Verfahren zur Herstellung vom 6-Amino-penicillansäure
Das Schweiz. Patent Nr. 382 373 bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 6-Arnino-peni- cillansäure der Formel
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sowie von Salzen dieser Säure, einer Substanz mit antibiotischer Wirksamkeit.
Das in der genannten Patentschrift beschriebene Verfahren besteht darin, dass Penicillin produzierende Schimmelpilze in einem Nährmedium gezüchtet werden und die dabei entstandene Säure oder deren Salze aus der Fermentationslösung abgetrennt werden.
6-Amino-penicillansäure besitzt auch Bedeutung als Zwischenprodukt, indem - sie mit verschiedenen Verbindungen umgesetzt werden kann, wobei neue Substanzen mit antibiotischer Wirksamkeit entstehen.
Es wurde nun gefunden, dass gewisse Penicilline vermittels eines Enzyms der Penicillin-Amidase in 6-Amino-penicillansäure abgebaut werden können.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Penicillin der Formel
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worin R Alkyl, Alkenyl oder den Rest RtXCH2-be- deutet, in welch letzterem R1 eine Alkyl-, Alkenyl-, z. B. Allyl-, oder eine Arylgruppe und X Sauerstoff oder Schwefel darstellt, mit einem Penicillin spaltenden Enzym zur Reaktion gebracht wird, welches aus einem Pencillin-Amidase produzierenden Mikroorga- nismus erhalten wurde.
Beispiele von Pencillinen, welche als Substrate verwendet werden können, sind:
Bedeutung von R in Formel II Phenoxymethyl-peniciIlin (Penicillin v) R = R1SCH2 wobei R1 = C0H5, X = 0 Butylthiomethyl-penicillin R = R'XCH2 wobei R1 = C4Hg, X = S n-Heptyl-penicillin (Penicillin-K) R = CH3-CH2-(CH'2)4-CH2- 2-Pentenyl-penicillin (Penicillin F) R = CH3-CH2-CH = n-Amyl-penicillin (Dihydropenicillin F) R = CH3-CH2-CH2-CH2- n-Butyl-penicillin R = CH3-CH2-CH2-CH2
Mit Vorteil kann auch ein Substrat verwendet werden, das aus einer Mischung natürlicher Penicilline besteht,
welche durch einen typischen Fermentationsprozess ohne Verwendung eines Präcursors entstanden sind. Solch ein natürliches Gemisch enthält Penicillin K, F, Dihydro-F-penicillinXund 3-Penten. yl- penicillin (Flavicin) neben etwas Benzylpenicillin (Penicillin G) und p-Hydrox-beniylpenicillin (Peni cillin X). Bei Verwendung eines solchen Gemisches von Penicillinen, wie sie in Fermentationslösungen zur Herstellung von 6-Amino-penicillans äure, enthalten sind, kann die Ausbeute an dieser Substanz erhöht werden.
Die Penicilline der Formel II können ebenfalls in Form ihrer Salze mit solchen Kationen gebraucht werden, welche bei der enzymatischen Hydrolyse nicht stören. Die gebräuchlichsten dieser Salze sind diejenigen der Erdalkalimetalle und der Alkalimetalle, z. B. des Natriums, Calciums und Kaliums.
Beispiele von Mikroorganismen, die Penicillin Amidase produzieren: au fungi
Alternaria sp. B. R. L. Nr. 32
Aspergillus sp. B. R. L. Nr. 78
Botrytis cinerea B. R. L. Nrn. 20 und 36
Epicoccum sp. B. R. L. Nr. 64
Fusarium sp. B. R. L. Nrn. 46, 116, 205,
221, 226 und 236
Mucor sp. B. R. L. Nrn. 52, 63, 84 und 85
Penicillium chrysogenum B. R. L. Nrn. 51-20C
Pencillium sp. B. R. L. Nrn. 11,92,93 und 129
Phoma sp. B. R. L. Nr. 65
Trichoderma sp. B. R. L. Nr. 82 b) Hefen
Crytococcus albidus N. C. Y. C. Nr. 445
Trichosporon sp. N. C. Y. C.
Nr. 384 c) Actinomyceten
Streptomyces sp. B.R.L. Nrn. 157, 188, 190,
192, 194, 198, 200,
206, 290, 314 und 316
Falls die die Penicillin-Amidase produzierenden Mikroorganismen ein Stamm von Streptomyceten sind, kann ein für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignetes Enzym-Präparat dadurch erhalten werden, indem man eine Kultur der Organismen benützt zur Impfung eines geeigneten Mediums in einem Fermentationsgefäss, wobei dieses dann während einer genügenden Zeitdauer inkubiert wird, um das Enzym zu erzeugen. Die Organismen werden dann abgetrennt, wobei eine klare Lösung zurückbleibt, welche das Enzym enthält, das seinerseits gewünschtenfalls durch Zugabe von Ammoniumsulfat oder Aceton ausgefällt werden kann.
Die Umsetzung zwischen dem Penicillin und dem Enzym-Präparat kann durchgeführt werden, indem man das Penicillin zur Brühe zusetzt, ferner durch Zugabe einer Lösung des Penicillins zum dialysierten Enzym oder vorzugsweise durch Zugabe des Penicillins zu einer Lösung des mit Aceton gefällten Enzym-Präparates. Das dialysierte Enzym kann isoliert werden, durch Behandlung der das Enzym enthaltenden klaren Lösung mit Ammoniumsulfat, Abtrennen des gebildeten Niederschlags, Auflösen desselben in Wasser und nachfolgende Dialyse gegen fliessendes Leitungswasser.
Das mit Aceton gefällte Enzympräparat kann gewonnen werden durch Zugabe eines gleichen Volumens Aceton zu einem Volumen der das Enzym enthaltenden klaren Lösung und Abtrennen des gebildeten Niederschlags. Die derart erhaltene Fällung kann entweder unmittelbar durch Wiederauflösen in Wasser zur Verwendung gelangen. Anderseits kann sie in ein unbeschränkt haltbares Pulver übergeführt werden, indem man sie weiter mit trockenem Aceton wäscht und im Vakuum trocknet.
Das Enzym zeigt einen optimalen Wirkungswert im pH-Bereich von 9,0. Unterhalb pH 7 ist das Enzym inaktiv. Die Enzymierungsbehandlung wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 25 und 600, ausgeführt.
Im einzelnen kann wie folgt vorgegangen werden: Ein geeignetes Enzym-Präparat wird dadurch erhalten, dass man eine Kultur der Organismen dazu benützt, ein Keimgefäss zu impfen, welches ein geeignetes Keimkulturmedium enthält. Bei der Impfung wird dem Keimmedium ein Penicillin in aseptischer Form zugegeben. Das Keimstadium wird 24 bis 48 Stunden lang aufrechterhalten, nach welcher Zeit die gesamte Brühe als Impfsubstanz für die endgültige Fermentation verwendbar ist. Eine Portion der Keime wird in ein grösseres Bad mit einem Nährmedium eingeimpft, worauf ein entsprechendes Penicillin in aseptischer Form zugegeben wird. Diese Penicillinzugaben werden gemacht, um die Entstehung des Penicillin Amidase-Enzyms einzuleiten.
Nachdem die endgültige Fermentation eine gewisse Zeitlang in Gang gehalten wurde, wird ein Penicillin der Formel II zur Umwandlung in 6-Aminopenicillansäure zugegeben. Der pH-Wert, bei welchem die Reaktion durchgeführt wird, hängt von den besonderen verwendeten Mikroorganismen ab. Am Ende der Reaktionszeit wird die Flüssigkeit von den Organismen und allfälligen weiteren festen Bestandteilen des Kulturmediums abgetrennt, wonach die 6-Amino-penicillansäure aus der wässrigen Lösung abgeschieden werden kann.
Beispiel 1 a) Herstellung des Enzyms:
Eine Kultur von Streptomyces B. R. L. Nr. 198 (A. T. C. C. Nr. 13 664) wurden in Fermentationsflaschen von 10 Liter und 90 Liter geschüttelt, wobei ein Medium verwendet wurde, das aus einer Brühe von einer Konzentration von 20 g/l und einem pH-Wert von 7,3 bis 7,4 bestund.
Die Brühe hatte die folgende Zusammensetzung:
Flüssige Glucose 3,0 0S
Sojabohnenmehl 2,5 Difco -Hefeextrakt 0,5 X
Natriumchlorid 0,5 %
Calciumcarbonat 0,2 % Von diesen Substanzen wurden die ersten vier Anteile miteinander vermischt, worauf der pH-Wert auf 6,8 eingestellt und danach das Calciumcarbonat zugegeben wurde. Es wurde ein Keimstadium eingehalten, bei welchem die wachsenden Mikroorganismen in diesem Medium 30 Stunden lang belassen wurden, und wonach ungefähr 7 Vol. S der erhaltenen Aufzucht dazu benötigt wurde, die endgültige Fermentationslösung zu impfen. Die endgültige Fermentation wurde 96 Stunden lang bei 26 bis 280 unter Rühren und Belüftung durchgeführt, wonach das Mycelium abgetrennt wurde, was entweder vermittels Filtrieren oder Zentrifugieren geschehen kann.
Die klare Lösung, welche das Enzym enthielt, wurde mit Ammoniumsulfat versetzt bis 90% des Sättigungswertes (650 g/l). Die entstandene Fällung wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und in einem geringen Volumen Wasser wieder aufgelöst, um sie hierauf gegen flie ssendes Leitungswasser 2 Tage lang zu dialysieren.
Das derart erhaltene Enzympräparat wurde einer Gefriertrocknung unterworfen.
Das wässrige Enzympräparat konnte auch in aktiver Form aufbewahrt werden, indem man es bei 200 lagerte.
Auf folgende Weise konnte es ferner in ein Pulver übergeführt werden, welches praktisch unbeschränkt lagerfähig ist: Die klare Lösung wird mit einem gleichen Volumen Aceton behandelt und das ausgefallene Produkt durch Zentrifugieren abgetrennt.
Letzteres wird hierauf in einem geringen Volumen trockenen Acetons suspendiert. Die Fällung wird erneut abzentrifugiert und schliesslich im Vakuum getrocknet. b) Herstellung von kristalliner 6-Amino penicillansäure.
Zu 700 ml des dialysierten Enzyms, dessen Herstellung im vorstehenden beschrieben worden ist, wurden 15 g Phenoxymethylpenicillin, aufgelöst in 50 ml Wasser, zugegeben, so dass eine endgültige Konzentration von 20 mg/ml entstund. Das Gemisch wurde bei 340 inkubiert und der pH-Wert durch periodische Zugabe von wässriger n Ätznatronlösung auf den Wert 8,7 gehalten. Nach 9 Stunden wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit Phosphorsäure auf den Wert 2 eingestellt und die hierbei entstandene Fällung durch Zentrifugieren abgetrennt.
Anschliessend wurde die Lösung mit einem halben Volumteil Butylacetat extrahiert, um das restliche Phenoxymethylpenicillin sowie die Phenoxyessigsäure-Seitenkette, welche bei der Bildung der 6-Amino-penicillansäure abgespalten worden war, zu entfernen. Nach Neutralisation mit verdünnter Natronlauge wurde die erhaltene Lösung durch eine Kolonne des Austauscherharzes Dowex 1 (Markenname) durchlaufen gelassen und die Kolonne eluiert mit n Essigsäure, worauf konzentrierte und 5 n Salzsäure unter Rühren zugegeben wurden, um den pH-Wert auf 5,0 einzustellen. Hiernach wurde die kristalline 6-Amino-penicillansäure abfiltriert. Ihre Ausbeute betrug 1,0 g.
Kristalline 6-Amino-penicillansäure konnte ebenfalls direkt aus der Amidase Enzymlösung ohne Anwendung eines Ionenaustauscherharzes erhalten werden, indem man 200 ml der Amidase-Reaktionsmischung, welche 820 mg 6-Amino-penicillansäure enthielt auf den pH-Wert 2,0 mit Salzsäure ansäuerte.
Die entstandene Fällung wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und die Flüssigkeit mit 100 ml nButylacetat extrahiert. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und auf pH 6,5 mit Natriumhydroxyd eingestellt, wonach sie auf 40 ml eingeengt wurde. Ansäuern mit 5 n Salzsäure und Abkühlen auf 50 ergab die kristalline 6-Amino-penicillansäure, welche in üblicher Weise abgeschieden werden kann. Die Kristalle der Säure wurden mit ein wenig kaltem Wasser und nachfolgend mit trockenem Aceton gewaschen und darauf im Vakuum getrocknet. Man erhielt 390 mg.
Zur Illustration der Aktivität des Enzyms unter Verwendung der die genannten Penicilline enthaltenden Substrate im Vergleich mit Penicillin G wurde die folgende Verfahrensweise angewendet.
Jedes der zu prüfenden Penicilline wurde separat in 0,5 n wässriger Natriumbicarbonatlösung gelöst, hierbei auf eine Konzentration von 10 mg/ml gebracht und der pH-Wert auf 8,7 eingestellt. Ein Milliliter dieser Lösung wurde hierauf mit einem Milliliter der Enzymlösung beim pH 8,7 behandelt und das Gemenge bei 340 in einem Wasserbad 30 Minuten lang inkubiert. Am Ende dieser Zeit wurde eine Probe jedes der Gemische aufgetüpfelt auf ehromatographiestreifen Whatman Nr.4 (Markenname) und die chromatographische Trennung während 3 bis 4 Stunden lang in einem System aus Butanol, Äthanol, Wasser (4:1: 5) zur Abtrennung des nicht umgewandelten Penicillins laufen gelassen.
Andere Chromatographiestreifen wurden mit einer Standard-Konzentration von 6-Amino-penicillansäure angetüpfelt und in ähnlicher Weise behandelt. Nach der Chromatographie wurden die Streifen mit Phenylacetylchlorid und Natriumbicarbonat (zur Erzeugung von Benzylpenicillin) besprüht und hiernach auf Agarplatten gelegt, welche mit Sporen von Bazillus subtilis bekeimt worden waren, um schliesslich bei 370 zur Entwicklung der Inhibitionszonen inkubiert zu werden. Die hierbei auf den Penicillinen produzierte 6-Amino-penicillansäure wurde in der für Bio Tests üblicher Weise bestimmt.
In der folgenden Tabelle sind die erhaltenen Resultate ausgedrückt als Einheiten 6-Amino-penicillansäure pro ml, produziert im Gemisch von Enzym und Substrat.
Tabelle I
Penicillin V nButylthiomethyl- Penicillin G penicillin 10 1 Brühe 380 370 10 Brühe im Schüttelgefäss 110 150 5
Tabelle II Penicillln -K Penicillin V Penicillin G 58 30 1
Tabelle III Mischung natürflicher nutyliPenicillin Penicillin V Penicillin G
Penicilline
1-63 53 180 10
Beispiel 2
Eine Kultur von Botrytis cinerea B.R.L. 36 wurde in Schüttelflaschen gezüchtet, wobei ein Kul- turmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet wurde:
50 g Maismehl 1 -g Ammoninmsulfat
1 Liter Leitungswasser pH-Wert eingestellt auf 6,8 vor der Sterilisierung.
Zur Züchtung der Organismen wurde ein Keimstadium eingehalten während etwa 30. Stunden bei 260 in einem Kulturmedium der folgenden Zusam- mensetzung:
Kornpresssaft 80 ml handelsübliche Glucose 40 g
Leitungswasser 1 Liter pH-Wert auf 6,4 eingestellt vor der Sterilisierung.
Ungefähr 7 Vol.% der Keimfermentation wurden in das Züchtungsmedium eingeimpft. Beim Impfen sowohl des Keimstadiums als auch des Züchtungsstadiums wurde das Penicillin bis zu einem Pegel von 25'0 bis 2500 Einheiten pro Milliliter zuge -geb-en.
Nach dem die Fermentation 5 bis 6 Tage lang gelaufen war, hatte der Enzymtiter ungefähr sein Maximum erreicht, worauf das Penicillin zur Umwandlung in 6-Amino-penicillansäure zugegeben wurde. Zur Illustration der Enzymaktivität erhalten unter Verwendung der die genannten Penicilline enthaltenden Substrate im Vergleich mit Penicillin G, wurden die Penicilline separat und in steriler Lösung aseptisch zu einer Fermentation von Botrytis cinerea von 120 bis 144 Stunden Alter zugegeben. Eine geeignete Endkonzentration an Penicillin in der Brühe war 5000 Einheiten/ml.
Nach weiteren 24 Stunden Fermentationsdauer wurden Proben von jeder Brühe von ihren Mycelien sowie von weiteren festen Bestandteilen abgetrennt und abgemessene Volumina in jeder Probe zum Test auf Chromatographie streifen plaziert, wie dies im Beispiel 1 beschrieben worden ist.
Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle IV ausgedrückt als Einheiten 6-Amino-penicillansäure pro ml, erzeugt im Gemisch des Enzyms und Substrats.
Tabelle IV n-Butylthiomethyl- Mischung natürlicher
Penicillin K Penicillin G penicillin Penicilline
470 184 250 48
Beispiel 3
Die Beträge an 6-Amino-penicillansäure, erzeugt aus einem Gemisch natürlicher Penicilline während 24 Stunden bei 250 unter Verwendung anderer Typen von Mikroorganismen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind unten angeführt. Die Resultate sind ausgedrückt als Einheiten 6-Aminopenicillansäure -pro ml-im Gemisch von Enzym und Substrat, bestimmt durch Umwandlung in Benzyl -penicillin.
6-Amirio-penicillan- Mikroorganismus säure Hyphomyceten und Phycomyceten
Alternaria tenuis BRL. 32 25
Aspergillus sp. BRL. 78 30
Epicoccum sp. BRL. 64 10 -Fusarium sp. BRL. 46 20
BRL. 116 30
BRL. 205 10
BRL. 221 40