäure.
Beispiel 3
Die Prozedur des Beispiels 1 wurde wiederholt, außer dass eine 0,5%-Lösung von Hyaluronsäure als Inhibitormaterial anstelle von Glykogen verwendet wurde. Die Resultate sind in Tabelle III gezeigt.
TABELLE III INHIBIERUNG DURCH HYALURONSÄURE
Die Resultate zeigen, dass Hyaluronsäure bei einer Konzentration von 0,5% keinen inhibierenden Effekt auf Trypsin oder Clostripain hatte aber wirksam beim Inhibieren von Chymopapain und Papain war.
Nachdem so bevorzugte beispielhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden, sollte von den Fachleuten festgestellt werden, dass die Offenbarungen hier nur beispielhaft sind und dass Alternativen, Adaptionen und Modifikationen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung realisiert werden können. Entsprechend ist die vorliegende Erfindung nicht auf die hier illustrierten spezifischen Ausführungsformen beschränkt.

Claims

Verfahren zum Verhindern der Aktivität eines Enzyms, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Chymopapain und Papain besteht, wobei das Verfahren das Zugeben eines Polysaccharids, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glykogen, entsulphatiertem Heparin und Hyaluronsäure besteht, zu einem Medium aufweist, welches das Enzym enthält, wobei das Polysaccharid in einer Konzentration zugegeben wird, die wirksam ist, um die Aktivität des Enzyms zu behindern.
Prozess zum Isolieren lebensfähiger Zellen oder Bauchspeicheldrüseninselzellen aus Gewebe, das lebensfähige Leberzellen oder Bauspeicheldrüseninselzellen enthält, wobei der Prozess die Schritte aufweist: Bereitstellen einer Enzymzusammensetzung, die eine wässrige Lösung eines Enzyms aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Chymopapain, Papain und Mischungen davon besteht, wobei das Enzym eine Aktivität von ungefähr 0,15 nkat/ml bis etwa 0,55 nkat/ml aufweist, in einer physiologisch kompatiblen Elektrolytlösung, die auf einen pH-Wert von ungefähr 7,0 bis 7,5 gepuffert ist; Kontaktieren von Gewebe, das lebensfähige Leberzellen oder Bauchspeicheldrüseninselzellen enthält, mit dem Enzym für einen Zeitraum bei einer Temperatur, die ausreichend sind, um das Gewebe zu hydrolysieren; Isolieren von lebensfähigen Leberzellen oder Bauchspeicheldrüseninselzellen aus dem hydrolysierten Gewebe; und Zugeben eines Polysaccharids, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Glykogen, entsulphatiertem Heparin und Hyaluronsäure besteht, zu einem Medium, das die isoliert lebensfähigen Leberzellen oder Bauchspeicheldrüseninselzellen enthält, wobei das Polysaccharid in einer Konzentration zugegeben wird, die ausreichend ist, um die enzymatische Aktion des Chymopapains oder des Papains oder der Mischung von Chymopapain und Papain zu behindern; wodurch die Ausbeute von lebensfähigen Leberzellen oder Bauchspeicheldrüseninselzellen verbessert wird und die Zellaktivität derselben erhöht wird.
Prozess zum Entfernen unerwünschten Gewebes von normalem Gewebe, das die Schritte aufweist: Bereitstellen einer Enzymzusammensetzung, die eine wässrige Lösung eines Enzyms aufweist, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Chymopapain, Papain und Mischungen davon besteht, in einer physiologisch kompatiblen Elektrolytlösung, die auf einen pH-Wert von ungefähr 7,0 bis 7,4 gepuffert ist; Kontaktieren von Gewebe, das unerwünschtes Gewebe in Kontakt mit normalem Gewebe enthält, mit der Enzymzusammensetzung für einen Zeitraum und bei einer Temperatur, die ausreichend sind, um das unerwünschte Gewebe zu hydrolysieren. Entfernen von hydrolysiertem unerwünschten Gewebe von dem normalen Gewebe und Spülen des normalen Gewebes, von dem das unerwünschte Gewebe entfernt worden ist, mit einer Lösung, die ein Polysaccharid enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glykogen, entsulphatiertem Heparin und Hyaluronsäure besteht, wobei das Polysaccharid in einer Konzentration vorliegt, die ausreichend ist, um die enzymatische Aktion des Chymopapains oder des Papains oder der Mischung von Chymopapain und Papain zu behindern.
Prozess nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Konzentration ungefähr 0,5% bis 10% ist.
Verwendung von Glykogen, entsulphatiertem Heparin oder Hyaluronsäure bei der Zubereitung eines Medikaments für das Verhindern von fortgesetzter enzymatischer Wirkung in Gewebe, das mit dem Enzym Papain, Chymopapain oder Mischungen davon behandelt wurde.