DE69735308T2

DE69735308T2 - Enzymzusammensetzung für die freisetzung von zellen aus geweben.

Info

Publication number: DE69735308T2
Application number: DE69735308T
Authority: DE
Inventors: E. Francis Greenwood DWULET; E. Marilyn McCordsville SMITH
Original assignee: Roche Diagnostics Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-12-04
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2017-12-05
Also published as: US5830741A; DE69735308D1; US5952215A; EP0907723A1; EP0907723B1; JP3053875B2; WO1998024889A1; JPH11504225A; MX9806064A; EP0907723A4; CA2241266A1; CA2241266C; ES2259194T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen für die enzymatische Freisetzung von Zellen aus extrazellulären Gewebematrizes für das Gewebe-Remodelling und die schlagkräftige Isolation von lebensfähigen Zellen und Zellaggregaten aus Gewebe.
Allgemeiner Stand der Technik
Die enzymatische Freisetzung von einzelnen Zellen und Zellaggregaten aus Gewebe dient verschiedensten Anwendungen im Labor, in der Diagnose und in der Therapie. Bei diesen Anwendungen werden viele Arten von Zellen für verschiedene Zwecke isoliert, darunter Mikrogefäß-Endothelzellen für die Beimpfung für synthetische Gefäßtransplantate mit kleinem Durchmesser, Hepatozyten für die Gentherapie, des Screening in der Arzneistofftoxikologie und extracorporeale Leberassistenzgeräte, Chondrozyten für die Knorpelregeneration sowie Langerhanssche Inselzellen für die Behandlung des insulinabhängigen Diabetes mellitus. Die Enzymbehandlung eignet sich für die Fragmentierung von extrazellulären Matrixproteinen und Proteinen, bei denen der Kontakt zwischen den Zellen bestehen bleibt. Da es sich bei Collagen um die Hauptproteinkomponente der Gewebeultrastruktur handelt, wurde das Enzym Collagenase häufig zur Erzielung der gewünschten Freisetzung von Zellen aus Geweben verwendet.
Rohe bakterielle Collagenase von Clostridium histolyticum ist in verschiedenen Formen im Handel erhältlich und wird für die Freisetzung von Zellen und Zellaggregaten aus Gewebe verwendet. Diese Rohcollagenasen, die aus Zellkulturüberständen stammen, enthalten typischerweise eine Mischung von Proteaseenzymen (die sowohl collagenolytische als auch unspezifische proteolytische Aktivitäten aufweisen) und Nichtproteasekomponenten (z.B. Nebenprodukte der Fermentation, Medienkomponenten, Pigmente, andere Enzyme wie Phospholipase sowie Endotoxine).
In der Analyse von im Handel erhältlichen Rohcollagenasen hat sich gezeigt, daß die Konzentration und Verhältnisse zwischen Protease und Nichtproteasekomponenten extrem stark schwanken. Diese variable Zusammensetzung spiegelt sich auch in der Variabilität und der daher auftretenden Unvorhersagbarkeit zwischen Chargen bei der Wirksamkeit des Collagenaseprodukts in Protokollen bei der Freisetzung von Zellen aus Gewebe wider. Zusätzlich zu dieser produkteigenen Wirkungsvariabilität verliert jede Charge einer im Handel erhältlichen Collagenase im Verlauf der Zeit an Wirksamkeit und Funktionseigenschaften. Schließlich führt zusätzlich zu diesen mit der Variabilität der Zusammensetzung einhergehenden Problemen die Verwendung von Rohcollagenasen bei Protokollen für die Zellgewinnung bzw. Freisetzung von Zellen aus Gewebe üblicherweise zu wenig wünschenswerten Ergebnissen in Bezug auf erhaltene Lebensfähigkeit, Anzahl und Funktion der Zellen. Diese Probleme sind besonders dann gravierend, wenn die Zellen für eine Transplantation oder für eine Überwachung der Auswirkung von Effektormolekülen auf die Zellfunktion verwendet werden sollen. So wurde zum Beispiel nachgewiesen, daß die Wirksamkeit der Inselzellen-Transplantation teilweise von der Masse der Inselzellen und ihrer Lebensfähigkeit abhängt. Weiterhin wird die Funktion der Arzneistoffentgiftung von gewonnenen Hepatozyten durch die während der Freisetzung und Isolation von Zellen aus dem Lebergewebe stattfindenden Zellschäden wesentlich gestört. Für die meisten Verwendungszwecke für gewonnene Zellen ist die möglichst geringe Schädigung der gewonnenen Zellen und Zellaggregate kritisch für eine optimale Zellfunktion.
Praktiker in diesem Fachgebiet haben erkannt, wie wichtig eine gleichbleibende und vorhersagbare Aktivität von Proteaseenzymen, die bei Protokollen für die Feisetzung von Zellen aus Gewebe verwendet werden, für eine wirksame Zellisolation (also die Aufrechterhaltung der Zellintegrität, die Gewinnung von größeren Zellaggregaten und mehr Zellen und Zellaggregaten) ist. Insbesondere wurde gefunden, daß die Reinheit von Collagenasezusammensetzungen und die Tatsache, daß es wünschenswert ist, daß definierte Mengen der beiden Enzyme C. histolyticum Collagenase der Klasse I (Collagenase I) und Collagenase der Klasse II (Collagenase II) zusammen mit mindestens zwei neutralen Proteasen vorliegen, die Schlagkräftigkeit der Isolation von Pankreas-Inselzellen beeinflussen. Es besteht jedoch noch immer ein Bedarf an der Identifikation von optimierten Enzymzusammensetzungen, die eine rasche Freisetzung von Zellen aus Geweben und die Gewinnung einer größeren Anzahl an lebensfähigen Zellen ermöglichen.
Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Enzymzusammensetzung bereit, die dadurch hergestellt wird, daß man definierte Mengen an aufgereinigten Proteasen, darunter Collagenase I und Collagenase II aus C. histolyticum, sowie eine Endoprotease in einer solchen Menge, daß das Verhältnis der gesamten FITC-Casein-Aktivitätseinheiten der Enzymzusammensetzung zu den gesamten Wunsch-Aktivitätseinheiten der Masse der Collagenase I und der Masse der Collagenase II ungefähr 85:1 bis ungefähr 3900:1 beträgt, zusammengibt. Bei Verwendung in Protokollen für die Isolation von Zellen aus Geweben bewirken die erhaltenen Enzymzusammensetzungen eine verbesserte raschere Freisetzung von Zellen aus extrazellulären Matrizes und sie ermöglicht im Vergleich zur Anzahl und Lebensfähigkeit von Zellen, die mit Enzymzusammensetzungen des Stands der Technik geerntet werden, darunter auch Rohcollagenasezusammensetzungen, die Gewinnung von höheren Ausbeuten an den gewünschten Zellen mit einer verbesserten Lebensfähigkeit.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Enzymzusammensetzung bereitgestellt, die im wesentlichen aus Collagenase I und Collagenase II aus C. histolyticum sowie einer Endoprotease besteht, wobei das Verhältnis zwischen der Masse der Collagenase II zu der Masse der Collagenase I plus der Masse der Collagenase II in der Enzymzusammensetzung ungefähr 0,3 bis ungefähr 0,6 beträgt. Die erhaltene Enzymzusammensetzung ist weiterhin auch insofern eine Verbesserung gegenüber vorbekannten Zusammensetzungen, als sie fähig ist, rascher Zellen aus extrazellulären Gewebematrizes freizusetzen und die Gewinnung einer größeren Anzahl von lebensfähigen Zellen zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer Enzymzusammensetzung für die Isolation von lebenden Zellen aus Gewebe bereit, wobei dieses Verfahren den Schritt umfaßt, daß man eine bekannte Masse von Collagenase I und eine bekannte Masse von Collagenase II aus C. histolytikum sowie eine Endoprotease in einer Menge, die ausreicht, um die FITC-Casein-Aktivität der Enzymzusammensetzung auf ein Niveau anzuheben, daß das Verhältnis der gesamten FITC-Casein-Aktivität in der Enzymzusammensetzung zu den gesamten Wunsch-Aktivitätseinheiten der kombinierten Masse von Collagenase I und Collagenase II in der Enzymzusammensetzung ungefähr 85:1 bis ungefähr 3900:1 beträgt, zusammenbringt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß Collagenase I und Collagenase II aus C. histolytikum mit definierten Mengen einer Endoprotease zusammengebracht werden können, wodurch man zu einer neuen Enzymzusammensetzung mit Aktivitätsprofilen, die für die Isolation von Zellen aus Spenderorgangewebe optimal sind, gelangt. Genauer gesagt wurde entdeckt, daß ein optimaler enzymatischer Abbau von extrazellulären Gewebematrizes und eine gleichzeitige schlagkräftige Freisetzung von lebensfähigen Zellen und Zellaggregaten aus Organgewebe dadurch erzielt werden kann, daß man eine Collagenaseenzymzusammensetzung verwendet, die dadurch hergestellt wird, daß man die Bestandteile der Zusammensetzung so einstellt, daß das Verhältnis der gesamten FITC-Casein-Aktivität der Enzymzusammensetzung zu den Wunsch-Aktivitätseinheiten der Masse von Collagenase I und der Masse von Collagenase II in der Zusammensetzung ungefähr 85:1 bis ungefähr 3900:1, vorzugsweise ungefähr 130:1 bis ungefähr 1400:1, beträgt. In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Enzymzusammensetzung bereitgestellt, die sich für die wirksame Freisetzung von Zellen aus Rattenlebergewebe für eine hohe Ausbeute an Hepatozyten eignet. Diese Enzymzusammensetzung beinhaltet Collagenase I und Collagenase II von C. histolyticum und eine Endoprotease in solchen Mengen, daß das Verhältnis der gesamten FITC-Casein-Aktivität der Enzymzusammensetzung zu den Wunsch-Aktivitätseinheiten der Masse von Collagenase I und der Masse von Collagenase II in der Zusammensetzung ungefähr 250:1 bis ungefähr 600:1, durchschnittlich ungefähr 400:1, beträgt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Optimierung der Massenverhältnisse der Zwei-Komponenten-Collagenaseenzyme in erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen, die im wesentlichen aus Collagenase I, Collagenase II und einer Endoprotease bestehen. Das optimale Masseverhältnis von Collagenase II zu der gesamten Collagenase in der Zusammensetzung, also Collagenase II/(Collagenase I + Collagenase II), beträgt ungefähr 0,3 bis ungefähr 0,6. Werden Collagenase I und Collagenase II aus C. histolyticum in diesem Masseverhältnis mit einer Endoprotease zusammengebracht, so eignet sich die erhaltene Enzymzusammensetzung ganz besonders für die Gewinnung von Zellen und Zellaggregaten aus Gewebeproben in einer größeren Anzahl sowie mit höherer Lebensfähigkeit und verbesserter Reproduzierbarkeit als bei Protokollen für die Freisetzung von Zellen aus Geweben, bei denen vorbekannte Collagenaseenzymzusammensetzungen verwendet werden. Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Enzymzusammensetzung, die sich für die Freisetzung von Zellen aus Rattenleber eignet, beträgt das Masseverhältnis von Collagenase II zu Gesamtcollagenase in der Zusammensetzung ungefähr 0,35 bis ungefähr 0,45.
Die erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen beinhalten sowohl Collagenase I als auch Collagenase II aus C. histolyticum. Collagenase I und Collagenase II werden aus C. histolyticum-Rohcollagenase durch verschiedene fachbekannte Verfahren aufgereinigt, darunter Farbstoffliganden-Affinitätschromatographie, Heparin-Affinitätschromatographie, Ammoniumsulfatfällung, Hydroxyapatitchromatographie, Größenausschlußchromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Metallchelationschromatographie. Rohcollagenase ist von vielen Anbietern im Handel erhältlich (z.B. Collagenase P von der Boehringer Mannheim Corporation).
Bei der Endoproteasekomponente der vorliegenden Enzymzusammensetzung kann es sich um eine beliebige Endoprotease, darunter eine Serinprotease (z.B. Trypsin, Chymotrypsin, Elastase), eine Cysteinprotease (z.B. Papain, Chymopapain), handeln; sie ist vorzugsweise eine neutrale Protease (z.B. neutrale Protease aus C. histolyticum, Dispase oder Thermolysin) alle EC 3.4.24.4. (EC steht für Enzyme Commission-Klassifikation. EC 3.4.24.4 ist die Klassifikation für mikrobielle Metalloproteinasen).
Für die Freisetzung von Zellen aus einer 6 bis 12 Gramm schweren Rattenleber zwecks Gewinnung von Hepatozyten beträgt die Aktivität der Masse von Collagenase I und der Masse von Collagenase II in der Enzymzusammensetzung ungefähr 7,7 bis ungefähr 62,7 Wunsch-Einheiten, vorzugsweise etwa 15,1 bis ungefähr 52,6 Wunsch-Einheiten stärker bevorzugt ungefähr 24 bis ungefähr 33 Wunsch-Einheiten, wobei die durchschnittliche Aktivität ungefähr 30 Wunsch-Einheiten beträgt. Die gesamte FITC-Casein-Aktivität dieser Enzymzusammensetzung beträgt etwa 5500 bis ungefähr 29700 FITC-Casein-Einheiten, vorzugsweise ungefähr 7000 bis ungefähr 22000 FITC-Casein-Einheiten, stärker bevorzugt ungefähr 8500 bis ungefähr 14500 FITC-Casein-Einheiten, wobei die durchschnittliche Aktivität ungefähr 12000 FITC-Casein-Einheiten beträgt. Dementsprechend beträgt der Verhältnisbereich von FITC-Casein-Einheiten der Zusammensetzung zu Wunsch-Einheiten der Zusammensetzung 5500/62,7 bis 29700/7,7, bzw. ungefähr 85:1 bis ungefähr 3900:1, vorzugsweise 7000/52,6 bis 22000/15,1, bzw. ungefähr 130:1 bis ungefähr 1400:1, stärker bevorzugt 8500/33 bis 14500/24, bzw. ungefähr 250:1 bis ungefähr 600:1, wobei das durchschnittliche Aktivitätsverhältnis 12000/30, bzw. ungefähr 400:1, beträgt.
Die oben genannte Zusammensetzung eignet sich nicht nur für die Freisetzung von Zellen aus der Leber für die Isolation von Hepatozyten, sondern auch für die Freisetzung von Zellen aus Epidermisfett für die Isolation von Mikrogefäß-Endothelzellen. Es wird weiterhin auch angenommen, daß sich die oben genannte Zusammensetzung auch für die Freisetzung von Zellen aus Pancreasgewebe, für die topische Behandlung für die Heilung von Verbrennungen und Geschwüren und für die Wundheilung, sowie für die Behandlung von Peyronie-Krankheit und Neubildung von abnormen Bandscheiben oder Bandscheibenvorfall eignet. Im allgemeinen eignet sich die erfindungsgemäße Zusammensetzung für jegliche beliebige Anwendung dort, wo die Entfernung von Zellen oder die Modifikation einer extrazellulären Matrix erwünscht ist.
Bei manchen Anwendungen kann es bevorzugt sein, daß die Enzymzusammensetzung im wesentlichen frei von Endotoxinen ist. Es kann auch wünschenswert sein, daß die Enzymzusammensetzung im wesentlichen frei von dem Enzym Clostripain ist, obwohl Clostripain im allgemeinen nicht die Funktion der Enzymzusammensetzung zu beeinflussen scheint. Diese unerwünschten Komponenten, die beide in Rohcollagenase aus C. histolyticum vorliegen, können von den aufgereinigten Komponenten Collagenase I und II mit einer oder mehreren der oben beschriebenen Aufreinigungsmethoden abgetrennt werden. "Im wesentlichen frei" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, daß Anstrengungen unternommen werden oder worden sind, die angegebene Verunreinigung aus der Zusammensetzung zu entfernen und daß solch eine Verunreinigung, falls überhaupt in der Zusammensetzung vorhanden, nur in Spuren, typischerweise zu weniger als 2 Gew.-%, insbesondere weniger als 1 Gew.-% und in jedem Fall in einer Menge unterhalb einer Menge, die die Aggregatfunktion der Zusammensetzung beeinflussen würde, vorliegt.
Erfindungsgemäße Enzymzusammensetzungen können dadurch hergestellt werden, daß man entweder eine bestimmte Anzahl von Aktivitätseinheiten (also Wunsch-Einheiten von Collagenase I und Collagenase II) oder bestimmte Massen der vorzugsweise aufgereinigten Enzyme mischt. Es folgen nun Enzym-Essays für Collagenase, neutrale Protease und Clostripain, die für die Definition der spezifischen Aktivitäten der aufgereinigten Collagenasekomponenten sowie der Gesamt-Aktivität (FITC) der Enzymzusammensetzung insgesamt verwendet wurden. Dem Fachmann wird klar werden, daß für die Definition und Herstellung von funktionell entsprechenden Enzymzusammensetzungen auch andere Enzym-Assays als diejenigen, die im folgenden beschrieben werden, verwendet werden können.
Collagenase-Aktivitäts-Assay
Die Collagenaseaktivität wurde mit einem synthetischen Peptidsubstrat nach der Methode von Wunsch & Heidrich (Z. Physiol Chem. 1963; 333:149) bestimmt. Hierbei handelt es sich um eine Standardmethode, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Collagenaseaufreinigung gut bekannt ist. Die Collagenase-I-Aktivität, die mit dem Wunsch-Peptid als Substrat bestimmt wurde, lag typischerweise im Bereich von 0,2 bis 0,6 Einheiten (U)/Milligramm (mg), insbesondere 0,3 bis 0,5 U/mg. Die Collagenase-II-Aktivität, die mit dem Wunsch-Peptid als Substrat bestimmt wurde, lag typischerweise im Bereich von 9,5 bis 13,5 U/mg, insbesondere 11 bis 13 U/mg. Eine Wunsch-Aktivitätseinheit (U) ist definiert als die Hydrolyse von 1 Mikromol (μmol) Peptid pro Minute bei 25°C, pH 7,1. Es folgt nun eine Beschreibung des für den Collagenase-Aktivitäts-Assay verwendeten Testprotokolls.
Probenverdünnungspuffer (100 Millimol (mM)/Liter (1) Tris-(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), pH 7,1):
1,21 Gramm (g) Tris wurden in entionisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit 1,0-normaler (N) Salzsäure (HCl) auf 7,1 eingestellt und das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 100 Milliliter (ml) eingestellt.
PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-Substrat:
Mit jeder Blind- oder Testprobe wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt. Gesamtmenge an für den Assay erforderlichem Substrat = 2 mg Substrat für jeden durchgeführten Test + 2 mg Substrat extra (beispielsweise für die Doppelbestimmung von 2 Proben + die Doppelbestimmung von Blindprobenröhrchen = 6 Assay-Röhrchen. Die Richtmenge an erforderlichem Substrat beträgt 14,0 mg). Die Gesamtauswaage an Substrat wurde durch 50 dividiert, um die Anzahl Milliliter Methanol, die zum Lösen des Substrats erforderlich sind, zu bestimmen. Die berechnete Methanolmenge wurde zu dem Substrat gegeben. Das Substrat wurde gründlich durch Vortex-Mixen vermischt, bis alles vollständig gelöst war. Das gelöste Substrat wurde mit Probenverdünnungspuffer auf solch ein Endvolumen versetzt, daß die Substratkonzentration 1 mg/ml betrug.
100 mM/l Calciumchlorid (CaCl₂):
1,47 g CaCl₂, Formelmasse (FM) 147, wurde in entionisiertem Wasser gelöst. Das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 100 ml eingestellt.
25 mM/l Citronensäure:
0,525 g Citronensäure, FM 210,1, wurde in entionisiertem Wasser gelöst. Das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 100 ml eingestellt.
Assay-Mischung:
2,0 ml PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-Substrat sowie 0,4 ml 100 mM CaCl₂ wurden in Probenröhrchen mit den Abmessungen 12 × 75 Millimeter (mm) gegeben und mit Kappen verschlossen. Bevor mit dem Assay begonnen wurde, ließ man die Assay-Mischungen im Wasserbad auf 25°C equilibrieren. Für jede in Doppelbestimmung geprüfte (Blind-)Probe wurde ein Röhrchen vorbereitet.
Extraktionsmischung:
5,0 ml Essigester und 1,0 ml 25 mM/l Citronensäure wurden in Probenröhrchen mit den Abmessungen 16 × 125 mm gegeben. Jedes Röhrchen wurde mit einer Kappe verschlossen. Für jede in Doppelbestimmung geprüfte (Blind-)Probe wurde ein Röhrchen vorbereitet.
Trocknungsröhrchen:
0,35 bis 0,4 g wasserfreies Natriumsulfat wurde in Probenröhrchen in den Abmessungen 16 × 125 mm gegeben. Jedes Röhrchen wurde mit einer Kappe verschlossen. Für jede in Doppelbestimmung geprüfte (Blind-)Probe wurde ein Röhrchen vorbereitet.
Vorgangsweise:
Alle konzentrierten und verdünnten Enzymproben wurden bis zur Zugabe zum Substrat bei 2°C bis 8°C aufbewahrt. Eine Probe von entweder der Gesamtenzymzusammensetzung oder von einer ihrer Komponenten (z.B. Collagenase I, Collagenase II oder neutrale Protease) wurde mit Probenverdünnungspuffer auf einen Konzentrationsbereich von 0,05 bis 0,8 mg/ml verdünnt, und zwar je nach der geschätzten Probenaktivität. Nachdem 100 Mikroliter (μl) der Blindkontrolle (als Blindprobe wurde Probenverdünnungspuffer verwendet) zu dem ersten Röhrchen mit Assay-Mischung gegeben wurde, wurde die Assay-Inkubationszeit gestartet. Die Assay-Mischung wurde dann mit einer Kappe verschlossen, gründlich gemischt und in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 25°C gestellt. In Zeitabständen von 60 Sekunden wurden 100 μl der nächsten Blind- oder Testprobe auf gleiche Art und Weise zu einem Röhrchen mit Assay-Mischung gegeben. Jede Assay-Mischung wurde 15 Minuten (min.) lang ab dem Zeitpunkt der Zugabe der Blind- oder Testprobe bei 25°C inkubiert. Nach 15 minütiger Inkubation wurden 0,5 ml der ersten Assay-Mischung (Blindprobe) in ein Röhrchen, das Extraktionsmischung enthielt, überführt. Das Röhrchen mit der Extraktionsmischung wurde mit einer Kappe verschlossen und durch 20 Sekunden vortexen gründlich gemischt. Nach Zeitabständen von 60 Sekunden wurden die restlichen Blind- oder Testproben in Röhrchen mit Extraktionsmischung überführt und auf gleiche Art und Weise gemischt, so daß die gesamte Inkubationszeit für jede Probe 15 min. betrug. 3 ml der organischen Phase (Oberphase) von jeder Extraktionsmischung wurden in ein Trocknungsröhrchen pipettiert. Die Trocknungsröhrchen wurden mit Kappen verschlossen, gemischt und im Abzug 30 bis 60 min. lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhrchen wurden während dieses Zeitraums nochmals gemischt. Die organische Phase wurde in Quarzküvetten pipettiert und die Extinktion wurde bei 320 Nanometern (nm) für jede (Blind-)Probe mit einem temperierten Spektrophotometer bei 25°C bestimmt.
Berechnung:
A₃₂₀ = durchschnittliche Extinktion der Probe – durchschnittliche Extinktion der Blindprobe (Puffer). Aktivität (U/ml) = (A₃₂₀ × 2,5 × 5 × Verdünnungsfaktor)/(21 × 0,10 × 0,5 × 15). Vereinfacht ausgedrückt: U/ml = A₃₂₀ × 0,79 × Verdünnungsfaktor. Die U/mg spezifische Aktivität wurde für jede Probe berechnet, und zwar folgendermaßen: spezifische Aktivität (U/mg) = (U/ml)/(mg/ml).
Aktivitätsassay für die neutrale Protease
Die Aktivität der neutralen Protease wurde durch Freisetzung von in Trichloressigsäure (TCA) löslichen fluoreszierenden Peptiden von dem Substrat FITC-Casein bestimmt, und zwar nach einer Abwandlung des Verfahrens von Twining (Anal. Biochem. 1984; 143:30). Die fluoreszierenden Peptide wurden mit einer Anregungswellenlänge von 491 nm und einer Emissionswellenlänge von 525 nm quantitativ bestimmt. Der Bereich der für die neutrale Protease Dispase bestimmten FITC-Casein-spezifischen Aktivität betrug typischerweise 600 bis 1400 U/mg, insbesondere 1100 bis 1400 U/mg. Der Bereich der für die neutrale Protease Thermolysin bestimmten FITC-Casein-spezifischen Aktivität betrug typischerweise 3000 bis 6500 U/mg, insbesondere 3500 bis 6000 U/mg. Eine Aktivitätseinheit erzeugt pro Minute bei 37°C, pH 7,5, 100.000 hintergrundkorrigierte Fluoreszenzeinheiten (Zellimpulse pro Sekunde). Es folgt nun eine Beschreibung des Prüfprotokolls, das für den Aktivitäts-Assay für neutrale Protease verwendet wurde.
Verdünnungspuffer (100 mM/l Tris, 10 mM/l CaCl₂, pH 7,5):
6,06 g Tris und 0,74 g CaCl₂ wurden in entionisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit 1,0 N HCl auf 7,5 eingestellt und das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 500 ml eingestellt.
FITC-Casein-Substratlösung (0,25% w/v):
50,0 mg FITC-Casein wurden in Probenverdünnungspuffer gelöst. Das Volumen wurde mit Probenverdünnungspuffer auf 20,0 ml gebracht.
Quench-Lösung (5,0% w/v):
5,0 g Trichloressigsäure wurden in entionisiertem Wasser gelöst. Das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 100 ml eingestellt.
Neutralisierungslösung (500 mM/l Tris; pH 8,5):
30,3 g Tris wurden in entionisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit 1,0 N HCl auf 8,5 eingestellt und das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 500 ml eingestellt.
Vorgangsweise:
Alle konzentrierten und verdünnten Enzymproben wurden bis zur Zugabe zum Substrat bei 2°C bis 8°C aufbewahrt. Für jede Blind- oder Testprobe wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt. Eine Probe von entweder der Gesamtenzymzusammensetzung oder von einer ihrer Komponenten (z.B. Collagenase I, Collagenase II oder neutrale Protease) wurde mit Probenverdünnungspuffer je nach der geschätzten Aktivität der Probe auf einen Konzentrationsbereich von 1 bis 50 Mikrogramm (μg)/ml verdünnt. 10 μl der verdünnten Proben wurden zu 40 μl FITC-Casein-Substratlösung in 1,5-ml-Eppendorfröhrchen gegeben (wobei der Probenverdünnungspuffer als Kontrolle (Blindprobe) verwendet wurde) und 45 min. lang unter Schütteln bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Die Röhrchen wurden aus dem Wasserbad herausgenommen und mit 120 μl der Quenchlösung versetzt. Die Röhrchen wurden gevortext und mindestens 60 min. lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wurden die Röhrchen 2 min. lang bei 14000 U/min. in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. 50 μl des Überstands wurden abgenommen und zu 2 ml Neutralisierungspuffer in einer Küvette gegeben. Die Küvette wurde mit einer Kappe verschlossen und die Lösung wurde durch Umdrehen gemischt. Anschließend wurde die Fluoreszenz gemessen (Anregungswellenlänge 491 nm, Emissionswellenlänge 525 nm, Spaltbreite 0,2 nm).
Berechnungen:
CPS = durchschnittliche Fluoreszenz der Enzymprobe – durchschnittliche Fluoreszenz des Puffers (Blindprobe). Aktivität (U/ml) = (CPS × 0,17 ml × Verdünnungsfaktor)/(0,05 ml × 0,01 ml × 45 min. × 100.000).
Vereinfacht ausgedrückt: U/ml = CPS × 0,0000755 × Verdünnungsfaktor. Der lineare Bereich des SPEX-Fluorimeters liegt zwischen 4000 und 100.000 CPS.
Das in dem oben beschriebenen Assay für neutrale Proteasen verwendete Substrat Casein kann auch als allgemeines Substrat für verschiedenste Proteaseaktivitäten, darunter Trypsin, Clostripain, Dispase, Thermolysin und viele andere, verwendet werden. Die bevorzugten Bereiche für die FITC-Casein-Aktivität der im vorliegenden Text beschriebenen Gesamtenzymzusammensetzungen wurden bestimmt und als Aktivitätseinheiten der endgültigen Enzymzusammensetzung definiert, wobei es sich nicht um die tatsächlichen Einheiten der allein vor dem Vermischen bestimmten neutralen Proteasekomponenten handelte.
Assay der Clostripain-Aktivität
Clostripain-Aktivität wurde durch die Esterolyse von N-Benzoyl-L-argininethylester (BAEE) bestimmt, und zwar nach einer Abwandlung des Verfahrens von Whitaker und Bender (J. Am. Chem. Soc. 1965; 87:2728). Bei Clostripain handelt es sich um eine Cystein-Protease, die durch Reduktionsmittel wie Dithiothreitol (DTT) aktiviert wird. Die gemessene Clostripain-Aktivität ist die Differenz zwischen dem durch DTT aktivierten Enzym und dem nicht mit DTT behandelten Enzym. Die beschriebenen Aktivitäten wurden mit 1,8 mM BAEE erzeugt. Eine Einheit wird definiert als die Hydrolyse von 1 μmol BAEE pro min. bei 25°C, pH 7,6. Es folgt nun eine Beschreibung des Testprotokolls, das für den Assay der Clostripain-Aktivität verwendet wurde.
Phosphatpuffer 75 mM/l):
1,17 g Natriumdihydrogenphosphat (NaH₂PO₄) wurde in entionisiertem Wasser gelöst. Das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 100 ml eingestellt und als "Lösung A" bezeichnet. 1,07 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na₂HPO₄) wurden in entionisiertem Wasser gelöst. Das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 100 ml eingestellt und als "Lösung B" bezeichnet. Der pH-Wert von Lösung B wurde mit Lösung A auf 7,6 eingestellt.
DTT-Lösung (7,5 mM/l):
28,9 mg Dithiothreitol (DTT) wurden in entionisiertem Wasser gelöst, und das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 25 ml eingestellt.
BAEE-Lösung (1,8 mM/l):
15,4 mg BAEE wurden in entionisiertem Wasser gelöst, und das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 25 ml eingestellt.
10x Aktivierungslösung (10 mM/l Calciumacetat, 25 mM/l DTT):
17,6 mg Calciumacetat und 38,6 mg DTT wurden in entionisiertem Wasser gelöst, und das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 10,0 ml eingestellt.
10x Blindprobenlösung (10 mM/l Calciumacetat):
17,6 mg Calciumacetat wurden in RO/entionisiertem Wasser gelöst, und das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 10,0 ml eingestellt.
Herstellung der Proben:
Alle konzentrierten und verdünnten Enzymproben wurden bei 2°C bis 8°C aufbewahrt, bis sie zu dem Substrat gegeben wurden. Collagenase I wurde mit einer Kombination von 10x Aktivierungslösung und entionisiertem Wasser so verdünnt, daß die Probenendkonzentration 0,15 mg/ml in 1x Aktivierungslösung betrug (zum Beispiel werden zur Verdünnung einer Probe mit einer Konzentration von 26,7 mg/ml Collagenase I auf 0,15 mg/ml für den Assay 10 μl der Probe mit einer Konzentration von 26,7 mg/ml Collagenase I mit 178 μl 10x Aktivierungslösung + 1592 μl entionisiertem Wasser gemischt). Collagenase II wurde mit einer Kombination von 10x Aktivierungslösung und entionisiertem Wasser so verdünnt, daß die Probenendkonzentration 0,4 mg/ml in 1x Aktivierungslösung betrug (zum Beispiel werden zur Verdünnung einer Probe mit einer Konzentration von 31,2 mg/ml Collagenase II auf 0,4 mg/ml für den Assay 10 μl der Probe mit einer Konzentration von 31,2 mg/ml Collagenase II mit 78 μl 10x Aktivierungslösung + 692 μl entionisiertem Wasser gemischt). Die Proben wurden anschließend 4,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Herstellung der Trypsin-Blindproben:
Die Trypsin-Blindproben wurden dadurch hergestellt, daß man die Probenverdünnungen mit 10x Blindprobenlösung statt 10x Aktivierungslösung und 1x Blindprobenlösung statt 1x Aktivierungslösung wiederholte.
Spektralphotometrischer Assay (Wellenlänge 253 nm, Endvolumen 0,93 ml, Temperatur 25°C):
Eine Trypsin-Blindprobenmischung und eine aktivierte Probenmischung wurden dadurch hergestellt, daß man die folgenden Bestandteile vermischt:
Vier Quarzküvetten wurden in das Spektralphotometer eingebracht. In jede der ersten beiden Küvetten wurden 0,9 ml der Trypsin-Blindprobenmischung pipettiert. In jede der beiden verbleibenden zwei Küvetten wurden 0,9 ml der aktivierten Probenmischung pipettiert. Die Extinktion wurde 1,5 min. lang abgelesen, um zu einem Blindwert zu gelangen (der Blindwert sollte 0,01 delta (Δ)A₂₅₃/min. nicht überschreiten). Anschließend wurde die Reaktion dadurch gestartet, daß man 0,03 ml des verdünnten Trypsin-Blindprobenpräparats in die beiden Trypsin-Blindprobenküvetten und 0,03 ml des verdünnten Probenpräparats in die beiden aktivierten Probenküvetten pipettierte und gründlich mischt. Zur Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit wurde jede Küvette 1,5 min. lang untersucht (der ΔA₂₅₃/min.-Wert sollte zwischen 0,007 und 0,040 liegen).
Berechnung:
Für jede Probe wurde durch U/ml-Aktivität folgendermaßen berechnet: U/ml = [(ΔA/Minute) × (Verdünnungsfaktor) × (0,93) × (1000)]/[1150) × (0,03)], wobei ΔA/Minute = ΔA₂₅₃/min. Probe-ΔA₂₅₃/min. Blindprobe. Vereinfacht ausgedrückt: U/ml = (ΔA/Minute) × (Verdünnungsfaktor) × (26,96). Die spezifische Aktivität in U/mg wurde für jede Probe berechnet und zwar folgendermaßen: spezifische Aktivität (U/mg) = (U/ml)/(mg/ml).
BEISPIEL 1: AUFREINIGUNG VON COLLAGENASE I UND COLLAGENASE II AUS ROHER BAKTERIELLER COLLAGENASE
Als Ausgangsmaterial wurde im Handel erhältliche rohe bakterielle Collagenase (Collagenase P, Boehringer Mannheim Corporation) verwendet. Es wurde gefunden, daß sich drei Farbstoffligand-Affinitätschromatographieträger von Amicon ausreichend eigneten. Bei diesen Trägern handelte es sich um MATREX (eingetragenes Warenzeichen, W.R. Grace & Co.) Gel Blue A, MATREX Gel Red A sowie MATREX Gel Green A. Vergleichbare Produkte von anderen Anbietern erwiesen sich als ähnlich leistungsfähig. Für eine maximale Aktivitätsgewinnung wurden alle Aufreinigungsschritte bei 2°C bis 8°C durchgeführt.
Die rohe bakterielle Collagenase und der gewählte Träger wurden gegen einen calciumhaltigen Puffer mit niedriger Ionenstärke bei einem pH-Wert zwischen 6,0 bis 7,5 equilibriert. Für die beste Kombination von Aufreinigungseffizienz, Enzymstabilität und Leistungsfähigket des Harzes wird ein pH-Bereich von 6,5 bis 7 bevorzugt. Für die Equilibrierung von Harz und Enzym wurde bei diesen Chromatographien entweder der Puffer 20 mM 4-[2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) oder der Puffer 20 mM [Bis-(2-hydroxyethyl)imino]tris(hydroxymethyl)-methan (BIS-Tris), 1 mM Calciumchlorid pH 7,0 verwendet. Die rohe bakterielle Collagenase wurde dadurch gelöst, daß man das lyophilisierte Ausgangsmaterial bei einer Probenkonzentration von ungefähr 40 mg/ml in dem gewählten Equilibrierungspuffer suspendierte. Es wurden Konzentrationen von 1 bis 100 mg/ml verwendet, wobei Konzentrationen um 40 mg/ml die beste Kombination von Enzymstabilität und kurzen Probeaustragszeiten aufwiesen. Unlösliches Material kann durch Zentrifugation und/oder Filtration über Cellulose, Celluloseacetat, Polyethersulfon oder sonstige Membranen mit schwacher Proteinbindung entfernt werden.
Die geklärte Probe wurde auf das Harz mit einer Durchflußgeschwindigkeit im Bereich von 0,1 bis 2,0 Zentimetern (cm)/min. aufgetragen. Die Aufreinigung ist gegenüber der Durchflußgeschwindigkeit unempfindlich, so daß diejenige Durchflußgeschwindigkeit, die am besten in den Produktionsplan paßt, verwendet wird. Je nach der Harzcharge können 10 bis 15 mg Enzym an die Red-A- und Green-A-Harze gebunden werden, was einer Bindungskapazität von 20 bis 40 mg Collagenase P pro Milliliter dieser Träger entspricht. Das Harz Blue A weist ungefähr 1/2 der Kapazität auf. Nachdem die Probe auf die Säule aufgetragen worden ist, wird das nicht zurückgehaltene Material durch Auftragen des Equilibrierungspuffers aus der Säule ausgewaschen. Üblicherweise reichen für diesen Zweck zwei bis drei Säulenvolumina Puffer aus.
Die gebundenen Enzyme wurden durch Elution aus dem Harz mit einem Salz- und/oder pH-Gradienten gewonnen. Für die Gewinnung des Großteils der gebundenen proteolytischen Aktivität reichten Elutionspuffer mit 20 mM HEPES, 1 mM Calciumchlorid und 400 mM Natriumchlorid pH 7,5 oder 20 mM Tris, 1 mM Calciumchlorid und 150 mM Natriumchlorid pH 9,0 aus.
Die mit Farbligandenaffinität aufgereinigte Collagenaseenzymmischung wurde mit Hilfe einer starken Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow Harz (eingetragenes Warenzeichen, Pharmacia, Inc.) weiter aufgereinigt. Vor der Verwendung wurde das Harz von der Natriumform in die Calciumform umgewandelt. Dies erfolgte dadurch, daß man das Harz mit einem Überschuß an Calciumchloridlösung wusch. Für die Umwandlung der Harzfüllung in die Calciumform reichte 1/2 Säulenvolumen 500 mM Calciumchloridlösung aus. Die Harzfüllung in ihrer Calciumform und die mit Farbligandaffinität aufgereinigte Enzymlösung wurden gegen einen calciumhaltigen Puffer mit schwacher Ionenstärke, der bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 aufrechterhalten wurde, equilibriert. Für diese Chromatographien wurde für die Equilibrierung der Puffer 20 mM HEPES, 5 mM Calciumchlorid pH 7,0 verwendet. Die equilibrierte mit Farbligandaffinität aufgereinigte Enzymmischung wurde auf die SP Sepharose FF-Säule in ihrer Calciumform mit Durchflußgeschwindigkeiten von bis zu 8 cm/min. aufgetragen. Für die meisten Aufreinigungen eignet sich am besten eine Durchflußgeschwindigkeit von 2 cm/min. für die Geschwindigkeit und leichte Durchführung der Prozeßkontrolle. Nach dem Auftragen der Probe wurden die Collagenaseenzyme durch Auftragen des Equilibrierungspuffers eluiert. Üblicherweise reichen die für die Elution aller Collagenaseenzyme von der Säule ungefähr zwei Säulenvolumina Puffer aus. Sobald die Collagenaseenzyme von der Säule eluiert waren, können die gebundenen Proteine (hauptsächlich Clostripain sowie mehrere Nichtproteaseproteine) mit einem Calciumchloridgradienten von 5 bis 100 mM eluiert werden. Dies erfolgte mit einem linearen Gradienten von 10 bis 15 Säulenvolumina für die Gewinnung des aufgereinigten Clostripains oder mittels eines Schrittweisen Gradienten zwecks Reinigung der Säule für die Wiederverwendung. Durchschnittlich waren pro Milliliter Harz ein bis zwei Milligramm Clostripain gebunden. Die Sättigung dieses Harzes mit Calcium ist deshalb wichtig, weil, wenn dies nicht durchgeführt wird, das Harz den Enzymen in dem Präparat Calcium entzieht, was zu einem verstärkten Enzymabbau und zu schlechteren Ausbeuten führt. Es wird erwartet, daß andere starke Kationenaustauscherharze eine ähnliche Leistungsfähigkeit aufweisen wie das hier verwendete Harz.
Der Durchlauf von der mit Calcium abgesättigten SP Sepharose FF-Säule, der die Collagenaseenzyme und die neutrale Clostridien-Protease enthielt, wurde durch Anionenaustauschchromatographie aufgereinigt und zwar entweder an Diethylaminoethyl (DEAE)- oder Trimethylaminoethyl (Q)-Sepharose Fast Flow (Pharmacia). Sowohl der Träger als auch die Enzymprobe wurden gegen einen calciumhaltigen Puffer mit niedriger Ionenstärke und einem pH-Wert zwischen 6,5 bis 9,0 equilibriert. Innerhalb dieses pH-Bereichs wurden mit den beiden Harzen eine ähnliche Aufreinigungswirkung und Ausbeute erzielt. Der Q Sepharose FF Träger wurde jedoch deshalb verwendet, weil seine Regenerations- und Equilibrierungsprotokolle einfacher sind. Für diese Chromatographien wurde 5 mM HEPES, 1 mM Calciumchlorid pH 7,5 Puffer verwendet. Der equilibrierte Collagenaseenzym-Pool wurde auf das equilibrierte Harz mit einer Durchflußgeschwindigkeit bis zu 8 cm/min. (üblicherweise 1 bis 2 cm/min.) aufgetragen. Durchschnittlich wurden 20 bis 50 mg Enzymmischung pro ml Harz aufgetragen. Sobald die Mischung auf das Harz aufgetragen war, wurden die Enzyme mit einem linearen Calciumchloridgradienten von 1 bis 100 mM eluiert. Der verwendete Gradient betrug 20 bis 30 Säulenvolumina. Das Enzym Collagenase II eluierte bei ungefähr 15 bis 20 mM Calcium, Collagenase I eluierte bei ungefähr 30 bis 35 mM Calcium und die neutrale Protease eluierte bei ungefähr 60 bis 70 mM Calcium.
Die gewonnenen Enzyme wurden gegen 5 mM HEPES, 1 mM Calciumchlorid pH 7,5 Puffer equilibriert und bei oder unter –20°C tiefgefroren aufbewahrt. Werden die Collagenaseenzyme auf diese Weise aufgereinigt und unter diesen Bedingungen aufbewahrt, so können sie mindestens zwei Jahre lang ohne nachweislichen Aktivitätsverlust aufbewahrt werden.
Auf diese Weise hergestellte Collagenase I und II haben sich als im wesentlichen clostripainfrei erwiesen. Unserer Erfahrung nach weist auf diese Art und Weise hergestelltes Material weniger als 3 BAEE-Einheiten Clostripainaktivität und üblicherweise eine Aktivitätseinheit oder noch weniger auf. Dies entspricht einem sehr hohen Reinheitsgrad (98 bis 99%) bei beiden Collagenasekomponenten. In Tabelle 1 unten sind die typischen Enzymaktivitäten der aufgereinigten Enzymkomponenten dargestellt. Tabelle 1 – Typische Enzymaktivitäten der aufgereinigten Enzymkomponenten
BEISPIEL 2: HERSTELLUNG EINER ENZYMZUSAMMENSETZUNG FÜR DIE ISOLATION VON HEPATOZYTEN AUS DER LEBER
Collagenase I und II, die sehr gut löslich sind, wurden wie oben in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und als tiefgefrorene Flüssigkeiten aufbewahrt. Thermolysin ist jedoch wesentlich schlechter löslich und wesentlich schwieriger zu lösen, insbesondere in Konzentrationen von über 2,0 mg/ml. Um dieses Enzym reproduzierbar zu solubilisieren, bediente man sich einer Abwandlung des von Matsubra (Methods in Enzymology v. 19 S. 642–651) beschriebenen Verfahrens. Die gewünschte Menge trockenes Thermolysin (Boehringer Mannheim Corporation, Biochemicals Kat. Nr. 161586) wurde in ein Behältnis mit einer entsprechenden Größe gegeben. Es wurde mit so viel hochreinem Wasser versetzt, daß man eine Thermolysinsuspension mit einer Konzentration von 8 mg/ml erhielt. Nach Mischen im Eisbad zur 5 Hydratisierung der Thermolysinkristalle wurde mit so viel kalter verdünnter Natronlauge versetzt, daß der pH-Wert auf ungefähr 10,5 eingestellt wurde. Falls erforderlich kann der pH-Wert auf 11,5 angehoben werden, um ein vollständiges Solubilisieren zu gewährleisten. Nach Beendigung der Solubilisierung wies die Lösung eine hellgelbe bis hellbeige Farbe auf. Der pH-Wert dieser Lösung wurde anschließend mit verdünnter Essigsäurelösung auf 8,5 gesenkt. HEPES-freie Säure funktioniert ebenfalls gut und ist mit der Pufferlösung kompatibel. Nach dem Solubilisierungsvorgang kann eine Thermolysinlösung mit einer Proteinkonzentration von 5 bis 6 mg/ml bei 0 bis 8°C mindestens mehrere Stunden lang aufbewahrt werden.
Es wurden Enzymzusammensetzungen dadurch hergestellt, daß man spezifische Mengen jedes Enzyms vermischte. Die Menge jedes Enzyms wurde aufgrund seiner Extinktion bei 280 Nanometern bestimmt. Im Fall von Collagenase I und II weist eine Lösung mit einer Konzentration von 1,0 mg/ml eine Extinktion von 1,4 Extinktionseinheiten (AU) auf und eine Thermolysinlösung mit einer Konzentration von 1,0 mg/ml eine Extinktion von 1,1 AU. Mit diesen Werten wurden Lösungen von jeder Komponente hergestellt, und die berechnete Anzahl Extinktionseinheiten für jede Komponente wurde vermischt, um zu den erwünschten Mischungen zu gelangen.
Die Collagenase-I- und II-Proben von Beispiel 1 oben wurden aufgetaut (alle Vorgänge sollten zur Maximierung der Enzymstabilität bei 0 bis 8°C durchgeführt werden). Es wurde eine Probe des Enzyms Collagenase I hergestellt, die 3,48 mg Protein (4,87 AU) enthielt. Diese Probe wurde mit einer Probe des Enzyms Collagenase II, die 2,32 mg Protein (3,25 AU) enthielt, versetzt. Diese Mischung von Collagenase I und II wurde mit einem Volumen Thermolysinlösung versetzt, das 1,82 mg dieses Enzyms (2,00 AU) bereitstellte, versetzt und gut vermischt.
Nach dem Mischen kann die Enzymzusammensetzung mehrere Stunden lang im Eisbad aufbewahrt werden, ohne daß ein Aktivitätsverlust eintritt. Für eine längere Lagerung wird jedoch empfohlen, die Zusammensetzung als gefrohrene Flüssigkeit oder als Lyophilisat bei –20°C oder darunter aufzubewahren. Die auf diese Art und Weise hergestellten Mischungen sind mehrere Jahre lang stabil. Für 6 bis 12 Gramm Leber stellten die in Tabelle 2 unten gezeigten Enzymmengen eine optimale Mischung mit Isolation von Hepatozyten dar. Tabelle 2 – Enzymzusammensetzung für die Freisetzung von Zellen aus Rattenleber
Bei der oben in Tabelle 2 beschriebenen Enzymzusammensetzung steuerte die Collagenase I ungefähr 0,7 bis ungefähr 1,7 Wunsch-Einheiten Collagenase-Aktivität und die Collagenase II ungefähr 23,2 bis ungefähr 31 Wunsch-Einheiten Aktivität bei. Da das Thermolysin keine wesentliche Wunsch-Aktivität bereitstellte, ergab die Gesamtzusammensetzung ungefähr 24 bis ungefähr 33 Wunsch-Aktivitätseinheiten mit einer durchschnittlichen Aktivität von etwa 30 Wunsch-Einheiten. Die Gesamtzusammensetzung wies ungefähr 8.500 bis ungefähr 14.500 FITC-Casein-Aktivitätseinheiten auf, wobei die durchschnittliche Aktivität ungefähr 12.000 FITC-Casein-Einheiten betrug. Dementsprechend beträgt der Verhältnisbereich FITC-Casein-Einheiten der Zusammensetzung zu Wunsch-Einheiten der Zusammensetzung 8.500/33 bis 14.500/24 bzw. ungefähr 250:1 bis ungefähr 600:1, wobei das durchschnittliche Aktivitätsverhältnis 12.000/30 bzw. ungefähr 400:1 beträgt.
Es wird erwartet, daß sich die oben für die Freisetzung von Zellen aus Rattenleber beschriebene Enzymzusammensetzung auch annehmbar für andere Gewebetypen eignet. Wie dem Fachmann klar sein wird kann zur Optimierung der aufgereinigten Enzymmischung für die Freisetzung von Zellen aus bestimmten Gewebetypen eine gewisse Abwandlung erforderlich sein; so kann zum Beispiel bei Geweben, die mehr Collagen enthalten, eine verstärkte Collagenase-Aktivität erforderlich sein und bei Geweben, die mehr Nichtcollagenproteine enthalten, kann eine verstärkte Protease-Aktivität erforderlich sein. Ähnlich können größere oder kleinere Gewebeproben eine entsprechende Wandlung der Enzymaktivität erforderlich machen.
BEISPIEL 3: ABBAU VON RATTENLEBER FÜR DIE ISOLATION VON HEPATOZYTEN
Es wurden aufgereinigte Enzymzusammensetzungskombinationen auf ihre Fähigkeit, freie Hepatozyten aus Rattenleber freizusetzen, geprüft. Für die Auswertungen wurden die Protokolle von Seglen mit kleineren Abwandlungen verwendet (Seglen, Exp. Cell Res. 82, S. 391–398 (1973)). Bei der Freisetzung von Zellen aus dem Organ wurden die unten beschriebenen Puffer verwendet. Alle Puffer wurden mit hochreinem Wasser hergestellt und zur Gewährleistung ihrer Sterilität durch ein 0,2-Mikrometer-Filter gegeben.
Perfusionspuffer:
800 ml Wasser wurden mit 8,3 g Natriumchlorid, 0,5 g Kaliumchlorid und 2,4 g HEPES versetzt. Nach dem vollständigen Auflösen wurde der pH-Wert auf 7,4 eingestellt und das Volumen auf 1.000 ml gebracht.
Abbaupuffer:
800 ml Wasser wurden mit 3,9 g Natriumchlorid, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,7 g Calciumchlorid-dihydrat und 24 g HEPES versetzt. Nach dem vollständigen Auflösen wurde der pH-Wert auf 7,6 eingestellt und das Volumen auf 1.000 ml gebracht.
Suspensionspuffer:
800 ml Wasser wurden mit 4,0 g Natriumchlorid, 0,4 g Kaliumchlorid, 7,2 g HEPES, 0,18 g Calciumchlorid-dihydrat, 0,15 g Kaliumphosphat, 0,1 g Natriumsulphat, 0,13 g Magnesiumchlorid hexahydrat, 6,9 g (2-{[Tris(hydroxymethyl)methyl]amino}ethansulfonsäure) (TES), 6,5 g {N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycin} (TRICINE) und 2,1 g Natriumhydroxid versetzt. Nach dem vollständigen Auflösen wurde der pH-Wert auf 7,6 eingestellt und das Volumen auf 1.000 ml gebracht.
Waschpuffer:
800 ml Wasser wurden mit 8,3 g Natriumchlorid, 0,5 g Kaliumchlorid, 2,4 g HEPES und 0,18 g Calciumchlorid-dihydrat versetzt. Nach dem vollständigen Auflösen wurde der pH-Wert auf 7,4 eingestellt und das Volumen auf 1.000 ml gebracht.
Männliche Wistar-Ratten (150 bis 200 g) wurden mit intraperitoneal injiziertem Pentabarbitol (10 mg/100 g Körpergewicht) betäubt. Die Bauchhöhle wurde geöffnet und eine Kanüle wurde in die Vena cava inferior zwischen Leber und Niere ingesetzt. Die Vena cava wurde oberhalb der Leber mit einer Ligatur versehen und die Pfortadervene wurde mit einem Schnitt versehen bzw. darin eine Kanüle eingeführt, um ein Rückströmen aus der Leber zu ermöglichen. Die Leber wurde mindestens fünf Minuten lang mit dem Perfusionspuffer mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 30 ml/min. perfundiert. Die Enzymzusammensetzung aus Beispiel 2 oben wurde in 300 ml Abbaulösung gelöst und bei 37°C so lange inkubiert, bis sie warm war. Anschließend wurden Zellen aus der Leber dadurch freigesetzt, daß man die Abbaulösung so lange mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 30 ml/min. durch das Organ durchströmen ließ, bis dieses erweicht war. Die Abbauzeit wurde festgehalten.
Das erweichte Organ wurde entfernt und in zuvor mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid durchströmtem Suspensionspuffer vorsichtig zerlegt. Verbleibendes Gewebe wurde in kleine Stücke geschnitten, und gegebenenfalls vorhandene Blutgefäße und Membranen wurden entfernt. Die Gewebesuspension wurde mit Suspensionspuffer auf ein Endvolumen von 150 ml gebracht und unter vorsichtigem Rühren 25 min. lang bei 37°C inkubiert, um die Hepatozyten zu dispergieren. Nach dem Abfiltrieren von Gewebestücken wurden die Hepatozyten durch fünfminütiges Zentrifugieren bei 20 × G bei 4°C zu einem Pellet sedimentiert. Die Nichthepatozytenzellen, beschädigte Hepatozyten sowie Zelltrümmer befanden sich im Überstand und wurden durch Absaugen entfernt und verworfen. Die Hepatozyten wurden noch mindestens zweimal mit kalter Waschlösung gewaschen und zentrifugiert. Es wurde der endgültige Zellgehalt und die Lebensfähigkeit in % bestimmt. Vier Millionen Hepatozyten wurden auf mit Collagen beschichteten Kulturplatten mit einem Durchmesser von 60 ml ausplattiert und bei 37°C in 95% Luft und 5% Kohlendioxid bei einer relativen Feuchtigkeit von 95% inkubiert. In entsprechenden Zeitabständen wurden Funktionsassays durchgeführt.
BEISPIEL 4: ABBAU VON RATTEN-EPIDERMISFETT ZUR ISOLATION VON MIKROGEFÄSS-ENDOTHELZELLEN
Zur Freisetzung von Zellen aus Proben von Ratten-Fettpolstergewebe zur Gewinnung von Mikrogefäßzellen wurde eine Enzymzusammensetzung, die 2,32 mg Collagenase II, 3,48 mg Collagenase I und 1,82 mg Thermolysin enthält, verwendet. Es wurde gemäß einer leichten Abänderung der Vorschrift von Rodbell (J. Biol. Chem., Bd. 239, S. 375 (1964)) vorgegangen. Die bevorzugte Mischungszusammensetzung wurde in 20 ml physiologischer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 1,0 mg/ml fettsäurefreies Rinderserum Albumin (BSA) enthielt und durch ein 0,2-Mikrometer-Celluloseacetatfilter sterilisiert wurde, rekonstituiert. Vier fein zerkleinerte Epididymis-Fettpolster (Fettvolumen durchschnittlich 3 bis 5 ml) von Ratten im Alter von 8 bis 10 Wochen wurden in 10 ml der Enzymmischungslösung gegeben. Der Abbau fand bei 37°C in einem Schüttelwasserbad über einen Zeitraum von 10 bis 15 min. statt. Die Zellen wurden durch vierminütiges Zentrifugieren bei 700 × G gewonnen. Aufschwimmendes Fett und Enzymmischungslösungen wurden abgesaugt und verworfen. Das Endothelzellpellet wurde zweimal in PBS-Puffer, der 1,0 mg/ml BSA enthielt, suspendiert und die Zellen wurden durch vierminütiges Zentrifugieren bei 700 × G und ein abschließendes Zentrifugieren in normalem PBS-Puffer gewonnen. Die Zellen standen nun für die Zählung, die Prüfung der Lebensfähigkeit, das Kultivieren oder ein weiteres Fraktionieren bereit.

Claims

Enzymzusammensetzung, die Collagenase I und Collagenase II aus Clostridium histolyticum und eine Endoprotease umfaßt, wobei diese Enzymzusammensetzung dadurch hergestellt wird, daß man Collagenase I mit einer Wunsch-Aktivitätseinheit von ungefähr 0,2 U/mg bis etwa 0,6 U/mg und Collagenase II mit einer Wunsch-Aktivitätseinheit von ungefähr 9,5 U/mg bis ungefähr 13,5 U/mg zusammenbringt, wobei das Verhältnis zwischen der Masse der Collagenase II zu der Masse der Collagenase I plus der Masse der Collagenase II in der Enzymzusammensetzung ungefähr 0,3 bis ungefähr 0,6 beträgt, und die Endoprotease in einer Menge zugibt, die ausreicht, um das Verhältnis der gesamten FITC-Casein-Aktivitätseinheiten der Enzymzusammensetzungen zu den gesamten Wunsch-Aktivitätseinheiten der kombinierten Masse der Collagenase I und Collagenase II auf ungefähr 250:1 bis ungefähr 600:1 zu erhöhen.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Endoprotease um eine neutrale Protease handelt.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Endoprotease um Thermolysin handelt und die Zusammensetzung im wesentlichen frei von Endotoxinen ist.
Enzymzusammensetzung, die Collagenase I und Collagenase II aus Clostridium histolyticum und Thermolysin umfaßt, wobei diese Enzymzusammensetzung dadurch hergestellt wird, daß man Collagenase I mit einer Wunsch-Aktivitätseinheit von ungefähr 0,2 U/mg bis etwa 0,6 U/mg und Collagenase II mit einer Wunsch-Aktivitätseinheit von ungefähr 9,5 U/mg bis ungefähr 13,5 U/mg zusammenbringt, wobei das Verhältnis zwischen der Masse der Collagenase II zu der Masse der Collagenase I plus der Masse der Collagenase II in der Enzymzusammensetzung ungefähr 0,3 bis ungefähr 0,6 beträgt, und das Thermolysin in einer Menge zugibt, die ausreicht, um das Verhältnis der gesamten FITC-Casein-Aktivitätseinheiten der Enzymzusammensetzungen zu den gesamten Wunsch-Aktivitätseinheiten der kombinierten Masse der Collagenase I und Collagenase II auf ungefähr 400:1 zu erhöhen.
Verfahren zur Herstellung einer Enzymzusammensetzung, die sich für die Isolation von lebenden Zellen aus Gewebe eignet, wobei dieses Verfahren den Schritt umfaßt, daß man Collagenase I von Clostridium histolyticum mit einer Wunsch-Aktivitätseinheit von ungefähr 0,2 u/mg bis etwa 0,6 U/mg und Collagenase II von Clostridium histolyticum mit einer Wunsch-Aktivitätseinheit von ungefähr 9,5 U/mg bis ungefähr 13,5 U/mg sowie eine Endoprotease in einer Menge, die ausreicht, um die FITC-Casein-Aktivität der Enzymzusammensetzung auf ein Niveau anzuheben, daß das Verhältnis der gesamten FITC-Casein-Aktivitätseinheiten in der Enzymzusammensetzung zu den gesamten Wunsch-Aktivitätseinheiten der kombinierten Masse von Collagenase I und Collagenase II ungefähr 250:1 bis 600:1 beträgt, zusammenbringt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei der Endoprotease um Thermolysin handelt.