DE1795777C3 - - Google Patents

Description

CH-N

I I

CH-CO

worin X eine Acylamino- oder eine Aminogruppe bedeutet, durch Hydrolyse von Verbindungen der allgemeinen Formel

CH₂ ■ O · COCH₃

CH,-C

CCOOH

(I)

Cephalosporin C und dessen Derivate können einer enzymatischen Hydrolyse unter Verwendung einer aus Orangenschale stammenden Esterase (britische Patentschrift 9 66 222) unterworfen werden, um Produkte zu ergeben, worin die Acetoxygruppe durch eine Hydroxygruppe ersetzt ist, und aus derartigen Produkten können Analoge von Cephalosporin C und dessen Derivaten hergestellt werden, die statt einer Acetoxygruppe beispielsweise andere Acyloxygruppen oder Alkoxygruppen aufweisen. Solche Analogen sind von Interesse, da mehre von ihnen im Vergleich mit Cephalosporin C eine modifizierte Wirksamkeit besitzen.

Die enzymatische Hydrolyse von Cephalosporin C und dessen Derivaten mittels der Citrusesterase ist unbequem, vor allem, wenn man in größerem Maßstab

CH-N

I I

CH-CO

worin X die oben angegebene Bedeutung besitzt, mittels einer Esterase, dadurch gekennzeichnet, daß man als Esterase eine Esterase, stammend von Rhizobium trifolii, Rhizobium lupinii, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum oder Rhizobium phaseoli verwendet und die Hydrolyse bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Rhizobium trifolii, das als Wildstamm aus Trifolium dubium isoliert wurde, verwendet wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von Rhizobium trifolii verwendet wird, der auf Mannitagar ein wasserlösliches rotes Pigment bildet.

arbeitet, da eine sehr große Anzahl von Organen erforderlich ist, um ausreichend Enzym zur Hydrolyse selbst kleiner Mengen zu erhalten.

Es wurde gefunden, daß Esterasen, die aus Rhizobium trifolii, Rhizobium lupinii, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum oder Rhizobium phaseoli stammen, zur Hydrolyse von Cephalosporin C und dessen Derivaten zu den entsprechenden Hydroxymethylverbindungen befähigt sind.

Die Verwendung eines Mikroorganismus als Quelle von Enzym ist besonders zweckmäßig, da im allgemeinen der Organismus leicht in großem Maßstab durch an sich bekannte Arbeitsweisen, die in der Fermentatinnsindustrie gut eingeführt sind, gezüchtet werden kann. Die enzymatische Hydrolyse kann beispielsweise einfach bewirkt werden, indem der Organismus mit dem Cephalosporin C oder dem Derivat davon inkubiert wird, oder, was bevorzugter ist, der Organismus kann gezüchtet werden und esterasehaltiges Material daraus hergestellt werden, das für eine anschließende Hydrolysestufe benutzt werden kann.

Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxymethylcephalosporinen der allgemeinen Formel

CH₂ · OH

CH₂-C

C-COOH

CH-N

I I

CH-CO

worin X eine Acylamino- oder eine Aminogruppe bedeutet, durch Hydrolyse von Verbindungen der allgemeinen Formel

CH₂ · O · COCH₃

CH₂-C

S C·COOH

CH-N

CH-CO

I χ

in welcher X die oben angegebene Bedeutung besitzt, mittels einer Esterase, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Esterase eine Esterase, stammend von Rhizobium trifolii, Rhizobium lupinii, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum oder Rhizobium phaseoli verwendet und die Hydrolyse bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 durchführt.

Bakterien des Genus Rhizobium sind bekannt als die stickstoffbindenden Bakterien, die sich in den Wurzelknollen von verschiedenen Leguminosenpflanzen, z. B. Klee (Trifolium), Lupine (Lupinus) und Süßbohne (Lathyrus odoratus) finden. Species der Genus Rhizobium, bei welchen gefunden wurde, daß sie eine Esterase des gewünschten Typs bilden, sind Rhizobium trifolii, Rhizobium lupinii, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum und Rhizobium phaseoli.

Im allgemeinen scheint die gewünschte Rhizobiumesterase am besten aus einer Wildkultur eines Organismus der genannten Rhizobium-Species abzustammen (d.h. eines Stammes, der direkt von einer Pflanze isoliert wurde), und in einigen Fällen wurde gefunden, daß unzufriedenstellende Ergebnisse erhalten werden können, wenn man einen Organismus verwendet, der aus einer Kultursammlung stammt, möglicherweise aufgrund einer Mutation des Organismus unter den Bedingungen, unter welchen er in der Sammlung gehalten wird. Die Isolation des Organismus aus natürlichen Quellen kann nach Methoden durchgeführt werden, wie sie von Buchanan et al. in »Bacteriology«, 5. Auflage, The Macmillan Co, New York, 1951, beschrieben sind.

Bis jetzt wurden beste Ergebnisse durch Verwendung von Rhizobiurn trifolii erhalten, die als Wildstamm aus Trifolium dubium isoliert wurde. Solche Stämma entsprecher: der Beschreibung von Rhizobium trifolii, die von Bergey in »Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage, Baliere, Tindall and Cox, London, 1957, Seite 295, beschrieben sind. Es wurde jedoch festgestellt, daß zusätzlich zu den von Bergey angegebenen Merkmalen Stämme von R. trifolii, die sich als besonders brauchbar zeigten, ein wasserlösliches rotes Pigment auf Mannit-Agar bilden.

Wie oben angegeben, kann die erfindungsgemäße Hydrolyse von Verbindungen der oben beschriebenen allgemeinen Formel I einfach durch Inkubieren des Rhizobium-Organismus mit der zu hydrolysierenden Substanz durchgeführt werden, oder indem man aiternativ zuerst den Organismus züchtet und dann ein enzymreiches Material daraus herstellt, das man in einer getrennten Hydrolysestufe verwendet. Die zweite dieser Arbeitsweisen wird bevorzugt

Organismen des Genus Rhizobium können auf üblichen Medien entweder mittels Oberflächenkultur oder aerober Submerskultur gezüchtet werden, wobei letztere bevorzugt wird. Geeignete Medien sind beispielsweise von L e ν i η e et al. in »A compilation of culture media for the cultivation of micro-organisms«, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1930, unter dem Stichwort »nitrogen fixation« (Stickstoffbindung) beschrieben. Ein Medium auf der Basis von Fleischextrakt und Pepton hat sich als sehr zufriedenstellend gezeigt. Ein anderes Medium, das verwendet werden kann, ist ein solches auf der Basis von Hefeextrakt, Mannit und üblichen Nährsalzen. Im allgemeinen liegt der Stickstoffgehalt des Mediums vorzugsweise zwischen 0,1 und 0,3% N, z.B. 0,2% N. Kohlehydrate können nach Erfordernis zugegeben werden.

Zur Durchführung der Hydrolyse der Verbindung der allgemeinen Formel I in einem Züchtungsmedium wird die Verbindung einfach in das Medium einbezogen, und der Organismus wird in üblicher Weise gezüchtet.

Um ein enzymhaltiges Material aus einer Züchtung einer der oben genannten Species der Genus Rhizobium herzustellen, wird die Züchtung durchgeführt, um ein reichliches Wachstum zu liefern, wobei eine Züchtungszeit von etwa 24 Stunden im allgemeinen zufriedenstellend ist.

Die Zellen können dann geerntet werden, beispielsweise durch Zentrifugieren und anschließendes Waschen. Die isolierten Zellen werden dann einer Behandlung mil einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel zur Entfernung von Wasser und Fett unterworfen. Geeignete Lösungsmittel sind mit Wasser mischbare Ketone, ζ. B. Aceton, und mit Wasser mischbare Alkohole, z. B. Äthanol. Eine solche Behandlung kann beispielsweise durchgeführt werden, indem man die isolierten Zellen wieder in Wasser suspendiert, und die erhaltene Suspension in einen großen 5 Oberschuß des mit Wasser mischbaren Lösungsmittels gießt und anschließend rührt. Die erhaltene Festsubstanz kann mit frischem Lösungsmittel gewaschen werden und ist dann fertig zur Verwendung.

Die erfindungsgemäße Hydrolyse einer Verbindung

ίο der allgemeinen Formel I unter Verwendung einer oben beschriebenen enzymhaltigen Festsubstanz aus Rhizobium-Species wird in wäßrigen Medien bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 durchgeführt Wenn 7-ACA das Substrat ist, wird der pH-Wert vorzugsweise bei etwa 6,45 gehalten. Die enzymhaltige Festsubstanz aus Rhizobium-Species kann im Wasser suspendiert und für eine kurze Zeit inkubiert werden, um die Zellen zu hydratisieren. Die Verbindung der allgemeinen Formel I wird dann zugegeben, zweckmäßigerweise als Salz, ζ. Β.

als Natriumsalz. Der pH-Wert wird dann rasch auf den gewünschten Wert eingestellt. Die Hydrolyse wird dann durchgeführt, indem man das Gemisch bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise zwischen 20 und 45° C, hält, bis die Hydrolyse beendet ist. Die Beendigung der Hydrolyse kann festgestellt werden, indem man von Zeit zu Zeit einen Anteil des Reaktionsgemisches mit Alkali titriert.

Der pH-Wert kann mit fortschreitender Hydrolyse eingestellt werden, um ihn innerhalb der gewünschten Grenze zu halten, indem man Alkali zur Neutralisierung der gebildeten Essigsäure zugibt Wenn bei dieser Arbeitsweise die theoretische Menge an Alkali, die dem Acetatgehalt der zu hydrolysierenden Verbindung entspricht, verbraucht ist, kann die Reaktion als beendet betrachtet werden. Die Beendigung kann auch durch chromatographische Analyse verfolgt werden.

Die Hydrolyseprodukte können durch übliche Methoden gewonnen werden, wobei das tatsächliche Verfahren von der Art des Produktes abhängt. Als Vorstufe wird die Hydrolyseflüssigkeit vorzugsweise zuerst zur Entfernung von Protein daraus, z. B. durch Zugabe eines Proteinfällungsmittels, wie eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie Aceton oder Methanol, und anschließende Abtrennung des gefällten Proteins, z. B. · durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren, behandelt:

Bei lösungsmittellöslichen Hydroxymethylderivaten von Cephalosporin C, ζ. B. 7-Phenylacetamido-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-carbonsäure und 7-(Thienyl-2'-acetamidoJ-S-hydroxymethyl-ceph-S-em^-carbonsäu- re, kann die Kultur aus der Hydrolyse (unter Verwendung entweder lebender Organismen oder einer enzymhaltigen Festsubstanz) bei einem saueren pH-Wert der Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels für das gewünschte Produkt unterworfen werden. Die Extraktion wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 3 bis 4 durchgeführt. Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören beispielsweise Esterlösungsmittel, z. B. Äthylacetat oder Butylacetat, und mit Wasser nicht mischbare Ketone, ζ. B. Methylisobutylketon. Die so erhaltenen Lösungsmittelextrakte können mit Wasser, zweckmäßigerweise bei einem pH-Wert von 6 bis 8, z. B. etwa 7,5, reextrahiert werden, und das gewünschte Produkt kann gewonnen werden, z. B. durch Lyophilisieren, oder die Lösungsmittelex-

_b5 trakte können zur Trockne verdampft werden. Das erhaltene Produkt kann nach Wunsch umkristallisiert werden. Im Falle von Produkten, die nicht in Lösungsmitteln löslich sind, z. B. 7-(D-5'-Amino-5'-carb-

20

oxypentanamidoJ-S-hydroxymethyl-ceph-S-em^-carbonsäure und S-Hydroxymethyl^-amino-ceph-S-em-4-carbonsäure kann das Reaktionsgemisch zuerst zur Entfernung von Protein und anderem hochmolekularen Material wie oben beschrieben behändeIt werden. Das gewünschte Produkt kann dann durch Adsorption aus einem geeigneten Anionenaustausdierharz aus gepufferter Lösung und anschließende Elution gewonnen werden. Die erhaltenen Extrakte können aufgearbeitet werden, um die gewünschte Substanz zu gewinnen, beispielsweise lyophilisiert, und weiter nach Wunsch behandelt werden.

3-Hydroxymethyl-7-amino-ceph-3-em-4-carbonsäure (das Reaktionsprodukt von 7-ACA) wird zweckmäßiger gewonnen, indem man den pH-Wert des Reaktionsmediums auf den isoelektrischen Punkt des Produktes, das heißt einen pH-Wert von etwa 4,5, einstellt um die Ausfällung des Produktes zu bewirken. Der Niederschlag kann dann abfiltriert oder abzentrifugiert und gewaschen werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Vorarbeiten

Herstellung von Rhizobium-acetylesterase-haltigen
Festsubstanzen

a) Schüttelflaschenkultur. Aus Trifolium dubium durch Züchtung von oberflächensterilisierten Wurzelknollenabschnitten auf Nähragarmedium isoliertes Rhizobium trifolii wurde auf Nähragarschrägschnitten gehalten. Zellen aus einem Schrägs-jhnitt wurden in 10 ml sterilem Wasser suspendiert und zur Beimpfung von 10 · 40-ml-Flaschen von Nährbrühe, wie nachfolgend unter b) beschrieben, verwendet. Die Flaschen wurden auf einem Drehschüttler 2 Tage bei 26° inkubiert Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 5° geerntet, einmal mit Ringerlösung gewaschen und wieder zur Bildung eines dicken Zellbreies zentrifugiert.

Der Zellbrei aus 200 solcher Flaschen wurde in 50 ml Wasser verteilt und in 1 Liter kräftig gerührtes Aceton gegossen. Das Rühren wurde bei Zimmertemperatur 30 Minuten fortgesetzt, worauf die trockene Zellmasse durch Filtrieren gewonnen wurde. Nach Waschen mit frischem Aceton und Äther wurde der Filterkuchen an der Luft getrocknet. Ausbeute = 8,0 g

b) Züchtung in Laboratoriumsfermentationsgefäßen. Der gleiche Stamm von Rhizobium wurde auch in 5-Liter-Fermentationsgefäßen wie folgt gezüchtet: 120 g Fleischextrakt 120 g Pepton und 60 g Natriumchlorid wurden in 12 Liter Leitungswasser gelöst und 30 Minuten gerührt. Der pH-Wert wurde mit 12,5 ml 10n-Natriumhydroxid auf 7,2 eingestellt. Dann wurden Mengen vcn 3-31 in 5-Liter-Fermentationsgefäße unter Rühren zusammen mit Antischaummittel eingefüllt. Die Fermentationsgefäße wurden 30 Minuten bei 1,05 at sterilisiert. Jedes Fermentationsgefäß wurde mit 20 ml aus einer 24 Stunden alten Nährbrühekultur des Organismus beimpft und bei 26° inkubiert. Das Fermentationsgefäß wurde mit 6 l/Min, belüftet und mit 600 UpM gerührt. Die Fermentation wurde bei 46 Stunden abgebrochen, wo der pH-Wert auf 8,90 gestiegen war. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 5° geerntet, einmal mit Ringerlösung gewaschen und wieder in 50 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wurde in 1 1 Aceton

25

30

35 gegossen und bei Zimmertemperatur 30 Minuten gerührt Der Niederschlag wurde filtriert mit frischem Aceton und Äther gewaschen und an der Luft getrocknet was ein enzymhaltiges Pulver ergab. Ausbeute = 11,6 g.

c) Eine alternative Nährbrühe für die Kultur der Rhizobium species ist wie folgt:

Hefeextrakt

Mannit

K₂HPO₄

MgSO₄

NaCl

CaCI₂ · 6 H₂O

FoCl₃

Wasser

50 g

50 g

Ig

Ig

Ig

Ig

Spur

ad 51

Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,1 eingestellt

Der in den Beispielen erwähnte Thienylrest ist der 2'-Thienylrest

Beispiel 1

a) Einwirkung von Rhizobium-acetylesterase auf
7-Phenylacetamido-cephalosporansäure

5 g Rhizobiumacetonpulver, das wie im einleitenden Teil beschrieben hergestellt war, wurden in 200 ml Wasser suspendiert und 30 Minuten bei 30°C inkubiert 1 g 7-Phenylacetamido-cephalosporansaueres Natriumsalz (7 PACA) wurde dann zugegeben, das Ganze wurde schnell mit 10%iger (Vol/Vol.) Phosphorsäure auf pH 7,0 eingestellt und eine Probe von 0,1 ml wurde für die biologische Prüfung entnommen. Das Gemisch wurde dann bei 30° inkubiert und in Zeitabständen mit 1 n-Natriumhydroxyd auf pH 7,0 titriert. 0,l-m!-Proben für die biologische Prüfung wurden in entsprechenden Intervallen abgenommen. Die Reaktion zeigte den folgenden Verlauf:

45

50

55

60

65

Zeit	Zugegebene	Titer an 7 PACA
	1 n-NaOH
(Std.)	(ml)	O/ml bei
		V2000 Verdün
		nung)
0,0	0,00	2,1
0,5	0,90	1,05
1,0	1,62	0,79
1,5	2,05	0,575
2,0	2,10	-
Theor. = 2,22

Die Reaktion wurde dann abgebrochen, indem das Ganze unter Rühren in 400 ml Aceton gegossen wurde. Nach 10 Minuten wurde der Niederschlag abfiltriert. Aceton wurde vom Filtrat durch Verdampfen unter Vakuum entfernt und der Rückstand mit Wasser auf 200 ml verdünnt. Nach Filtrieren wurde die klare braune Flüssigkeit biologisch untersucht.

b) Extraktion von 7-Phenylacetamido-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-carbonsäure

Die obige Lösung wurde mit 10%iger (VoL/Vol.) Phosphorsäure auf pH 3,3 eingestellt und sofort mit 3 · 200 ml Äthylacetat extrahiert. Der verbrauchten wäßrigen Schicht wurde nach jeder derartigen Extraktion eine 0,1-ml-Probe für die biologische Prüfung entnommen, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

M 95

Extrakt Nr. Titer an 7 PACA

()'/m! bei
'/iod Verdünnung)

10,8
6,0

3,25
1,44

E^ (260 πιμ) = 199 87% rein.

Biologische Prüfung 92% rein.

30⁰C für 30 Minuten inkubiert. 1,0 g 7-(Thienyl-2'-acetamido)-cephalosporansaures Natriumsalz (7 TACA) wurden zugegeben, und das Ganze wurde rasch mit 10%iger (VoIVVoI.) Phosphorsäure auf pH 7,0 gebracht. Das Gemisch wurde dann bei 30°C inkubiert und mit 1 n-Natriumhydroxyd in regelmäßigen Zeitabständen auf pH 7,0 titriert. In entsprechenden Zeitabständen wurden 0,1-ml-Proben zur biologischen Prüfung abgenommen. Die Reaktion zeigte den folgenden Verlauf:

Es wurden also etwa 87% der biologischen Aktivität in das Lösungsmittel extrahiert.

Die vereinigten Äthylacetatschichten wurden dann i^r> mit 100 ml und 2mal mit 50 ml Wasser extrahiert, das mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung auf pH 7,5 eingestellt war. Der vereinigte Bicarbonatextrakt wurde dann durch 30minütiges Rühren mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz in der Wasserstofform 2« auf pH 5,5 eingestellt. Das Harz wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, und die vereinigten Filtrate und Waschwässer wurden lyophilisiert. Dies ergab das Natriumsalz von 7-Phenylacetamido-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure als weiße amorphe Festsub- 2> stanz (681 mg, 75% Ausbeute), das biologisch und durch UV-Analyse in wäßriger Lösung analysiert wurde.

Ei?_m (260 Γημ) = 157,5 68,5% rein.

Biologische Untersuchung 64,2% rein. jo

Die Bioautographie dieser Feststubstanz unter Anwendung des ursprünglichen Äthylacetat-O.lm-Natriumacetat(pH 5,0)-Systems zeigte nur eine biologisch aktive Zone an der Stelle von 7-Phenylacetamido-3-hy- r, droxymethyl-cephO-errM-carbonsäure.

c) Kristallisation des rohen Natriumsalzes von

7-Phenylacetamido-3-hydroxymethyl-ceph-3-

em-4-carbonsäure

4(1

839 m.g rohes, wie in Beispiel Ib hergestelltes 7-Phenylacetamido-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-carbonsaures Natriumsalz wurde mit 25 ml. 10 ml und 4 ml Methanol extrahiert und der Rückstand durch Zentrifugieren entfernt. Die methanolische Lösung wurde dann gelinde in einem langsamen Luftstrom bis zur beginnenden Kristallisation eingedampft, worauf sie 1 Stunde auf 5°C abgekühlt wurde. Es wurden weiße federartige Nadeln erhalten, die noch kalt abfiltriert und mit etwas kaltem Äthanol gewaschen wurden. Die Ausbeute nach Trocknen im Vakuum betrug 300 mg.

Dieses Produkt wurde biologisch und durch UV-Analyse wie oben untersucht.

Das Verdampfen der Mutterlaugen ergab eine zweite Ausbeute von 98 mg an Kristallen. Die Reinheit war jedoch viel geringer (67,5% durch UV, 75,8% durch biologische Prüfung).

Beispiel 2

Einwirkung von Rhizobium-acetylesterase auf
7-(Thienyl-2'-acetamido)-cephalosporansäure

Wie im einleitenden Teil hergestelltes Rhizobiumpulver (5 g) wurde in 200 ml Wasser suspendiert und bei

Zeit	Zugegebene	Titer an 7 TACA
	1 n-NaOH
(Std.)	(ml)	(y/ml bei
		'/2000 Verdün
		nung)
0	0,00	1,68
0,5	0,90	1,05
1,0	1,60	0,81
2,5	2,30	0,68
3,0	2,30	0,57
Theor. = 2,22.

Die Reaktion wurde dann durch Eingießen in 400 ml Aceton unter Rühren beendet. Nach 10 Minuten wurde der Niederschlag abfiltriert und das Aceton aus dem Filtrat durch Vakuumverdampfen entfernt. Der Rückstand wurde mit Wasser auf 200 ml verdünnt und filtriert. Das klare, braune Filtrat wurde mit 10%iger (VoIVVoI.) Phosphorsäure auf pH 3,3 eingestellt und mit 3-20OmI Äthylacetat extrahiert. Die verbrauchte wäßrige Schicht wurde nach jeder Extraktion auf biologische Aktivität geprüft, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden:

Extrakt Nr.	Titer an 7 TACA
	O'/ml bei
	'HKi Verdün
	nung)
0	13,2
1	7,5
2	4,95
3	2,2

Es wurden also etwa 84% der biologischen Aktivität in das Lösungsmittel extrahiert.

so Die Äthylacetatschichten wurden vereinigt und mit 100 ml und 2-5OmI Wasser extrahiert, das mit gesättigter Bicarbonatlösung auf pH 7,5 eingestellt war. Der Bicarbonatextrakt wurde dann durch Verrühren mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz in der Wasserstofform auf pH 5,5 eingestellt Das Harz wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, und die vereinigten Filtrate und Waschwässer lyophilisiert, was 592 mg (66% der Theorie) des Natriumsalzes von 7-(Thienyl-2'-acetamido)-3-hydroxymethy1-ceph-3-em-4-carbonsäure ergab.

Das Produkt wurde biologisch und durch UV-Analyse untersucht:

65

E !* (236 mμ) = 276 81 % rein.

Biologische Prüfung 65% rein.

Bioautographie unter Verwendung des Athylacetat-0,1m-Natriumacetat(pH 5,0)-Systems zeigt eine größere

biologisch aktive Zone an der Stelle der Hydroxymcthylverbindung zusammen mit einer schwachen Spur der ursprünglichen Cephalosporansaure.

Beispiel 3

F.inwirkung von Rhizobium-acctylesterase auf
7-ACA und Cephalosporin C

Rhizobium irifolii (wilder Stamm) wurde in einer Nährbrühe gezüchtet und Teile der Kulturflüssigkeit wurden dann mit einem gleichen Volumen einer Lösung von entweder 7-ACA (10 mg/ml) oder Cephalosporin C (10 mg/ml) in Phosphatpuffer von pH 7,0 oder von Puffer allein gezüchtet. Die zwei Substratlösungen wurden auch mit einem gleichen Volumen an nichtbeimpfter Brühe gemischt, wobei letztere als Kontrollen wirkte.

Alle Prüflösungen wurden dann in einem Wasserbad bei 33°C über Nacht inkubiert. 10 μΙ Anteile wurden auf Papiere, die auf pH 6,0 gepuffert waren, aufgetupft und die Chromatogramme wurden in 70%igem (VoUVoI.) wäßrigem n-Propanol über Nacht entwickelt.

Die Chromatogramme wurden unter UV-Licht geprüft und die absorbierenden Zonen wurden markiert. Dann wurde ein Papier mit lm-Pyridin in Aceton und anschließend mit 1%igem (VoUVoI.) Phenylacetylchlorid in Aceton besprüht. Dieses Papier und ein identisches nicht besprühtes Papier wurden dann auf Platten aufgebracht, die mit Bacillus subtilis beimpft waren. Nach Inkubieren über Nacht wurden auch die biologisch aktiven Zonen festgestellt.

Ergebnisse
(i)7-ACA

Die Inkubation von 7-ACA mit Ganzkulturen von Rhizobium trifolii (wilder Stamm) führten zur Bildung einer Substanz mit Rf = 0,62mal demjenigen von 7-ACA, das heißt, an der erwarteten Stelle für die entsprechende Hydroxymethylverbindung. Überdies zeigte dieser Fleck biologische Aktivität gegenüber B. subtilis nur, nachdem das Papier mit Pyridin und Pheiiyiacetyichiorid besprüht worden war. Die Papierchromatogramme zeigten, daß kein 7-ACA nach der Inkubation übriggeblieben war, während in den Kontrollen 7-ACA festgestellt werden konnte. Diese Ergebnisse zeigen daher, daß Rhizobium trifolii 7-ACA desacetylieren kann.

(ii) Cephalosporin C

Es wurde auch gezeigt, daß Rhizobium trifolii Cephalosporin C nach dergleichen Arbeitsweise wie für 7-ACA beschrieben desacetyliert. In diesem Falle war es jedoch nicht notwendig, das Papier mit Pyridin und Phenylacetylchlorid zu besprühen, um die biologische Aktivität des Produktes zu zeigen.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxymethylcephalosporinen der allgemeinen Formel

CH, OH

CH,-C

C COOH (II)