CH380133A - Verfahren zur Herstellung von 6-Amino-Penicillansäure - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 6-Amino-Penicillansäure

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CH380133A
CH380133A CH518360A CH518360A CH380133A CH 380133 A CH380133 A CH 380133A CH 518360 A CH518360 A CH 518360A CH 518360 A CH518360 A CH 518360A CH 380133 A CH380133 A CH 380133A
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Description


  Verfahren zur     Herstellung    von     h-         & mino-Penicillansäure       Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die  Herstellung von     6-Amino-Penicillansäure.     



  Die verschiedenen Penicilline können sämtliche  als     Acyl-Derivate    eines Grundamins, der     6-Amino-          Penicillansäure    folgender Formel  
EMI0001.0008     
    betrachtet werden. Beim     Benzyl-Penicillin    (Penicillin  G) ist die     Acylgruppe,    die mit der     Aminogruppe    ver  bunden ist, die     Phenylacetylgruppe.    Schon bei den  anfänglichen Entwicklungsstufen der     Penicillinher-          stellung    wurde     festgestellt,    dass sich die Ausbeute an       Benzyl-Penicillin    erheblich erhöhen lässt,

   wenn man       Phenyl-Essigsäure    dem Kulturmedium während des  Wachsens des Penicillin bildenden Pilzes hinzufügt.  Auf diese Weise wirkt     Phenyl-Essigsäure    als ein  Ausgangsprodukt für     Benzyl-Penicillin.     



  Aus der britischen Patentschrift Nr. 643514 ist  bekannt, dass eine grosse Anzahl Penicilline hergestellt  werden kann, indem Ausgangsstoffe für Seitenketten  dem Kulturmedium hinzugefügt werden. Diese Aus  gangsstoffe sind monosubstituierte Essigsäuren oder  Verbindungen, die vom Pilz leicht in monosubsti  tuierte Essigsäuren umgewandelt werden können. Auf  diese Weise wird durch Anwendung von     Phenoxy-          essigsäure    als Ausgangsstoff     Phenoxymethyl-Peni-          cillin    (Penicillin V) als hauptsächlicher Bestandteil  der gebildeten Mischung an Penicillinen erhalten.  



  Aus der Zeitschrift      Nature         Nr.4656,    vom  24. Januar 1959, Seite 257, ist bekannt, dass     6-Amino-          Penicillansäure    bei     Penicillin-Fermentationen    gebildet  wird, wenn keine     Seitenketten-Ausgangsstoffe    vor-    liegen.

   Das Vorliegen des besagten Amins zeigte sich,  wenn eine derartige     Fermentations-Flüssigkeit    nach  dem Entfernen der natürlichen Penicilline durch     Lö-          sungsmittel-Extraktion    bei niederem     pH-Wert    mit  einem     überschuss    an     Phenylacetylchlorid    in Gegen  wart einer schwachen Base, wie     Natriumbicarbonat,     behandelt wurde. Dabei bildete sich     Benzyl-Penicillin;     ebenso resultierte aus der Reaktion mit     Phenoxy-          acetylchlorid        Phenoxymethyl-Penicillin    (Penicillin V).  



  Die belgische Patentschrift Nr. 569728 beschreibt,  wie eine Anzahl Penicilline aus     6-Amino-Penicillan-          säure    durch Umsetzung mit Säurechloriden oder       Säureanhydriden    hergestellt werden kann. Mittels  dieser Methode ist es möglich, eine Anzahl von  Penicillinen zu erhalten, die nicht durch Fermen  tation hergestellt werden können.  



  Weiterhin beschreibt diese Patentschrift, wie sich       6-Amino-Penicillansäure    aus der     Fermentations-          Flüssigkeit    isolieren lässt. Dabei wird diese     zunächst     konzentriert, dann mit einem     Ionenaustauscherharz          behandelt,    das Harz z.

   B. mit verdünnter Salzsäure  ausgewaschen, daraufhin der     pH-Wert    auf etwa neu  tral eingestellt, das     Eluat    vorzugsweise im Vakuum  konzentriert und schliesslich die     6-Amino-Penicillan-          säure    durch Einstellung des     pH-Wertes    auf etwa 4,3,  den     isoelektrischen    Punkt der     6-Amino-Penicillan-          säure,    durch Hinzufügen einer Säure, wie Salzsäure,  ausgefällt und der kristalline Niederschlag von der  Lösung abgetrennt.  



  Jedoch lässt sich mittels des erwähnten Fermen  tationsverfahrens ohne Zugabe von     Seitenketten-          Ausgangsstoffen    nur eine geringe Ausblute an       6-Amino-Penicillansäure    erhalten und die Isolation  dieser Verbindung aus der     Ferme.ntations-Flüssigkeit     ist schwierig und kostspielig, da sich eine Extraktion  mittels organischer Lösungsmittel, die sonst bei der  Herstellung von Penicillin gewöhnlich angewendet      wird, wegen ungünstiger Verteilungskoeffizienten und  einer damit verbundenen     Konzentrierung    von grossen  Flüssigkeitsvolumina nicht eignet.  



  Es wurde nun festgestellt, dass     6-Amino-Peni-          cillansäure    hergestellt werden kann,     ind,m    ein Peni  cillin oder eine Mischung von     Penicillinen,    die durch  ein     Fermentationsverfahren    hergestellt wurden, zu  einem Kulturmedium, in dem ein Pilz gezüchtet wird,  der     deacylierende    Enzyme, die     Penicilline        deacylieren     können, bildet, gebracht wird und der Pilz dann in  dem Kulturmedium in Gegenwart des Penicillins so  lange gezüchtet wird, bis ein erheblicher Teil des  Penicillins in     6-Amino-Penicillansäure    umgewandelt  worden ist.  



  Derartige Pilze stellen eine Vielzahl anderer       Enzyme    her, und es war deshalb nicht zu erwarten,  dass die     Deacylierung    der Penicilline durch lebende  Pilze anstelle von Enzymzubereitungen, die aus ihnen  hergestellt wurden, bewirkt werden konnte. Wenn  die     Deacylierung    des Penicillins durch die Aktivität  des lebenden     Pilzes    bewirkt wird, kann auf die Her  stellung der Enzymzubereitung verzichtet werden,  wodurch der ,gesamte Prozess erheblich vereinfacht  wird.

   Daneben ist durch die Erfindung eine erheblich  bessere Umwandlung des Penicillins in     6-Amino-          Penicillansäure    zu erhalten, als     wann    Enzymzuberei  tungen, die aus     Pilzen    hergestellt wurden, benützt  werden.  



  Vorzugsweise wird Penicillin, das als Ausgangs  material benützt wird, einem Kulturmedium hinzu  gefügt, in dem der Pilz schon mindestens 24 Stunden  lang, vorzugsweise bei 25 bis 30  C und einem     pH-          Wert    von 6,5 bis 8,0 gezüchtet worden war. Das  Kulturmedium soll eine Quelle für Kohlenstoff ent  halten, beispielsweise Glukose, neben anorganischen  Stoffen, die für das Wachstum des Pilzes nötig sind.  



  Unter den     Pilzen,    die erfindungsgemäss benützt  werden, sind solche, die zur Gattung     Mucor    gehören,  wie M.     mucedo;        Monotospora;        Stemphylium;        Cylin-          drocarpon,    wie C.     tonkinense;        Cephalosporium;          Aspergillus    wie A.     oryzae    und A.     flavus;

      und     Fusa-          rium.    Es wurde festgestellt, dass     die    Art der Gattung       Fusarium    besonders geeignet ist, da mit ihnen hohe  Ausbeuten und hohe Geschwindigkeiten der Um  wandlung der Penicilline in     6-Amino-Penicillansäure     erhalten werden.

   Unter den geeigneten Arten von       Fusarium    sind folgende zu erwähnen: F.     Anguioides,     F.     argillaceum,    F.     avenaceum,    F.     bulbigenum,    F.     coeru-          leum,    F.     eulmorum,    F.     equiseti,    F.     lateritium,    F.     mini-          mum,    F.     moniliforme,    F.     oxysporum,    F.     sambucinum,     F.     semisectum,    F.     solani    und F.

       sulphureum.    Es ist zu  erwähnen, dass F.     argillaceum    die unvollkommene  Form bezüglich der vollkommenen Form     Hypomyces          solani    ist und dass F.     moniliforme    die unvollkommene  Form gegenüber der vollkommenen Form     Gibberella          fujikuroi    ist, wobei beide vollkommenen Formen in  die Klasse     Asomycetes    und die Art     Fusarium    zur  Klasse der Fungi     imperfecti    gehören.

   Arten, die zu  beiden der besagten Klassen gehören und die die  vollkommenen Formen darstellen, sind für die Deacy-         lierung    der Penicilline geeignet. Verglichen mit den  beschriebenen Verfahren in der erwähnten belgischen  Patentschrift bietet das erfindungsgemässe Verfahren  den Vorteil, dass es als Ausgangsmaterialien     Peni-          cilline    benützt, die mit geringen Kosten durch den  gewöhnlichen     Fermentationsprozess    hergestellt werden  können,

   wobei das zur Bildung des in Frage kom  menden Penicillins entsprechende Ausgangsmaterial  benützt wird und wobei sich höhere     Konz ntrationen     an     6-Amino-Penicillansäure    erhalten lassen und die  Isolierung leicht durchzuführen ist.  



  Jede Art an Penicillin oder eine Mischung an  Penicillinen, die durch Fermentation erhalten wird,  lässt sich als Ausgangsmaterial benützen, vorzugsweise  in Form eines wasserlöslichen anorganischen Salzes,  wie dem Natrium-, Kalium-,     Calcium    oder dem       Ammoniumsalz.    Das benützte     Penicillinsalz    braucht  nicht den Reinheitsgrad aufzuweisen, der für thera  peutische Zwecke erforderlich ist. Es lässt sich zu  dem Kulturmedium in fester Form oder als ent  sprechend konzentrierte     wässrige    Lösung hinzufügen.

         Benzyl-Penicillin    ist weniger geeignet als     Phenoxy-          m2thyl-Penicillin,    da es durch Pilze rascher     deacyliert     wird.     n-Heptyl-Penicillin    (Penicillin K) wird ebenfalls  rascher     deacyliert    als     Benzyl-Penicillin.    Jedoch sind die  Herstellungskosten von     n-Heptyl-Penicillin    höher als  für     Phenoxym;

          thyl-Penicillin,    da kein Ausgangsstoff  bekannt ist, der die Bildung von     n-Heptyl-Penicillin     mittels des     Penicillin-herstellenden        Pilzes    zu fördern  vermag.  



  Die Lösung, die sich durch     Deacylierung    von  Penicillin erhalten lässt, wird zweckmässig wie folgt  aufgearbeitet: Sie wird durch     Adsorption    und nach  folgende     Eluierung    gereinigt und konzentriert. Ein       Ionenaustauscherharz    oder Aktivkohle lässt sich als       Adsorptionsmittel    verwenden und in beiden Fällen  wird eine verdünnte Säurelösung in geeigneter Weise  zur     Eluierung    benützt. Vor     und/oder    nach diesen  Operationen kann eine Konzentrierung durch Ver  dampfen im Vakuum erfolgen. Vor einer derartigen  Konzentrierung soll der     pH-Wert    der Lösung auf  einen Wert zwischen 3 und 7 eingestellt werden.

    Aus der gereinigten und konzentrierten Lösung wird       6-Amino-Penicillansäure    in kristalliner Form durch  Einstellen des     pH-Wertes    auf etwa 4,3 ausgefällt.  



  Enthält die Lösung, die durch     Deacylierung    von  Penicillin erhalten wird, noch eine erhebliche Menge  an nichtumgewandeltem Penicillin, kann gegebenen  falls vor der Gewinnung der     6-Amino-Penicillansäure     mindestens die Hauptmenge des zurückbleibenden  Penicillins durch Ansäuern der Lösung und durch  Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, das  gewöhnlich zur Extraktion von Penicillinen verwendet  wird, wie     Butylacetat,    abgetrennt werden. Das     Mycel     des Pilzes sollte aus der Flüssigkeit entfernt werden,  bevor die     6-Amino-Penicillansäure    aus derselben ge  wonnen wird oder bevor das zurückbleibende Peni  cillin aus der Flüssigkeit entfernt wird.  



  Es wurde festgestellt, dass, wenn der Gehalt der  wachstumsfördernden biologischen Stoffe, wie Mais-           quellwasser    oder Sojabohnenmehl, im     Kulturmedium     in einem solchen Masse reduziert wird, dass die Ge  samtmenge dieser Stoffe, berechnet als Trocken  substanz, dividiert durch die ursprüngliche Menge an  Penicillin, berechnet als freie Säure, unter 0,5, vor  zugsweise unter 0,25 gehalten wird, die     Adsorptions-          und        Elutionsstufen    in dem beschriebenen Verfahren  zur Isolation von     6-Amino-Penicillansäure    ausge  lassen werden können, falls ein Pilz benützt wird,

   der  eine verhältnismässig schnelle     Deacylierung    des Peni  cillins zu bewirken vermag. Es wurde festgestellt,  dass z. B. die Arten, die zum Genus     Fusarium    ge  hören, eine sehr schnelle     Deacylierung    bewirken und  dass sich mit einer Anzahl von Arten der anderen  schon .aufgeführten Klassen, wie bestimmten Arten  des Genus     Cephalosporium,    eine zufriedenstellend  schnelle     Deacylierung    durchführen lässt. Vorzugsweise  soll die Anfangskonzentration des Penicillins im Kul  turmedium zwischen 1 und 4      /o    liegen.  



  Wenn die     Deacylierung    unter den erwähnten  Bedingungen durchgeführt wird, besteht das     Isolie-          rungsverfahren    der     6-Amino-Penicillinsäure    aus dem  Kulturmedium in der Hauptsache vorzugsweise     in    der  Entfernung des     Mycels    des Pilzes aus dem Kultur  medium und in der Konzentrierung der Lösung durch  Abdampfen im     Vakuum,    worauf der     pH-Wert    der  konzentrierten Lösung auf einen Wert von etwa 4,3  eingestellt wird. Die     6-Amino        Penicillansäure    wird  dadurch aus der Lösung gefällt und kann abgetrennt  werden.  



  <I>Beispiel 1</I>       Aspergillus        oryzae    wurde in 5 Litern eines Kultur  mediums folgender     Zusammensetzung    gezüchtet:  
EMI0003.0026     
  
    Gew: <SEP> Teile
<tb>  Wasser <SEP> 1000
<tb>  Maisquellwasser <SEP> 20
<tb>  Glukose <SEP> 20
<tb>  M9S04 <SEP> - <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 2
<tb>  KN03 <SEP> 5       Nach einem     Wachstum    von 36 Stunden wurden  10,0g     Natriumbenzyl-penicillat,    das in 100 ml Wasser  aufgelöst worden war, hinzugefügt und dann die  Kultur in einem     10-Liter-Fermentationsgefäss    bei 27  bis 29  C gerührt und mit Luft behandelt, wobei der       pH-Wert    zwischen 5,5 und 6,5 gehalten wurde.

    32 Stunden nach der Zugabe des Penicillins hatte  die antibiotische Wirksamkeit, die durch ein Verfah  ren     (cup        plate        method),    das von N. G.     Heatly    in       Biochem.    J.,     Vol.   <B>38</B> (1944), Seite 61, beschrieben  wurde, bestimmt worden war, auf 250     internationale     Einheiten Penicillin je ml, das heisst auf weniger als       10        %        der        ursprünglichen        Wirksamkeit,

          abgenommen.     Das     Mycel    wurde dann     abfiltriert,    und zwei     5-Mikro-          liter-Proben    des Filtrats wurden auf einem     What-          man-Papier    Nr. 1     chromatographiert,    wobei ein     Lö-          sungsmittelsystem    verwendet wurde, das in dem Text  unter der     Fig.    1 in dem schon erwähnten Artikel        Nature     beschrieben worden war.

   Einer der beiden  Papierstreifen wurde mit einer 3     0/eigen        wässrigen    Lö-         sung    von     NaHC03    und dann mit     einer    5     0/eigen     Lösung     Phenylacetylchlorid    in Aceton besprüht. Die  beiden     Streifen    wurden dann auf eine     Agar-Platte     gebracht, die mit     Staphylococcus        aureus    besät worden  war, darauf wurde die Platte bei     37     C 20 Stunden  lang aufbewahrt.

   Um die beiden     Streifen    zeigten klei  nere Flecken etwa in halber Höhe der Streifen Ver  zögerungszonen auf der     Agar    Platte auf Grund des  nicht umgewandelten     Benzyl-Penicillins.    Ein grösserer  ovaler Flecken um einen Punkt des besprühten Strei  fens in der Nähe der     Ausgangslinie    wies auf die  Anwesenheit .einer grösseren Menge von     Benzyl-Peni          cillin    hin, das     aus        6-Amino-Penicillansäure    durch Be  sprühen mit     Phenylacetylchlorid    entwickelt wurde.

    Der     R,-Wert    dieses Fleckens stimmte mit dem des  Streifens 3 in     Fig.    1 des erwähnten Artikels in      Na-          ture     überein.  



  <I>Beispiel 2</I>  150     ml    eines sterilen Kulturmediums folgender  Zusammensetzung    Glukose 10,00 g  Asparagin 0,75 g       (NH4)2S04    2,64     g          KH2P04    2,38 g       K2HP04    5,56 g       MgS04    - 7     H20    1,00 g       CUS04        *    5     H20    6,4 mg       FeS04    -     7H20    1,1 mg       MnC12    -     7H20    7,9 mg       ZnS04    - 7 H20 1,5 mg       konz.    Hefe-Extrakt 5,0 g  Maisquellwasser,

       500/9    20,0 ml       CaCO3    5,0 g  Wasser bis zu 1000 ml    wurden mit 1 Liter einer sterilen Suspension von       Fusarium        avenaceum-Sporen    (Stamm L. P. P. 1102)  geimpft und das Kulturmedium 24 Std. bei     27,>C     unter     Lufteinfluss    gerührt. Dann wurde die Kultur  zu 5 Liter eines sterilen Kulturmediums derselben  Zusammensetzung gefügt und das     Ganze    nachfol  gend weitere 72     Std.    in einem     10-Liter-Glasfermenter     bei 27  C unter     Lufteinfuss        gerührt.     



  Daraufhin     wurdan    20,00 g     Kalium-Phenoxy-          methylpenicillin    zu der Kultur gefügt, und das       Wachstum    des     Pilzes    unter den gleichen Bedingun  gen weitere 48 Stunden lang     fortgesetzt.    Das     Mycel     wurde dann     abfiltriert    und die     6-Amin-Penicillan-          säure    vom Filtrat wie folgt isoliert:

    Der     pH-Wert    des Filtrats wurde auf 7,5 einge  stellt und das Filtrat dann im Laufe von 2 Stunden  durch eine Kolonne geleitet, die 1 Liter der Chlorid  form des     Ionenaustauscherharzes    vom Typ      Amber-          lite        IRA-401        S     enthielt. Dann wurde die Kolonne mit  Wasser gewaschen und das feuchte Harz in ein     3-Liter-          Becherglas    zusammen mit 500 ml Wasser gebracht.  Dann wurde konzentrierte Salzsäure hinzugefügt, bis  ein     pH-Wert    von 1,8 erreicht worden war. Das Harz  wurde     abgefiltert    und auf dem Filter mit 500 ml      Wasser gewaschen.

   Das Filtrat und die Waschlösun  gen wurden vereinigt und mit 2n     wässriger        NaOH     auf einen     pH-Wert    von 6,5 neutralisiert und dann  durch Verdampfen im Vakuum auf ein Volumen  von<B>100</B> ml konzentriert. Der     pH-Wert    der konzen  trierten Lösung wurde durch Zugabe von konzen  trierter Salzsäure auf einen Wert von 4,3 eingestellt,  die     ausgefallene    6     Amino-Pemcillansäure        abfiltriert,     mit Wasser und nachfolgend mit Aceton gewaschen  und schliesslich getrocknet. 8,5g Rohprodukt wurde  dabei erhalten.

   Dieses Produkt wurde in 75 ml  Wasser suspendiert und durch Zugabe einer ver  dünnten     wässrigen    Lösung von     Natriumhydroxyd    in  Lösung gebracht. Aus dieser Lösung wurde dann  wieder     6-Amino-Pencillansäure    durch Einstellen des       pH-Wertes    der Lösung auf :einen Wert von 4,3 mittels       Salzsäure    ausgefällt. Der gebildete Niederschlag  wurde     abfiltriert,    mit Wasser und nachfolgend mit       Accton    gewaschen und getrocknet. Hierbei wurden  7,7 g     6-Amino-Penicillansäure    vom Schmelzpunkt  198 bis 200  C erhalten.  



  <I>Beispiel 3</I>  800 Liter eines sterilen Kulturmediums folgender  Zusammensetzung  
EMI0004.0016     
  
    Maisquellwasser, <SEP> 50 <SEP> 0/0 <SEP> 24,0 <SEP> kg
<tb>  Lactose <SEP> 24,0 <SEP> kg
<tb>  Calciumcarbonat <SEP> 3,0 <SEP> kg
<tb>  Leitungswasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 900 <SEP> Liter       wurden in einen     Fermenter    aus rostfreiem Stahl ge  bracht und mit 2 Liter einer Kultur von     Fusarium          culmorum        var.        cereale    (Stamm L. P. O. Z. S. 1100)  geimpft, wobei     diese    Kultur schon 48 Stunden lang  gewachsen war.

   Daraufhin wurde das geimpfte Kul  turmedium bei einer Temperatur von 27  C     und     einem     pH-Wert    von 6,5 66 Stunden lang gerührt  und mit Luft behandelt. Hierbei wurde ein über  mässiges Wachstum des Pilzes bewirkt. Nach dieser  Wachstumsperiode wurde eine sterile Lösung von       18,0        kg        rohem        (99        %        Reinheit)

          Kalium-Phenoxy-          methyl-Penicillat    in 90 Liter     Leitungswasser    hinzu  gefügt und das Rühren und die Luftbehandlung wei  tere 48 Stunden bei 27  C     fortgesetzt.    Der     pH-Wert     von 6-7 wurde durch fortgesetzte Zugabe einer     wäss-          rigen        Natriumhydroxydlösung    aufrechterhalten. Nach  dieser Zeit war der Gehalt an 6     Amino-Penicillan-          säure    im     Kulturmedium    6 mg je ml, was einem       Umwandlungsgrad    von 65     0io    entspricht.

   Weiterhin  enthielt das fermentierte Kulturmedium nicht umge  wandeltes     Phenoxymethyl-penicillin    mit 4000     internat.          Einheiten        je        ml,        was        15        %        der        zugefügten        Menge        an          Phenoxymethyl-Penicillin    entspricht.  



  Der     pH-Wert    des     fermentierten    Kulturmediums  wurde auf 7,5 eingestellt, 40 kg     Diatomeen-Erde        als     Filterhilfe hinzugefügt und das     Mycel    im Kultur  medium durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde  im Laufe von 8 Stunden durch eine Kolonne geleitet,  die 300 Liter eines stark basischen,     anionenaus-          tauschende:n,    synthetischen Harzes      Amberlite    IRA-    401 S  (Rohur  &  Haas Co., Philadelphia,     Pa.    USA),  das einen niederen Grad einer Quervernetzung auf  weist, enthielt.

   Dann wurde die Kolonne mit Wasser  gewaschen     und    das feuchte Harz in ein     800-Liter-          Gefäss    aus rostfreiem Stahl, das mit einem     Rührer     versehen war, übergeführt. 200 Liter enthärtetes  Wasser wurden zunächst hinzugefügt und dann im  Laufe von 3 Stunden unter Rühren 20      /o        ige    Salz  säure so lange hinzugefügt, bis ein     pH-Wert    von 1,95  erreicht worden war. Dann wurde das Harz     abfiltriert     und dreimal gewaschen, jedesmal mit 70 Liter ent  härtetem Wasser.

   Der     pH-Wert    des mit den Wasch  lösungen vereinigten Filtrats mit dem Volumen von  400 Liter wurde auf 7,0 durch Zugabe einer  33     11/dgen        wässrigen        Natriumhydroxydlösung    einge  stellt, worauf die Lösung auf 75 Liter durch Ver  dampfen im Vakuum konzentriert wurde. Die kon  zentrierte Lösung wurde     abfiltriert    und der     pH-Wert     des Filtrats durch Zugabe an konzentrierter Salz  säure auf 4;05 eingestellt. Die dadurch gefällte       6-Amino-Penicillansäure    wurde     abfiltriert,    mit Was  ser und dann mit Aceton gewaschen und schliesslich  getrocknet.

   Dabei wurden 3,1 kg eines Produktes mit  dem Schmelzpunkt 199 bis 201 C und einem     Rein-          heitsgrad        von        93        %        erhalten.     



  Das Rohprodukt wurde in 12 Liter Wasser sus  pendiert, und zu der Suspension wurde     dann    eine  33     o/oige        wässrige    Lösung von     Natriumhydroxyd    so  lange hinzugefügt, bis eine klare Lösung erhalten  worden war. Der     pH-Wert    dieser Lösung war dann  7,3. Die Lösung wurde dann mit 30 g Aktivkohle  15 Minuten lang behandelt und dann schliesslich ab  filtriert. Der     pH-Wert    des Filtrats wurde dann durch  Zugabe konzentrierter Salzsäure auf 4,05 eingestellt.  Die gefällte     6-Amino-Penicillansäure    wurde     abfiltriert     und mit Wasser und dann mit Aceton gewaschen.

    Dabei     wunden    2,8 kg     6-Amino-Penicillansäure    mit  einem     .Schmelzpunkt    von 202 bis 204  C (Zersetzung)       und        einem        Reinheitsgrad        von        98        %        erhalten.     



  <I>Beispiel 4</I>  100 ml eines sterilen Kulturmediums folgender  Zusammensetzung  
EMI0004.0106     
  
    Diammoniumphosphat <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb>  Glucose <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb>  Calciumcarbonat <SEP> 5,0 <SEP> g
<tb>  Leitungswasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 1,0 <SEP> Liter       wurden auf einen     pH-Wert    von 6,5 eingestellt und in  einem 300 ml Kolben mit einer Suspension von  Sporen der     Fusarium-Art    geimpft, die hier proviso  risch als L. P. P. 1571 bezeichnet wird. Dann wurde  der Kalben 72 Stunden lang bei 27  C geschüttelt und  danach wurden 2,0 g     Kalium-Phenoxy-methyl-Peni-          cillin    hinzugefügt und der Kolben weitere 72 Stunden  lang geschüttelt.

   Nach dieser Zeit war der Gehalt  an     Phenoxymethyl-Penicillin,    der durch die     Agar-          Tassen        .Methode        (agar        cup        method)    bestimmt wurde,  auf unter 300     internat.        Einh.    Penicillin je ml ge  sunken.      Das     Mycel    wurde dann     abfiltriert,    der     pH-Wert     des Filtrates auf 6,5 eingestellt und das Filtrat durch  Verdampfen im Vakuum auf ein Volumen von 15 ml  konzentriert.

   Nachdem die konzentrierte Lösung ab  gefiltert worden war, wurde ihr     pH-Wert    durch Zu  gabe konzentrierter Salzsäure auf 4,3 eingestellt. Der  dadurch ausgefallene Niederschlag wurde     abfiltriert,     mit Wasser und nachfolgend mit Aceton gewaschen  und dann getrocknet. Es wurden 710 mg     6-Amino-          Penicillansäure    mit einem Schmelzpunkt von 199 bis  201 C     (Zersetzung)    erhalten.  



  <I>Beispiel 5</I>  5 Liter eines sterilen Kulturmediums folgender  Zusammensetzung  
EMI0005.0009     
  
    Maisquellwasser
<tb>  (Trockensubstanz) <SEP> 50 <SEP> 0/0 <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb>  Glucose <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb>  Calciumcarbonat <SEP> 5,0 <SEP> g
<tb>  Leitungswasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 1,0 <SEP> Liter       wurden auf einen     pH-Wert    von 6,5 eingestellt und  in einem     10-Liter-Glasfermenter    mit 200 ml einer  Kultur des schon erwähnten     Fusarium    L. P. P. 1571,  die 24 Stunden lang gewachsen war, geimpft. Darauf  hin wurde das geimpfte Kulturmedium unter Luft  behandlung 48 Stunden lang gerührt, während der       pH-Wert    auf 6,5 gehalten worden war.

   Dann wurden  100 g     Kalium-Phenoxymethyl@Penicillin        hinzugefügt     und das Rühren und die     Luftbehandlung    weitere  72 Stunden lang bei     27 C    und einem     pH-Wert    von  6,5 fortgesetzt.  



  Das     Mycel    wurde dann     abfiltriert,    der     pH-Wert     des Filtrats auf 6,5 eingestellt und das Filtrat durch  Verdampfen im Vakuum auf 500 ml     konzentriert.     Nachdem die konzentrierte Lösung     abfiltriert    worden  war, wurde ihr     pH-Wert    durch Zugabe an konzen  trierter Salzsäure auf 4,3     .eingestellt.    Der gebildete  Niederschlag wurde     abfiltriert    und dann in Wasser  und Aceton gewaschen und schliesslich getrocknet.

    Hierbei wurden 37 g     6-Amino-Penicillansäure    mit         93        %iger        Reinheit        und        einem        Schmelzpunkt        von        196     bis 199 C erhalten.  



  Das Produkt wurde in 150 ml Wasser suspendiert  und in :eine Lösung gebracht, deren     pH-Wert    durch       Zugabe        einer        30        %igen        wässrigen        Natriumhydroxyd-          lösung    7,5 war. Eine     wässrige    Lösung von 1,0 g  Aluminiumsulfat wurde     hinzugefügt,    der gebildete  Niederschlag     abfiltriert    und das Filtrat     mittels    kon  zentrierter     Salzsäure    auf einen     pH-Wert    von 4,3 ein  gestellt.

   Der ausgefällte Niederschlag     wurde        abfiltriert,     mit Wasser und mit Aceton gewaschen und     schliess-          lich    getrocknet. Hierbei wurden 32     g        gereinigte          6-Amino-Penicillansäure    mit einem Schmelzpunkt  von 205 bis 207  C erhalten.  



  <I>Beispiel 6</I>  Die Fähigkeit einer grossen Anzahl von     Pilzen,          6-Amino-Penicillansäure    durch     Deacylierung    von       Phenoxymethyl-Penicillin    herzustellen, wurde be  stimmt, indem folgendes Verfahren angewendet  wurde:  100 ml eines sterilen Kulturmediums, das eine  Zusammensetzung des     Beispiels    2 besass, wurden auf  einen     pH-Wert    von 6,5 eingestellt und in einem       300-ml-Schüttelkolben    mit einer Suspension     an    Spo  ren des zu testenden Pilzes geimpft. Der Kolben  wurde dann bei 27 C 49 Stunden lang geschüttelt.

    Dann wurden 2,0 g des     Kahumsalzes    von     Phenoxy-          methyl-Penicillin    hinzugefügt und der Kolben unter  Luftzufuhr bei 27 C weitere 48 Stunden lang ge  schüttelt. Es wurde das     Mycel        abfiltriert,    das Filtrat  auf einen     pH-Wert    von 2,0 angesäuert und zweimal  zur Entfernung von nicht     umgewandeltem        Phenoxy-          methyl-Penicillin    mit     Butylacetat    extrahiert,

   worauf  der Gehalt an     6-Amino-Penicillansäure    in der     wäss-          rigen    Phase     jodometrisch    bestimmt wurde. Die Ergeb  nisse, die mit einer Anzahl von den geeignetsten  Pilzen erhalten worden waren, werden in der folgen  den Tabelle aufgeführt, wobei die Zahl in der rechten  Spalte den     Umwandlungsgrad    des     Phenoxymethyl-          Penicillins    in     6-Amino-Penicillansäure        darstellt.     
EMI0005.0084     
  
    Gattung <SEP> Stamm
<tb>  Fusarium <SEP> anguioides <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P.

   <SEP> 1567 <SEP> <B>921/9</B>
<tb>    <SEP> avenaceum <SEP>   <SEP> n33 <SEP> 82%
<tb>    <SEP> avenaceum <SEP>   <SEP> 1248, <SEP> B <SEP> 86 <SEP> 0/0
<tb>    <SEP> avenaceum <SEP>   <SEP> 1255 <SEP> 831/o.
<tb>    <SEP> avenaceum <SEP>   <SEP> 14.28 <SEP> <B>790/9</B>
<tb>    <SEP> avenaceum <SEP>   <SEP> 1677 <SEP> 82 <SEP> 0/0
<tb>    <SEP> avenaceum <SEP>   <SEP> 1681 <SEP> <B>800/0</B>
<tb>    <SEP> bulbigenum <SEP>   <SEP> n <SEP> 10 <SEP> <B>521/o</B>
<tb>    <SEP> culmorum <SEP>   <SEP> n <SEP> 32 <SEP> <B>7711/9</B>
<tb>    <SEP> culmorum <SEP> :

  > <SEP> 1248, <SEP> A <SEP> 810/0
<tb>    <SEP> culmorum <SEP>   <SEP> 1489 <SEP> 68114
<tb>    <SEP> culmorum <SEP> v. <SEP> cereale <SEP>   <SEP> 1501 <SEP> 93%       
EMI0006.0001     
  
    Gattung <SEP> Stamm
<tb>  Fusarium <SEP> culmorum <SEP> v. <SEP> cereale <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1504 <SEP> <B>891/0</B>
<tb>  :

  > <SEP> equiseti <SEP> v. <SEP> bullatum <SEP>   <SEP> 1454 <SEP> 92%
<tb>    <SEP> equiseti <SEP> v. <SEP> bullatum <SEP>   <SEP> 1508 <SEP> 849/o
<tb>    <SEP> lateritium <SEP>   <SEP> 1687 <SEP> <B>76%</B>
<tb>    <SEP> minimum <SEP>   <SEP> n <SEP> 34 <SEP> 721/o
<tb>    <SEP> moniliforme <SEP>   <SEP> n <SEP> 12 <SEP> 78 <SEP> %
<tb>    <SEP> moniliforme <SEP> C. <SEP> B. <SEP> S. <SEP> 917 <SEP> 48%
<tb>    <SEP> moniliforme <SEP> v. <SEP> subglutinans <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P.

   <SEP> 1682 <SEP> 75 <SEP> 0/0
<tb>    <SEP> oxysporum <SEP>   <SEP> 9 <SEP> 841/9
<tb>    <SEP> oxysporum <SEP>   <SEP> 1637 <SEP> 801)/o
<tb>    <SEP> semitectum <SEP>   <SEP> 1493 <SEP> 931/o
<tb>    <SEP> semitectum <SEP>   <SEP> 1540 <SEP> 821)/o
<tb>    <SEP> semitectum <SEP>   <SEP> 1546 <SEP> <B>661)4</B>
<tb>  Mucor <SEP> mucedo <SEP>   <SEP> ZX <SEP> 9 <SEP> 64 <SEP> 0/0
<tb>  Monotospora <SEP> sp. <SEP>   <SEP> <B>1703</B> <SEP> 510/0
<tb>  Stemphylium <SEP> sp. <SEP>   <SEP> 1758 <SEP> 64%
<tb>  Cylindrocarpon <SEP> tonkinense <SEP>   <SEP> ZU <SEP> 4 <SEP> 68 <SEP> 0/0
<tb>  Cephalosporium <SEP> sp. <SEP>   <SEP> <B>1748 <SEP> 780/9</B>
<tb>    <SEP> sp. <SEP>   <SEP> 1753 <SEP> 71%
<tb>    <SEP> sp. <SEP>   <SEP> 1770 <SEP> 71%
<tb>    <SEP> sp.

   <SEP>   <SEP> 1779 <SEP> 801/o
<tb>  Aspergillus <SEP> flavus <SEP>   <SEP> ZM <SEP> 3 <SEP> 60%
<tb>    <SEP> oryzae <SEP>   <SEP> ZM <SEP> 4 <SEP> 41%
<tb>    <SEP> oryzae <SEP>   <SEP> ZM <SEP> 9 <SEP> <B>580/a</B>
<tb>    <SEP> oryzae <SEP>   <SEP> ZM <SEP> 10 <SEP> <B><I>551119</I></B>
<tb>    <SEP> oryzae <SEP> A. <SEP> T. <SEP> C. <SEP> C. <SEP> 7252 <SEP> 481/9
<tb>    <SEP> oryzae <SEP>   <SEP> 11601 <SEP> 340/9
<tb>    <SEP> oryzae <SEP>   <SEP> 11866 <SEP> 510/0
<tb>    <SEP> niger <SEP>   <SEP> 10254 <SEP> <B>380/9</B>
<tb>    <SEP> sojae <SEP>   <SEP> 11906 <SEP> 54%
<tb>    <SEP> terreus <SEP>   <SEP> 10029 <SEP> 48%
<tb>    <SEP> effesus <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> ZM <SEP> 5 <SEP> 48%
<tb>  Gibberella <SEP> fujikuroi <SEP> A. <SEP> T. <SEP> C. <SEP> C. <SEP> 10052 <SEP> <B>531/9</B>
<tb>  Hypomyces <SEP> solani <SEP> C. <SEP> B. <SEP> S.

   <SEP> <B>0M679</B> <SEP> 881/o

Claims (1)

  1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von 6-Amino-Peni- cillansäure, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Penicillin oder eine Mischung von Penicillinen, die durch ein Fermentationsverfahren hergestellt wurden, zu einem Kulturmedium fügt, in dem man einen Pilz wachsen lässt, der deacylierende Enzyme bildet, die Penicilline zu deacylieren vermögen, und dass man den Pilz in dem Kulturmedium in Gegenwart des Penicillins so lange wachsen lässt, bis ein erheblicher Teil des Penicillins dn 6-Amino-Penicillansäure um gewandelt worden ist.
    <B>UNTERANSPRÜCHE</B> 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man einen Pilz verwendet, der zur Art Mucor gehört. 2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man einen Pilz verwendet, der zur Art Monotospora gehört. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man einen Pilz verwendet, der zur Art Stemphylium gehört. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man einen Pilz verwendet, der zur Art Cylindrocarpon gehört. 5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man einen Pilz verwendet, der zu der Art Cephalosporium gehört. 6.
    Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man einen Pilz verwendet, der zu der Art Aspergillus gehört. 7. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man einen Pilz verwendet, der zu der Art Fusarium gehört. B. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man einen Pilz verwendet, der zu der Art Hypomyces gehört. 9. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man einen Pilz verwendet, der zu der Art Gibberella gehört. 10. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man als .Penicillin Phenoxymethyl- Penicillin verwendet. 11.
    Verfahren nach Patentanspruch und Unter anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mengen der wachstumsfördernden biologischen Stoffe, berechnet als Trockensubstanz, dividiert durch die ursprüngliche Menge an Phenoxymethyl-Peni- cillin, berechnet als freie Säure, unter 0,5, vorzugs weise unter 0,25 hält. 12. Verfahren nach Patentanspruch, .dadurch ge kennzeichnet, dass man die Anfangskonzentration des Penicillins im Kulturmedium, berechnet als freie Säure, zwischen 1 und 4<B>%</B> hält. 13.
    Verfahren nach Unteranspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die 6-Amino-Penicillan- säure vom Kulturmedium durch Entfernung des Mycels von demselben isoliert, die Lösung durch Verdampfen im Vakuum konzentriert, den pH-Wert der konzentrierten Lösung auf einen Wert von etwa 4,3 einstellt und die dabei ausgefallene 6-Amino- Penicillansäure von der Lösung abtrennt.
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