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Verfahren zur Herstellung eines proteolytischen Enzyms Die Erfindung
betrifft die Herstellung eines neuen proteolytischen Enzyms.
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Proteolytische Enzyme, auch als Proteasen bezeichnet, fördern den.
Abbau der Proteine zu Proteinspaltstücken, Peptonen, und Aminosäuren. Mehrere solche
Enzyme sind bekannt und finden ausgedehnte technische Verwendung. Als Beispiele
seien genannt: das im Pancreassaft vorkommende Trypsin, das in der Mucosa des Magens
vorkommende Pepsin, Rennin, das im vierten Magen junger Kälber abgesondert wird,
und Papain, das aus dem Saft des exotischen Papaya-Baumes gewonnen werden kann..
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Die obengenannten proteolytischen Enzyme und diejenigen von ähnlichem
Charakter und Ursprung haben mehrere deutliche Nachteile. Trypsin hat eine. kurze
Halbwertzeit (1!z Stunde) ; es ist instabil, kostspielig zu reinigen und erfordert
ein neutrales oder schwach alkalisches pH zur Entfaltung optimaler proteolytischer
Aktivität. Pepsin ist nur im stark sauren p$-Bereich von 1,5 bis 4,5 aktiv. Rennin
hat eine sehr beschränkte technische Anwendbarkeit. Es ist nur insofern von Interesse,
als es eine schnelle Gerinnung der Milch durch Umwandlung von Casein zu Paracasein
bewirkt. Der Papaya-Baum, aus dessen Latex Papain erhalten wird, ist im tropischen
Klima heimisch. Das Rohpapain muß deshalb von sehr weit entfernten Gebieten, wie
Ceylon und Afrika, eingeführt werden. Obgleich er in bestimmten südlichen Teilen
der Vereinigten Staaten gezüchtet werden kann, sind die Laborkosten für Extraktion
und Verarbeitung der Latex untragbar hoch.
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Ein anderer bemerkenswerter Nachteil des Papains als industriell verwertbares
Enzym ist seine außerordentlich chemische Empfindlichkeit. Da das Papainmolekül
eine Sulfhydrylgruppe enthält, ist das Enzym durch oxydierende Mittel leicht angreifbar.
So bilden sich, wenn man Latex der Luft aussetzt, sei es auch nur für eine kurze
Zeitspanne, Dithiogruppen, die den Aktivitätsgrad der Latex herabsetzen. Daher ist
die Zugabe von Reduktionsmitteln, wie Cystein, erforderlich, ummaximale proteolytischeAktivität
zuerlangen.
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Da die gegenwärtig verfügbaren proteolytischen Enzyme von unbekannter
chemischer Struktur sind und deshalb. technisch nicht durch Synthese herstellba.r
sind, bildeten die natürlich vorkommenden Quellen., wie tierische Mägen., Pancreasdrüsen
und Pflanzensäfte, die Hauptquellen für diese Enzyme.
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Seit einigen Jahren sind beträchtliche Anstrengungen unternommen worden,
Schimmelpilze und Fungi als eine billige, bequem zugängliche Quelle für pro,-teolytische
Enzyme zu verwenden. Einige Untersuchungen waren auf Gärungsmethoden, Aufbau der
Medien und geeignete Bedingungen für optimale Produktion und Gewinnung proteolytischer
Enzyme g& richtet. So hat Maxivell (Australian Journal Scientific Research,
Series B, 5:42-55, 1952) gezeigt, daß ein proteolytisches Enzym hervorgebracht wird,
wenn, ein Stamm des Schimmelpilzes Aspergillus oryzae auf einem modifizierten Raulin-Medium
gezüchtet wird. Andere Versuche mit diesen und anderen Schimmelpilzen sind in der
Literatur durch Beispiele belegt. Es ist auch bereits bekannt, Schimmelpilze unter
anaeroben Bedingungen zu züchten.
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Die Mehrzahl der früheren Versuche zur Pilzzüchtung unter Bedingungen,
die für die industrielle Herstellung proteolytischer Enzyme geeignet sind, war jedoch
nur in beschränktem Umfang erfolgreich wegen der untragbar teuren Medien, die zur
Züchtung der Pilze erforderlich waren, der langen Zeitspanne, die zur Fermentierung
erforderlich war, des Fehlens geeigneter Methoden zur Abtrennung und Reinigung des
Enzyms oder wegen verhältnismäßig geringer Ausbeuten. Außerdem sind die Enzyme,
die unter den von diesen Autoren beschriebenen Bedingungen gewonnen werden, in ihrer
proteolytischen Aktivität sehr beschränkt, sowohl im Anwendungsbereich als auch
in proteolytischer Wirksamkeit. Ferner ist ihr Stabilitätsbereich hinsichtlich des
pH, ähnlich wie bei Trypsin und Pepsin, außerordentlich eng.
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Es wurde nun gefunden, daß man ein proteolytisches Enzym in guten
Ausbeuten durch submerse Züchtung von Schimmelpilzen herstellen. kann., wenn man
Schimmelpilze aus einer oder mehreren Gattungen
der Familie Entomophtorales
in einem wäßrigen Nährmedium züchtet.
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Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, wesentlich
bessere Ausbeuten an Proteasen als durch Züchtung anderer Schimmelpilze zu erhalten.
Nach dem Azocolltest entspricht 1 mg Trypsin etwa 60 000 Azocolleinheiten. Während
nun, eine typische Penicillinkultur nur 2000 bis 5000 Azocolleinheiten erzeugt,
können die bei dem erfindungsgemäßen Verfah.ren verwendeten Schimmelpilze bis zu
120000Azocolleinheiten erzeugen. Weiterhin ist eine Extraktion aus bestimmten Naturprodukten,
aus denen die jetzt zur Verfügung stehenden. proteolytischen Enzyme größtenteils
gewonnen, werden, nicht erforderlich. sondern es ist nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren möglich, proteolytische Enzyme mit hervorragenden Eigenschaften durch
Züchtung ganz bestimmter Schimmelpilze zu erzeugen.
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Dieses neue proteolytische Enzym eignet sich für die verschiedensten
Verwendungszwecke. Zum Beispiel müssen in der Lederindustrie zur Herstellung des
Leders aus ungegerbten Häuten die Epidermis und das subcutane Gewebe durch Enthaarung
und Abziehen der Haut entfernt werden. Dieser Prozeß des Abziehens kann durch Verwendung
des erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms in Verbindung mit einem Entkalkungsmittel,
wie Ammoniumsulfat, ausgeführt werden. Die Häute werden erst in Kalk oder in verdünntem
Natriumhydroxyd geweicht und dann in eine Lösung übergeführt, die das Enzym und
das Ammoniumsalz enthält. Dies wird im allgemeinen bei 25° und bei pH 7,5 ausgeführt.
So können Haare, Elastin und Keratose bequem entfernt und die Häute auf diese Weise
zur Gerbung vorbereitet werden.
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Ein anderes Gebiet, auf welchem das erfindungsgemäße Enzym nützliche
Anwendung findet, ist die Kälteprobe des Bieres. Es ist bekannt, daß sich eine Trübung
im Bier entwickelt, wenn es bei Temperaturen gerade über dem Gefrierpunkt nach dem
Mälzungs- und Maischungsprozeß beim Brauen gelagert wird. Diese Trübung wird durch
das Ausflocken eines gewissen Proteinrückstandes des ursprünglichen Korns hervorgerufen,
welcher sich auf etwa 0,351/o, beläuft. Die Zugabe einer kleinen Menge des proteolytischen
Enzyms verhindert diese Trübung durch Hydrolyse des zurückgebliebenen Proteins;
eine Maßnahme, die in der Bundesrepublik Deutschland nur für Exportbiere zugelassen
werden kann.
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Das Weichmachen von Fleisch durch teilweise Modifikation der Proteine
ist noch eine andere nützliche Anwendungsmöglichkeit des proteolytischen Enzyms
der vorliegenden Erfindung. Eine kleine vor dem Kochen oder Braten auf die Stücke
gestreute Menge des gepulverten Enzyms erzeugt ein zartes, leicht verdauliches Fleischprodukt.
Andere Gebiete, in denen das erfindungsgemäße Enzym Anwendung findet, sind: in der
chemischen Reinigung, besonders zur Entfernung von Eiweißflecken u. dgl., in der
Textilindustrie zur Tuchentschlichtung, in der Backwarenindustrie zur Herstellung
von Brot besserer Beschaffenheit und in der Säuglingsnährmittelindustrie als ein
Proteinverdauun;gszusatz.
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Das neue erfindungsgemäße Enzym ist ein proteinisches Material unbekannter
chemischer Struktur. 1 ccm der rohen Gärungsmaische hat eine proteo:lytische Aktivität
von nicht weniger als 15 000 Azocolleinheiten, bestimmt nach der Methode von. B
i d w e 11 und Oakley (videinfra). Eine Anzahl von Proben des amorphen festen Materials,
wie z. B. jene, die durch die nachfolgend erläuterten Verfahren hergestellt wurden
mit einem Gehalt von durchschnittlich nicht weniger als 1000 Azocolleinheiten pro
Gramm Stickstoff, üben eine deutliche proteolytische Aktivität gegen. Casein in
einem pH-Bereich von etwa 4,0 bis zu etwa 11,0 mit einem Optimum bei 9,0 aus. Das
Enzym hat einen isoelektrischen Punkt von etwa 10,2. Eine l%ige Lösung der Substanz
in Acetatpuffer von pH 6,3, extrapoliert auf die Konzentration. 0 und korrigiert
auf 20°, hat in Wasser eine Sedimeniationskonstante von 2,5 - 10-13. Eine 0,4%ige,
Lösung des Enzyms, auf 20° korrigiert, hat in Wasser eine Diffusionskonstante von
8,2 - 10-7. Eine wäßrige Lösung mit der Ionenstärke von 0,13 bei pH 8,5 in Diäthylbarbitursäurepuffer
hat eine elektrophoretische Beweglichkeit von 0,43 - 10-$. Eine Lösung derselben
Zonenstärke bei pH 10,5 in Glycokollpuffer hat eine elektrophoretische Beweglichkeit
von 0,08 # l". Unter der Annahme eines partiellen spezifischen Volumens von 0,75
entsprechen Sedimentations- und Diffusionskonstanten einem Molekulargewicht von
etwa 30 000. 5 ccm einer wäß rigen Lösung des Enzyms mit einer Konzentration von
etwa 0,5%, in 4tägigen Abständen, einem Kaninchen intravenös injiziert, rufen einen,
befriedigenden Antikörper-Titer im Antiserum des Tieres nach etwa vier oder fünf
Injektionen hervor. Das so hergestellte spezifische Antiserum reagiert positiv auf
eine Präzipitinreaktion gegen 1/2o ccm einer 0,5%igen wäßrigen Lösung des Enzyms
bei einer Verdünnung von nicht weniger als 1 : 1000. Das Enzym ist in einem pH-Bereich
von etwa 4,0 bis zu etwa 11,0 stabil.
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Die Phycomycetischen Schimmelpilze der Klasse Entomophtorales, die
beim erfindungsgemäßen Fermentierungsverfahren verwendet werden, sind von Bessy
(Morphology und Taxonomy of Fungi, S. 172 bis 177, Blakiston Comp. Philadelphia,
1950) beschrieben. Die Klasse umfaßt eine einzige Familie, die Entomophtoraceae,
die sechs Gattungen einschließt: Entomophtora, Basidiobolus, Conidiobolus, Completoria,
Massaspora und Ancylistes.
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Unter den verschiedenen Gattungen dieser Familie sind die Entomophtora,
Basidiobolus und ConidioboF lus als die bei der erfindungsgemäßen Methode am besten
verwendbaren befunden worden. Spezies der Gattungen, mit denen das erfindungsgemäße
Verfahren durchgeführt werden kann, sind z. B. die Entomophtora-Species apiculata,
coronata, sphaerosperma; die Basidiobolus-Species ranarum und die Conidiobolus species
brefeldianus.
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Obwohl die Spezies der Familie der Schimmalpilze, allgemein als Entamophtoraceae
bezeichnet, weitgehend beim erfindungsgemäßen Verfahren als Lieferanten des proteolytischen
Enzyms eingesetzt werden können, zieht man aus Gründen der Produktivität die Spezies
der Gattungen Entomoph.tora und Conidiobolus vor.
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Bei Ausführung der Erfindung ist es vorteilhaft, wenn das Nährmedium
eine assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffquelle und Spuren anorganischer Salze
enthält. Gärungsbedingungen, wie .Zeit, Temperatur und Wasserstoffionenkonzentration,
können weitgehend variiert werden, ohne aus dem Bereich der Erfindung zu
gelangen. Am Ende der Gärungsperiode kann das Enzym aus der Gärungsmaische durch
eine Reihe von Verfahren, wie z. B. Adsorption an Diatomeenerden oder Magnesiumsilicat
und Elution hiervon mit wäßrigen Medien im deutlich alkalischen pH-Bereich, wiedergewonnen,
werden.
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Die mannigfaltigsten Substanzen können als Kohlenstoffquellen in dem
Medium verwendet werdenr
Diese können in Wasser entweder löslich
oder unlöslich sein, es ist nur wünschenswert, daß die verwendde:ten Substanzen.
leicht assimilierbar für die Schimmelpilze sind. Beispiele seien genannt: Pentosen,
wie Arabinose, Ribose und Kylose; Monosaccharide wie 1Ianno- Lävulose und Galactose;
die Disaccharide wie Trehalose, Maltose, Lactose C@.llobiose und Saccharose; die
Polysaccharide wie Stärke; die höheren Alkohole wie Glycerin, Mannst, Sorbit und
Inosit; und verschiedenartige Quellen wie Äthylalkohol und Calciumcarbonat.
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Zu bevorzugen ist ein Medium, das eine Menge von etwa 5 Gewichtsprozent
einer Kohlenstoffquelle enthält. Es wurde gefunden, daß die Gegenwart von Zucker
für das Wachstum des Schimmelpilzes notwendig ist, wenn ein hoher Ertrag an Mycel
gewünscht wird. Obwohl es möglich ist, den Schimmelpilz in einem Nährmedium, das
kein Kohlenhydrat als Kohlenstoffquelle enthält, erfolgreich zu züchten, sind die
Enzymausbeuten., die unter solchen Bedingungen erzeugt werden, so niedrig, daß sie
wenig technische Bedeutung haben.
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Stickstoff in, assimilierbarer Form kann. durch tierische oder pflanzliche
Proteine, Sojabohnenmehl, Casein, Peptone, Polypeptide oder Aminosäuren geliefert
werden. Als typische Beispiele können die bei der Tierschlachtung anfallende Flüssigkeiten
(animal stick liquor), Natriumnitrat, Asparagin, Harnstoff, Histidin. und Guanin
genannt werden. Eine Menge von 1% an Caseinhydrolysat entweder allein oder zusammen
mit einem Zucker wie Dextrose ergibt beträchtliche Mengen des Enzyms. Verschiedene
Mengen anorganischer Salze können, wenn erwünscht, zugesetzt werden, entweder zu
einer Kombination von Caseinhydrolysat und Zucker oder zu einem Zucker allein. Es
wurde gefunden, daß, wenn Schlachtflüssigkeit (animal stick liquor) als Stickstoffquelle
verwendet wird, die besten Resultate dann. erzielt werden, wenn auch ein Zucker
im Medium enthalten ist, obwohl auch ohne Zugabe einer Kohlenhydrat-Kohlenstoffque:lle
gute Erträge erzielt werden.
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Die optimalen, PH-Bedingungen für das Wachstum des erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms können von etwa 5,0 bis zu etwa 9,0 variiert werden.. Um
jedoch beste Resultate zu erzielen, wurde gefunden, daß ein Bereich von etwa 6,0
bis zu etwa 8,0 vorzuziehen ist. Oberhalb dieser Grenze ist das Enzym so aktiv,
daß es sich selbst zerstört, jedoch ist ein pH von weniger als 6,0 für die Entwicklung
der Mikroorganismen ungünstig. Die Einstellung des pH kann mit jeder geeigneten
Base wie Natriumhydroxyd, Phosphatpuffer, Natriumcitrat, l,Tatriumacetat oder einem
anderen geeigneten Material, welches das p$ in den gewünschten. Bereich bringt,
erfolgen..
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Die Temperatur des Nährmediums kann während der Fermentierun.g des
Schimmelpilzes zwischen etwa 20 und 30° gehalten werden, vorzugsweise in einem Bereich
von etwa 25 bis 30°. Wenn man die Temperatur über 30° ansteigen läßt, wird wenig
oder kein Enzym gebildet, und man erhält ein hefeähnliches Wachstum. Wenn die Temperatur
merklich unter 25° absinkt, ist das Wachstum des Schimmelpilzes zu langsam.
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Die erforderliche Zeit für die Produktion einer maximalen Menge des
proteolytischen Enzyms kann weitgehend variiert werden, je nach der Natur der im
JTährmedium verwendeten Bestandteile. Eine Periode von etwa 24 bis etwa 90 Stunden
wird jedoch gewöhnlich als angemessen für die Produktion einer optimalen Enzymmenge
betrachtet. In einer bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung wird eine 24-Stunden-Impfung
des Schimmelpilzes zu 50 ccm Medium in einer Menge, zugefügt, die ausreicht, eine
Konzentration von 0,5 bis 1% zu erhalten. Der Kolben wird bei 26 bis 29° in einer
Schüttelkultur etwa 48 bis 96 Stunden inkuhieTt. Während der Gärung wird sterile
Luft durch das Medium geleitet, wobei die Belüftung gleichzeitig als Rührwerk dient.
Der Grad der erzeugten. proteolytischen Enzymaktivität wird dann durch eine modifizierte
Azocollprobe ermittelt, nach einer nachfolgend noch genauer beschriebenen Methode.
Die maximale Produktion wird gewöhnlich in einer Zeitspanne von etwa 48 bis 72 Stunden
beobachtet.
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Der zur Animpfun.g verwendete Schimmelpilz kann auf einem geeigneten
Boden wie; Schrägagar gezüchtet werden. Um eine 24-Stunden-Impfung zu erhalten,
kann eine Öse voll vegetativem Myeel von einem Schrägagar genommen, in 50 ccm Nährmedium
überführt und 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 20 bis 30° inkubiert werden..
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Entschäumun.gsmittel können aseptisch zum Gärungsmedium nach Bedarf
zugegeben werden. Es wurde gefunden, daß 10/a Octad.ecanol in Specköl für diesen
Zweck vorzuziehen ist, obwohl eine große Zahl anderer Mittel ebenfalls vorteilhaft
sein kann. Als Beispiel hierfür können Sojabohnenöl, Rizinusöl, Olein,, sulfonierte
Öle, Specköl und bromiertes Rizinusöl genannt werden. Mengen zwischen 0,1 bis 10/0
können zugesetzt werden.
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Die besten Resultate erhält man, wenn ein flüssiges Medium, das anorganische
Salze enthält, verwendet wird. Das erfindungsgemäße Verfahren wird deshalb vorzugsweise
mit einem flüssigen Medium durchgeführt, das Spurens mineralischer Bestandteile,
die entweder hinzugefügt oder natürlich vorhanden sind, enthält. Nitrate, Phosphate,
Sulfate und Chloride können als Salze der Schwermetalle, der Erdalkalimetalle oder
Alkalimetalle, wie z. B. Calcium, Cobalt, Natrium, Kalium, Magnesium oder Mangan,
eingesetzt werden. Mit Spurenmengen sind Mengen zwischen 0,001 und 0,00019/o gemeint.
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Am Ende des Gärungsprozesses, wenn durch die Azocollprobe festgestellt
ist, daß der maximale Ertrag an Protease erreicht ist, wird das Enzym einem Trennungs-
und keinigungsprozeß unterworfen. Mit Rücksicht auf seinen labilen Charakter ist
es zweckmäßig, selektive Re-inigungsma,ßnahmen anzuwenden und außerdem solche, bei
denen minimale Denaturierung und maximale Trennung des Enzyms von den. übrigen Bestandteilen.
der Gärungsflüssigkeit gewährleistet sind.
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Es kann zwar eine Vielzahl von ;Methoden für die Trennung des Enzyms
von der Gärungsflüssigkeit angewandt werden, doch wurde eine besonders brauchbare
Methode gefunden, die in den Bereich der vorliegenden. Erfindung einbezogen werden
soll. Nach diesem Verfahren wird die proteolytische Aktivität an ein geeignetes
Adsorptionsmittel bei einem Maischungs-pH, der im Bereich von etwa 6,5 bis etwa
8,5 variiert, adsorbiert. Die Adsorption kann, vor oder nach der Trennung der Zellen.
von. der Maische stattfinden. Das das Enzym enthaltende Adsorptionstnaterial wird
von der Gärungsflüssigkeit durch geeignete Maßnahmen wie Filtration oder Zentrifugieren.
getrennt und das Filtrat (oder die überstehende Flüssigkeit) verworfen. Die proteolytische
Aktivität wird gewonnen, indem man das Adsorbat mit wäßrigem Alkali wie Ammoniak,
Natrium- oder Kaliumhydroxyd in einem PH-Bereich von etwa 9,0 bis 11,5, vorzugsweise
etwa
10,5, aufschlämmt. Die Aufschlämmung wird filtriert und der Rückstand zur Erzielung
maximaler Ausbeute mit wäßrigem Alkali gewaschen. Die Waschflüssigkeit wird mit
dem Eluat vereinigt und, falls erwünscht, weiteren Trennungs- und Reinigungsverfahren
unterworfen.
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Die Adsorptionsmittel, welche vorteilhaft in vorliegender Erfindung
verwendet werden können und deren Gebrauch vorzuziehen ist, sind diejenigen, die
zu der als gereinigte Diatomeenerdenbekannten Klasse gehören. Diese sind unter verschiedenen
Handelsnamen wie »Attasorb« oder »Superfiltrol« erhältlich. Es wurde auch gefunden,
daß Magnesiumsilicate wie die technisch erhältlichen als »Magnesol« oder »Florisil«
bekannten Produkte zur Adsorption der proteolytischen Aktivität brauchbar sind.
Andere geeignete Adsorptionsmittel sind Fullererde, Aktivkohle, Lampenruß, Titanoxyd,
synthetischer Krackkatalysator und Verbindungen ähnlichen Typs. Die künstlichen
Zeolithe, wie z. B. das unter dem Warenzeichen »Permutit« erhältliche Produkt, können
ebenfalls verwendet werden.
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Wenn. ein Adsorptionsmittel vom Magnesiumsilica%typ verwendet wird,
ist es zur Erzielung bester Resultate vorzuziehen, das Adsorptionsmittel einer Vorbehan.dlung
zu unterziehen, indem man es mit verdünnter wäßriger Mineralsäure wie Salzsäure
oder Schwefelsäure wäscht, die zurückbleibende Säure mit Wasser auswäscht und vor
Gebrauch trocknet.
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Zur Erzielung maximaler Elution wird der Adsorptionskuchen in Wasser
suspendiert, auf ein hohes pl, eingestellt, gerührt und dann filtriert oder zentrifugiert.
Die Elution wird gewöhnlich bei etwa pH 10,5 ausgeführt, der Bereich kann aber von
etwa 9,0 bis 11,5 variiert werden. Im Falle eines schwachen. Adsorptionsmittels,
wie z. B. einem synthetischen Krackkatalysator, kann die Elution bei einem so niederen
pFI wie 7,4 erfolgen.
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Die Anwesenheit einer kleinen Menge von Natriumchl_orid wird im allgemeinen
als günstig für eine maximale Elution, angesehen. So ist es bei Verwehdung eines
Elutionsmittels von pH 10',5 von Vorteil, daß eine Konzentration von etwa 211/o
Natriumchlorid darin, vorliegt.
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Unmittelbar nach der Filtration wird das pH des Eluats (das die proteolytische
Aktivität enthält) auf einen Wert von etwa 6,0 bis etwa 8,0 erniedrigt, da die Stabilität
des Enzyms bei dieser Wasserstoff ionenkonzentration optimal ist. Dies kann zweckmäßig
dadurch erzielt werden, daß man zur Lösung Trockeneis oder gasförmiges Kohlendioxyd
zusetzt, bis das gewünschte PH erreicht ist.
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Das durch die vorhergehende Methode erhaltene rohe Enzym ist praktisch
frei von Verunreinigungen und kann als solches in vielen industriellen Verfahren,
wie chemische Reinigung, Entfernen von Häuten oder Tuchentschlichtung, verwendet
werden. Auf anderem Gebieten jedoch, wie der pharmazeutischen Industrie, der Brotbäckerei
oder der Säuglingsnährmittelerzeugung, kann es erwünscht sein, ein Produkt maximaler
Reinheit zu erhalten. Eine Modifikation der vorliegenden Erfindung ist es deshalb,
die teilweise gerein-*gte proteolytisch aktive Substanz weiterer I>ehan _Ilung zu
unterwerfen. Gemäß dieses Ziels des vorl,'egenden. Verfahrens wird das Enzym aus
seiner wäßrige-n Lösung durch Zugabe: eines Volumens Aceton ausgefällt. Obgleich
2 bis 4 Volumina Aceton als angemessen betrachtet werden, ist es jedoch vorzuziehen,
daß ein Volumen von etwa 21/2 bis 3 zugesetzt wird. Der erhaltene Niederschlag wird
durch Zentrifugieren oder durch Filtration mit einer geeigneten Filterhilfe, wie
Diatomeenerde, gesammelt. Wenn das letztere Verfahren angewendet wird, ist es nötig,
das Enzym von der Filterhilfe durch Waschen mit einem geeigneten wäßrigen Lösungsmittel,
wie lo/oigem Natriumchlorid, zu trennen.
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Die durch Aceton gefällte proteolytische Aktivität kann dann leicht
durch eine Anzahl einfacher Verfahren in eine stabile, technisch brauchbare Form
übergeführt werden. Unter diesen Verfahren befinden sich Wiederauflösung in, einem
Volumen von lo/oigean wäßrigen Natriumchlorid und nachfolgende Sterilisation; Lyophilisation
zur Erzielung einer stabilen festen Form oder Trocknung durch Suspension in wasserfreiem
Aceton und nachfolgender Filtrierung.
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Es wurde gefunden, daß die Verwendung eines Schutzmittels bei der
Trocknung der proteolytischen Aktivität günstig ist. Ein solches Hilfsmittel ist,
sowohl bei der Anwendung des Verfahrens der Lyophilisation als auch der Lösungsmitteltrocknung,
beispielsweise mit Aceton oder einem ähnlichen Lösungsmittel, angebracht. Es wurde
gefunden, daß als schützende Hilfsmittel für diesen Zweck Sorbit, handelsüblicher
Glucosesirup (corn syrup), Lactose, Dextrose. Gelatine und Gummiarabikum besonders
geeignet sind, doch sind auch andere für diesen Zweck bekannte Hilfsmittel ähnlicher
Natur geeignet. Das Hilfsmittel kann zweckmäßig gerade vor der Lyophilisa.tion oder
vor dem Acetonbehandlungsschritt zu der Enzymlösung -zugesetzt werden.
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Obgleich die exakte Wirkungsweise des schützen.-den Hilfsmittels nicht
bekannt ist, ist es möglich, daß es als Anfeuchtungsmittel (humectan.t) wirkt. Es
kann auch sein, daß das Hilfsmittel einfach eine Hülle um winzige Teilchen des trocknenden
Enzyms bildet und als Schutz vor der Atmosphäre dient.
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Wenn die Durchführung der Trocknung mit Aceton gewählt wird, pflegt
der Gebrauch von einem Hilfsmittel allein. die Bildung eines gummiartigen Niederschlags
zur Folge zu haben, welcher nicht in eine trockene Form gebracht werden kann. In
solchen Fällen ist es vorteilhaft, ein Füllmittel zusammen mit dem Hilfsmittel vor
Zusatz des Acetons zu verwenden. Diese Maßnahme sichert die Bildung eines festen,
behandlungsfähigen :@; iederschlags, der leicht getrocknet werden kann. Füllmittel,
die als besonders befriedigend befunden wurden, sind Stärke, Holzstoff, Magnesiuinsilicat,
Diatomeenerde u. dgl. Das schützende Hilfsmittel und die Hilfsmittel und die Füllmittel
werden zu einer wäßrigen Lösung, die die pro teolytische Aktivität enthält, gegeben,
und die Mischung wird gerührt. 2 bis 5 Volumina Aceton werden dann zugefügt, und
der aktive Niederschlag wird auf einem Filter gesammelt und mit kaltem Aceton gewaschen.
Der Niederschlag wird in wasserfreiem Aceton suspendiert, filtriert, an der Luft
getrocknet und pulverisiert. Das so erhaltene Produkt kann als solches in einem
Weiten PH-Bereich mit einer Ausdehnung von vielleicht 4,0 bis zu etwa 11,0 und mit
einem Optimum und bevorzugten Bereich von etwa 8,0 bis etwa 9.0 versendet werden.
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Wenn erwünscht, kann die Trocknung des proteolvtischen Enzyms durch
Verwendung anderer Lösun##,smittel als Aceton, die mit Wasser mischbar sind und
in denen das Enzym unlöslich ist, ausgeführt werden. Beispiele solcher Lösungsmittel
sind Dioxan und die niedermolekularen Alkylalkohole wie: Methyl-, Äthyl-, Propyl-,
Isopropyl-, Butyl- und Isobutylalkohol.
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Wenn das proteolytische Enzym für einen nichtmedizinischen Zweck bestimmt
ist, wie z. B. in der
Ledergerbung, ist es nicht notwendig, die
Fermentationsflüssigkeit kostspieligen und mühsamen Trennungsverfahren zu unterwerfen.
So kann als eine weitere Modifikation vorliegender Erfindung die pro.-teolytische
Aktivität leicht aus der Gärungsflüssigkeit mit Tannin oder anderen geeigneten Proteinfällungsmitteln
wie Phosphorwolfrasnsäure, Zinkchlorid, Elseil(III)-Chlorid usw.- ausgefällt werden.
Das Verfahren gestattet eine sehr einfache Herstellung eines brauchbaren. Produkts
aus der Gärungsmaische oder Ferinentationsflüssigkeit. Das Proteinfällungsmittel
wird einfach direkt zu der Maische oder der zellfreien Flüssigkeit zugesetzt und
der Niederschlag von. der Mutterlauge abgetrennt, mit einem Füllmittel wie Sägemehl
gemischt und getrocknet. Das Verfahren kann entweder mit oder ohne schützende Hilfsmittel
wie handelsüblicher Glycos-esirup usw. angewandt werden.
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Es ist selbstverständlich offensichtlich, daß verschiedene Kombinationen
der obigen Elemente je nach Reinheit und physikalischer Aggregation des gewünschten
Produkts angewendet werden können. Zum Beispiel kann ein hochgereinigtes, stabiles
Trockenpulver durch Adsorption, und Elution, nachfolgender Acetonfällung und erneuter
Auflösung in l%iger Kochsalzlösung, der die Zugabe eines Hilfsmittels und die Lyophilisation
folgt, erhalten werden. Wahlweise kann ein rohes Produkt einfach dadurch erhalten
werden, daß man die Aktivität an ein Ad.sorptionsmittel wie Aktivkohle adsorbiert
und den Adsorptionskuchen als solchen auf das Substrat wirken läßt. Die Variationen
und Austauschmöglichkeiten dieser verschiedenen Elemente sind dem Fachmann leicht
ersichtlich.
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Wenn ein Reinigungsverfahren durch Säurefällung wie bei der Verwendung
von Tannin angewendet wird, kann der erhaltene Komplex als solcher brauchbar sein.
Es kann jedoch vorteilhaft sein, das neue Enzym vom Tannin zu trennen, um ein reineres
Produkt zu erhalten. Demgemäß ist es vorzuziehen, die Tann.infällung in einer kleinen
Menge Wasser aufzuschlämmen und dann. 2 Volumina eines organischen Lösungsmittels
zuzusetzen., wie Aceton oder einen Alkohol, z. B. Methyl-, Äthyl-, Propyl- oder
Butylalkohol. Der Tannin-Protein-Komplex spaltet sich, und das Tannin löst sich
in dein Lösungsmittel, während die. Enzymaktivität ungelöst bleibt. Die zwei Fraktionen
können dann leicht durch Zentrifugieren oder Filtrieren getrennt werden, und die
Aktivität des festen Rückstandes kann in einer Salzlösung aufgenommen werden..
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Wie oben erwähnt, kann das Vorhandensein und der Grad der proteolytischen
Aktivität durch die Azocollprob.e bestimmt werden. Das in vorliegender Erfindung
verwendete Verfahren stellt eine Modifikation der von Bidwell (Biochemical Journal,
46, S.589 bis 598 [1950]) und von O a k 1e y et. a1. (Journal of Pathology and Bacteriology,
58, S. 229 bis 235 [April, 1946]) beschriebenen Probe dar. Dieser Test basiert auf
der Fähigkeit des proteolytischen Enzyms, gepulverte Tierhaut (hide powder), der
mit einem Azofarbstoff gefärbt ist, zu hydrolysieren. Bei Kontakt mit dem Enzym
wird das Proteinmolekül zerstört, und der Farbstoff wird in das flüssige Medium
abgegeben. Je: größer die, Hydrolysierungsfähigkeit des Enzyms ist, um so größer
ist die Intensität der durch Freisetzung des Farbstoffes hervorgerufenen Farbe beim
Vergleich mit einer Leerbestimmung. Das Enzym vorliegender Erfindung zeigt eine
charakteristische Azocollprobe von mindestens 15 000 Einheiten je ccm der Gärungsmaische.
Unter geeigneten Bedingungen für Zeit, Temperatur, pH, Belüftung, Stickstoff- und
Kohlenstoffquellen wurden Ausbeuten bis zu 75000
Einheiten je ccm erhalten.
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Gemäß der modifizierten Azocollprobe vorliegender Erfindung wird diazotierte
gepulverte Tierhaut nach der Vorschrift von Oaklev et. a1. (a. a. O.) hergestellt.
Ein Puffer von pH 7,4 bis 7,5 wird hergestellt, welcher 85 Teile Nag H P 04 - 12
H2 O, 8 Teile K H 2 P O4 und 40 Teile Na Cl enthält und auf 9000 Teile mit destilliertem
Wasser aufgefüllt wird. Eine 10-ccm-Pipette, Azocoll und Puffer werden auf 37° gebracht
und die Enzymprobe mit Puffer bis zu einer Verdünnung, welche nach Verdauung des
Azocolls eine Ablesung von 700 oder weniger in einem Klett-Summerson photoelektrischen
Kolorimeter unter Verwendung eines Grünfilters Nr. 54 ergibt, verdünnt. 0,1 ccm
der verdünnten Enzymprobe! und 9,9 ccm Puffer werden in. eine; Azocollflasche, die
50 mg des Azocollpuders enthält, gebracht, und die Flasche wird auf einer Schüttelvorrichtung
15 Minuten bei 37° inkubiert. Die Mischung wird filtriert, und die Ablesung des
Filtrats wird mit einem Klett-Instrument bestimmt, welches vorher mit Puffer auf
den Nullpunkt eingestellt wurde. Der »Azocoll-Leerwert« wird in der gleichen Weise
unter Verwendung einer 10-ccm-Probe des Puffers statt 0,1 ccm des verdünnten Enzyms
und 9,9 ccm des Puffers bestimmt. Der Azocoll-Leerwert wird von der Ablesung der
Testprobe abgezogen und der so erhaltene Wert mit dem 10fachen. Verdünnungsfaktor
multipliziert, um einen Wert zu erhalten, der dieAzocolleinheiten je ccm der ursprünglichen
Probe angibt. Zur Erläuterung soll angenommen werden, daß eine 1 : 8 verdünnte Enzymprobe
eine Ablesung von 500 ergibt und der Azocoll-Leerwert 115 beträgt. Die Differenz,
385, wird mit 10 - 8 multipliziert was 30 800 Azocolleinheiten je ccm ergibt, Die
folgenden. Beispiele sollen die. Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Alle Teile sind Gewichtsteile, wenn nicht anders angegeben.
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Beispiel 1 Ein Medium mit einem Gehalt von 1% Caseinhydr olysat, 1%
Glucose, 0,31/o Na N O., 0,10/0 K2 H P 04, 0,05 % K Cl, 0,05 0/0. Mg S 04 - 7 H2
0 und 0,0010/0 FeS 04 - 7 H20 wurde auf 12 1 mit Leitungswasser aufgefüllt
und sterilisiert. Eine Impfung von Entomophtora apiculata aus einer 30 Stunden alten
Flaschenkultur wurde dein Nährmedium zugesetzt und unter Bewegung bei einer Temperatur
von 27 bis 28° inkubiert. Nach 96 Stunden zeigte eine Probe des Nährmediums
50000 Azocolleinheiten des proteolytischen Enzyms je ccm.
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Beispiel 2 Das gleiche. Medium, das im Beispiel 1 verwendet %vurde,
tvurde mit Leitungswasser auf 100 1 aufgefüllt und etwa 30 Minuten bei 115 bis 120°
sterilisiert. Eine Impfung einer 30 Stunden alten Flaschenkultur von Entomophtora
apiculata wurde zu dem sterilen Nährmedium zugesetzt und die Fermentationstemperatur
auf 26 bis 28° gehalten. Sterile Luft wurde durch die Mischung geleitet und die
Bewegung durch mechanische Mittel besorgt. 32 Stunden nach der Animpfun.g zeigte
eine Probe des Fermentierungsmediums 21500 Azocolleinheiten des proteolytischen
Enzyms je ccm.
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Beispiel 3 Das gemäß Beispiel 1 verwendete Medium wude mit Leitungswasser
auf 1 1 aufgefüllt. Anteile von etwa
50 ccm wurden in geeignete
Fermentierungsflaschen eingebracht und diese 30 Minuten, bei 115 bis 120° sterilisiert.
Jede Flasche wurde mit 1 Volumen Conidiobolus brefeldianus Impfung aus einer 48
Stunden alten Kultur an.geimpft. Die Flaschen wurden bei 28° in einer Schüttelmaschine
mit hin- und hergehender Bewegung inkubiert. 24 Stunden. nach der Aasimpfung zeigte
das Medium bei der Prüfung 49200 Azocolleinheiten des proteolytischen Enzyms je
ccm.
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Beispiel 4 Das gemäß Beispiel 1 verwendete Medium wurde auf ein Volumen
von 12 1 gebracht und 30 bis 40 Minuten in einem geeigneten Behälter bei 115 bis
120° sterilisiert. Eine Impfung von Conidiobolus brefeldianus wurde zum Nährmedium
zugesetzt und bei einer Temperatur von 27 bis 28° inkubiert. Sterile Luft wurde
durch die Fermentierungsmischung geleitet. Die Bewegung wurde durch mechanische
Vorrichtungen besorgt. 39 Stunden. nach Inkubation zeigte das Medium bei der Prüfung
57 000 Azocolleinheiten des proteolytischen Enzyms je ccm.
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Beispiel s Das gemäß Beispiel 1 verwendete Medium wurde mit Leitungswasser
auf 2001 aufgefüllt und 30 bis 40 Minuten bei etwa 120° sterilisiert. Eine Impfung
einer 30 Stunden alten Kultur von Conidiobolus brefeldianus wurde zu dem sterilen
Medium zugesetzt und die Temperatur auf 26 bis 27° gehalten. Sterile Luft wurde
durch die Mischung geleitet, und die Bewegung auf mechanischem Wege besorgt. 40
Stunden hiernach zeigte das Medium bei der Prüfung 43 500 Azocolleinheiten des proteolytischen
Systems j e ccm.
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Beispiel 6 Ein Medium mit einem Gehalt von 2 Teilen Schlachtflüssigkeit
und 3 Teilen Glucose wurde mit Leitungswasser auf 100 Teile aufgefüllt und sterilisiert.
Anteile mit einem Gehalt von 50 Teilen des Mediums wurden in geeignete Behälter
eingebracht und mit einer 24-Stunden-Kultur von Conidiobolus brefeldianus aasgeimpft.
Das Medium wurde 3 Tage bei 28° auf einer mechanischen Schüttelmaschine inkubiert.
Am Ende dieser Zeit zeigte das Medium bei der Prüfung 78000 Azocolleinheiten
proteolytischer Aktivität je ccm.
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Beispiel ? Das gemäß Beispiel 6 verwendete Medium wurde mit Leitungswasser
auf 100 Teile gebracht und sterilisiert. Ein Volumen von 400 Teilen wurde in ein
geeignetes Gefäß eingebracht und mit einer 24 Stunden alten Kultur von Conidiobolus
brefeldianus aasgeimpft. SterileLuft wurde durch dieFermentierungsmischung geleitet
und die Bewegung auf mechanischem Wege besorgt. 70 Stunden nach Aasimpfung zeigte
das Medium bei der Prüfung 79 000 Azocolleinheiten proteolytischer Aktivität je
ccm.
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Beispiel 8 Eine Impfung von Conidiobolus villosus kann zu dem gleichen
Medium, wie es im Beispiel 1 verwendet wurde, zugesetzt, mit Leitungswasser auf
100 gebracht und die Mischung bei einer Temperatur von 26 bis 28° inkubiert werden.
Sterile Luft kann durch die Mischung geleitet und die Bewegung durch mechanische
Vorrichtungen besorgt werden. Gute Ausbeuten an proteolytischem Enzym werden nach
etwa 3 Tagen erhalten.
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Beispiel 9 Eine Impfung von Basidiobolus ranarum kann zu dem gleichen
Medium, wie es im Beispiel 1 verwendet wurde, zugesetzt, mit Leitungswasser auf
100 gebracht und die Mischung bei einer Temperatur von 26 bis 28° inkubiert werden.
Sterile Luft kann durch die Mischung geleitet und die Bewegung auf mechanischem
Wege besorgt werden. Gute Ausbeuten des proteolytischan Enzyms werden nach etwa
48 Stunden erhalten.
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Beispiel 10 Eine Impfung von Entomophtora eoranata kann zu dem gleichen
Medium, wie es im Beispiel 1 verwendet wurde, zugesetzt, mit Leitungswasser auf
100 gebracht und die Mischung bei einer Temperatur von 26 bis 28° inkubiert werden.
Sterile Luft kann durch die Mischung geleitet und die Bewegung mit mechanischen
Vorrichtungen besorgt werden. Gute Ausbeuten an proteolytischem Enzym werden nach
etwa 36 Stunden erhalten.
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Beispiel 11 Zu dem gemäß Beispiel 6 verwendeten und mit Leitungswasser
auf 100 Teile gebrachten Medium können Impfungen von Conidiobolus villosus oder
Basidiobolus ranarum oder Entomophtora sphaerosperma oder Entomophtora coranata
zugefügt werden. Nach 3tätiger Inkubation des Mediums bei 28° auf einer mechanischen
Schüttelmaschine können gute Ausbeuten des proteolytischen Enzyms erhalten werden.
Beispiel 12 15 Gewichtsteile von mit Schwefelsäure gewaschenem Magnesiumsilicat
wurden zu 1000 Volumteilen des zellfreien Gärsaftes (der gemäß des Verfahrens von
Beispiel 4 hergestellt wurde) zugesetzt und die Mischung gerührt. Die Suspension
wurde filtriert und der Filterkuchen mit 100 Volumteilen destilliertem Wasser gewaschen.
Der Filterkuchen, wurde in einer kalten Lösung von 100 Volumteilen konzentriertem
wäßrigem Ammoniak und 100 Volumteilen Wasser aufgeschlämmt und die Mischung filtriert.
Der Kuchen wurde mit einer kleinen Menge einer kalten Ammoniaklösung gewaschen,
und Filtrat und Waschflüssigkeit wurden vereinigt. Der zellfreie Gärsaft ergab bei
der Prüfung vor Adsorption und Elution einen Gehalt von etwa 25 Millionen Azocolleinheiten
proteolytischer Aktivität je 1000 Volumteile der Flüssigkeit. Das Eluat zeigte nach
Adsorption und Elution 18 Millionen Azocolleinheiten proteolytischer Aktivität je
1000 Volumtailen der Flüssigkeit.
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Beispiel 13 Ein Volumen von einer gemäß des Verfahrens von Beispiel
4 erhaltenen fermentierten Maische wurde mit Hilfe von 2000 Gewichtsteilen Diatomeenerde
filtriert, wobei 140 000 Volumteile des zellfreien Gärsaftes gewonnen wurden. Mit
Säure gewaschenes Magnesiumsilicat wurde in einer Menge von 1 °/a dem Gärsaft zugefügt
und die Mischung gerührt. Nachdem sich die festen Bestandteile abgesetzt hatten,
wurde
das Überstehende abgehebert und der Filterkuchen mit Wasser gewaschen. Der Filterkuchen
wurde dann in 5000 bis 6000 Volumteilen kaltem Wasser aufgeschlämmt und wäßrige
Natriumhydroxydlösung der Aufschlämmung unter Rühren zugefügt, bis ein pH von etwa
10,5 erreicht und aufrechterhalten wurde-. Die alkalische Aufschlämmung wurde gerührt
und die Mischung filtriert. Das PH des Eluats wurde mit Kohlendioxyd auf etwa 8,0
eingestellt. 140000 Volumteile des zellfreien Gärsaftes zeigten bci Prüfung vor
der Reinigung etwa 1,9 Billionen Azocolleinheiten proteolytischer Aktivität. Die
6000 Volumteile des Eluats ergaben 1,7 Billionen Azocolleinheiten proteolytischer
Aktivität.
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Beispiel 14 Etwa 18 000 Volurnteile kaltes Aceton wurden dem Eluat
des vorhergehenden Beispiels zugesetzt, und die Mischung wurde einige Stunden bei
etwa 4° stehengelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und
in etwa 2500 Volumteilen einer wäßrigen lo/oigen Natriumchloridlösung gelöst. 6000
Volumteile des Eluats ergaben bei der Prüfung 1,7 Billionen Azocolleinheiten proteolytischer
Aktivität. 2500 Volumteile der Salzlösung zeigten bei der Prüfung mindestens 1,7
Billionen Einheiten proteolytischer Aktivität.
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Beispiel 15
Mit Schwefelsäure gewaschenes Magnesiumsilicat wurde
in einer Menge von 3000 Gewichtsteilen zu 200 000, Volumteilen zellfreiem Gärsaft
(der aus der gemäß Beispiel 4 hergestellten Fermentierungsmaische erhalten wurde)
zugesetzt. Die Mischung wurde gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wurde in etwa
4500 Volumteilen einer wäßrigen 2o/oigen Natriumchloridlösung aufgeschlämmt und
wäßrige Natriumhydroxydlösung zu der Aufschlämmung unter Rühren zugefügt, um das
pH auf 10,5 zu bringen. Die Mischung wurde gerührt und der Filterkuchen zweimal
unter Verwendung der gleichen Arbeitsweise nacheluiert. Die drei Eluate wurden vereinigt,
wobei sie ein Gesamteluat von etwa 14 000 Volumteilen ergaben. 200 000 Volumteile
zellfreier Gärsaft ergaben vor der Reinigung bei der Prüfung 5,76 Billionen Azocolleinheiten
proteolytischer Aktivität. Das Eluat von 13 900 Volumteilen zeigte bei der Prüfung
4 Billionen Azocolleinheiten proteolytischer Aktivität.
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Beispiel 16 Etwa 40000 Volumteile kaltes Aceton. wurden zu einer Menge
von 13900 Volumteilen Eluat des vorhergehenden Beispiels zugesetzt. Die Mischung
wurde einige Stunden stehengelassen und der Niederschlag durch Zentrifugieren gesammelt.
Der Niederschlag wurde dann in 1400 Volumteilen kalter wäßriger 1°/oiger Natriumchloridlösung
gelöst und die Lösung durch Behandlung mit Diatomeenerde geklärt. Die Lösung, die
eine Menge von 1400 Volumteilen besaß, zeigte bei der Prüfung 3,75 Billionen Azocolleinheiten
proteolytischer Aktivität.
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Beispiel 17 70 Gewichtsteile trockner kristalliner Sorbit wurden in.
den 1400 Volumteilen der Salzlösung des vorhergehenden Beispiels gelöst. Aliquote
Teile wurden angefroren (shell frozen) und lyophilisiert. Eine Menge von 1400 Volumteilen
So.rbit-Salzlösung zeigte bei der Prüfung 3,73 Billionen Azocolleinheiten proteolytischer
Aktivität. Das Lyophilat ergab bei der Prüfung 3,94 Billionen Einheiten proteolytischer
Aktivität.
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Beispiel 18 Etwa 2600 Gewichtsteile säuregewaschenes Magnesiumsilicat
wurden zu 175 000 Volumteilen des gemäß Beispiel 4 hergestellten zellfreien Gärsaftes
zugefügt. Die Mischung wurde gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wurde zweimal
mit wäßriger 29/oiger Natriumchloridlösung eluiert und mit Natriumhydroxyd auf pH
10,5 eingestellt. Eine Menge von 175 000 Volumtei.len zellfreier Gärsaft ergaben
bei der Prüfung 3,06 Billionen Azocolleinheiten proteolytischer Aktivität. Das Eluat,
10200 Volumteile, zeigte bei der Prüfung 2,09 Billionen Azocolleinheiten proteolytischer
Aktivität.
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Beispiel 19 Etwa 500 Volumteile wäßrige 10o/oige Calciumchloridlösung
wurden zu dem Filtrat mit pH 10 des vorhergehenden Beispiels zugefügt, und die Mischung
wurde filtriert. Der Kuchen wurde mit Wasser gewaschen und das Waschwasser dem Filtrat
zugesetzt. Die vereinigte Filtrat-Waschflüssigkeit wurde mit Kohlendioxyd auf PH
7 eingestellt, und 29000 Volumteile kaltes Aoeton wurden zugefügt. Der so erhaltene
Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und in kalter wäßriger 1o/oiger
Natriumchloridlösung gelöst. Eine Menge von 11750 Volumteilen des Calciumchloridfiltrats
besaß 2,23 Billionen Einheiten proteo,lytischer Aktivität. Eine Menge von 1300 Volumteilen,
der Salzlösung zeigte bei der Prüfung 1,5 Billionen Azocolleinheiten proteolytischer
Aktivität.
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Beispiel 20 Etwa 182 Volumteile wäßriger 70o/oiger Sorbit und 520
Gewichtsteile Kartoffelstärke wurden zu der Salzlösung des vorhergehenden Beispiels
zugefügt, die Mischung wurde gerührt. Während des Rührens wurden 7800 Volumteile
kaltes (etwa -30°) Aceton zugefügt und weitergerührt. Man ließ die festen Bestandteile
absetzen und dekantierte die überstehende Flüssigkeit. Die Festbestandteile wurden
filtriert, mit kaltem Aceton und dann mit Aceton von. Zimmertemperatur und dann
an der Luft getrocknet. Das trockene Produkt zeigte bei der Prüfung 1,3 Billionen
Einheiten proteolytischer Aktivität.
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Beispiel 21 Feuchtes säuregewaschenes Magnesiumsilicat wurde in einer
Menge von etwa 1000 Gewichtsteilen zu 180 000 Volumteilen des gemäß des Verfahrens
von Beispiel 4 hergestellten zellfreien Gärsaftes zugesetzt und die Mischung gerührt.
Weitere 200 Gewichtsteile feuchtes säuregewaschenes Magnesiumsilicat wurden zugefügt.
Es wurde zusätzlich 1 Stunde weitergerührt. Die Festbestandteile wurden mittels
einer Ultrazentrifuge abgetrennt, mit 2000 Volumteilen destilliertem Wasser aufgeschlämmt
und filtriert. Der gewaschene Filterkuchen wurde in 840 Volumteilen wäßrigem 70ohigem
Sorbit aufgeschlämmt, die Aufschlämmung wurde angefroren und lyophilisiert. Das
Trockenprodukt ist in dieser Form brauchbar und kann einfach zu dem Substrat zugefügt
werden.. Dies Produkt kann jedoch nicht durch die Azocollprobe geprüft werden. Der
nachfolgende Wert wurde durch
Vergleich mit der Natriümcaseinatprobe
berechnet. Eine Menge von 100 000 Volumteilen zellfreiexn Gärsaft ergab 3,1 Billionen
Einheiten proteolytischer Aktivität. Das Trockenprodukt ergab 2,7 Billionen Einheiten
proteolytischer Aktivität.
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Beispiel 22-Eine Menge von 5000 Volumteilen einer wäßrigen Lösung
mit einem Gehalt von 101/o Tannin und 5'1'0 Natriumbisulfit wurde zu etwa 465 000
Volumteilen des zeltfreien., gemäß des Verfahrens von Beispiel 4 hergestellten Gärsaftes
zugesetzt. Die Mischung wurde gerührt und dann absitzen gelassen. Die überstehende
Flüssigkeit wurde dekantiert, und die festen Bestandteile wurden mittels Ultrazentrifuge
abgetrennt. Der Kuchen wurde mit 5000 Volumteilen Wasser, zu welchen etwa 1000 Gewichtsteile
handelsüblicher Glucosesirup zugefügt worden war, verrührt. Die Mischung wurde gerührt,
6000 Gewichtsteile Sägemehl wurden zugesetzt und diese Mischung gründlich gerührt
und getrocknet. Der zeltfreie Gärsaft (eine Menge von 465 000 Volumteilen) zeigte
bei der Prüfung 11,4 Billionen Azocolleinheiten proteolytischer Aktivität. Das Trockenprodukt,
7200 Gewichtsteile des gründlich gemischten Pulvers, zeigte bei der Prüfung 6,2
Billionen Azocolleinheiten proteolytischer Aktivität.
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Beispiel 23
Etwa 10 Volumteile einer wäßrigen Lösung mit einem
Gehalt von 10% Tannin und 51/o Natriumbisulfit wurden zu 1000 Volumteilen des gemäß
des Verfahrens von Beispiel 4 hergestellten zeltfreien Gärsaftes zugesetzt. Die
Mischung wurde gerührt und hierauf das feste Material durch Zentrifugieren abgetrennt.
Das Festmaterial wurde dann mit 30 Volumteilen destilliertem Wasser verrührt, und
6 Volumte.ile kaltes Aceton wurden zugefügt. Die Aufschlämmung wurde gerührt und
dann zentrifugiert. Die! Festbestandteile wurden mit 30 Volumteilen Wasser und 60
Volumteilen Aceton erneut aufgeschlämmt und wieder zentrifugiert. Die zwei Filtrate
wurden vereinigt, wobei sich zeigte, daß die so erhaltene Lösung einen starken Eisen(III)-chlorid-Test
gab. Der feste Rückstand wurde gründlich in 100 Vor lumteilen wäßriger 2%iger Natriumchloridlösung
durchgerührt und zentrifugiert. Der zeltfreie Gärsaft ergab bei der Prüfung 18 Millionen
Azocolleinheiten proteolytischer Aktivität. Das salzhaltige wäßrige Filtrat ergab
bei der Prüfung 15 Millionen Einheiten proteolytischer Aktivität.