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Verfahren zur Gewinnung eines antibiotischen Wirkstoffes Geomycin
Es wurde gefunden, daß man einen wertvollen antibiotischen Wirkstoff Geomycin dadurch
erhalten kann, daß man Streptomyces xanthophaeus in einem Nährmedium züchtet und
aus der entstandenen Kultur, vorzugsweise aus den abgetrennten Kulturfiltraten,
das Antibioticum gewinnt.
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Vorzugsweise wird die Züchtung des Streptomyces xanthophaeus unter
aeroben Bedingungen und im Submersverfahren durchgeführt.
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Streptomyces xanthophaeus n. sp. aus einer Erdprobe isoliert, welche
in einem Muschelkalkhang in der oberen Rhön entnommen wurde. Der Stamm hat sehr
charakteristische Eigenschaften, bildet ein gelbbraunes lösliches Pigment und gehört
keinesfalls in die griseus-Gruppe nach der Bergeyschen Definition, obwohl er stark
aktiv ist gegen gramnegative Bakterien. AufCa-Malatagar und auf synthetischer Lösung
wird das Pigment intensiv rotgelb. Auf allen übrigen Nährböden herrscht eine braungelbe
Färbung vor. Lindenbein bezeichnet diesen Stamm daher als Streptomyces xanthophaeus
(von xanthos = gelb und phaeus = braun). Von den beschriebenen Arten kann man allenfalls
Str. flaveolus und erythreus zum Vergleich heranziehen, doch fallen die Unterschiede
so stark ins Auge, daß auf eine Gegenüberstellung im einzelnen verzichtet werden
kann.
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Streptomyces xanthophaeus hat folgende Diagnose Synthetischer Agar:
Wachstum gut bis sehr gut, krustig, glatt, rückwärts hellgelb, braungelb, schließlich
hellbraun; Luftmycel wollig, weiß, später weißgrau und rötlichgräa; lösliches Pigment
hellbraun, später gelbbraun. Synthetische Lösung: Sehr starkes Wachstum, Decke und
Ring, später auch schwaches Sediment, farblos, rückwärts weißgelb bis hellgelb;
Luftmycel wollig, weiß, später grauweiß; lösliches Pigment goldgelb, später dunkelrotgelb.
Glukosebrühe: Wachstum
gut, anfangs nur Decke, farblos, später starkes
flockiges Sediment; Luftmycel wollig, grauweiß, später schwindend; lösliches Pigment
hellgelb, später braungelb. Glukoseagar: Wachstum gut, effus, farblos, rückwärts
hellgelb; Luftmycel staubig, selten sammetig; lösliches Pigment sattgelb, bei starker
Luftmycelbildung hellbraun. Glukose-Asparagin-Agar: Wachstum gut, effus, farblos,
rückwärts hellgelb; Luftmycel staubig, weiß; lösliches Pigment leicht hellgelb.
Ca-Malatagar : Wachstum sehr gut, krustig, rückwärts dunkelrotgelb; Luftmycel sammetwollig,
weißgrau, über weißgelb in rotgrau; lösliches Pigment dunkelrotgelb. Gelatinestich:
Wachstum gut, lederartig, braun; Luftmycel sammetig, aschgrau; lösliches Pigment
stark gelbbraun; Verflüssigung und Wachstum rübenförmig. Stärkeplatte: Wachstum
gut, lichenoid, erhaben; Luftmycel sammetig, violettgrau; amylolytische Zone r =
z cm. Nähragar: Wachstum gut, effus, glatt rückwärts hellbraun; Luftmycel mehlig,
grauweiß; lösliches Pigment sattgelb, später gelbbraun. Kartoffel: Wachstum gut,
lichenoid, erhaben; Luftmycel staubig, im Zentrum sammetig, grau; kein lösliches
Pigment. Karotte: Wachstum viel schwächer; Luftmycel weißgrau. Cellulosemedium:
Kein Wachstum. Milchagar: Wachstum sehr gut, lichenoid; Luftmycel sammetig, grau
bis violett, breite nackte Randzone grau; lösliches Pigment sehr stark dunkelbraun;
proteolytische Zone r = i cm; Lackmus stark blau.
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Streptomyces erythreus Waksm. bildet kein braunes lösliches Pigment
aus, und der diesem ähnliche, aber braunes Pigment bildende erythrochromogenes ist
nicht proteolytisch und macht auf Ca-malat kein gelbes Pigment, das Verhalten auf
synthetischem Agar ist nicht beschrieben.
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Auch Varianten und Mutanten dieses Stammes, die der oberen Beschreibung
nicht voll entsprechen, kommen erfindungsgemäß für die Herstellung des neuen Antibioticums
Geomycin in Frage.
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Das erfindungsgemäß herzustellende Antibioticum hat basische Eigenschaften.
Seine Reindarstellung ist noch nicht gelungen. Zur Gewinnung von Geomycin wird ein
geeigneter Nährboden mit Streptomyces xanthophaeus beimpft und q. bis 5 Tage unter
aeroben Bedingungen bei etwa 30' bebrütet. Für die Gewinnung von Geomycin ist eine
wäßrige Nährflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung geeignet: iooo 1 Leitungswasser
werden versetzt mit 2o kg Glycerin, io kg Kaliumnitrat, i kg sekundärem Kaliumphosphat,
i kg Natriumchlorid, 5o g Magnesiumsulfat, io g Ferrosulfat, io g Calciumcarbonat.
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Mit Erfolg können auch andere Nährmedien benutzt werden, die eine
assimilierbare Kohlenstoffquelle und ein stickstoffhaltiges Material neben den übrigen
Nährstoffen, insbesondere Salzen, enthalten. Als assimilierbare Kohlenstoffquelle
kommen u. a. Kohlehydrate, wie Stärke, Glykogen, Glykose, oder mehrwertige Alkohole,
wie Glycerin und Sorbit, in Frage. Geeignete stickstoffhaltige Materialien sind
Pepton, Glykokoll, Melasse, Maisquellwasser, Milchproteine, hydrolysiertes Kasein,
Sojabohnenmehl, Kaliumnitrat.
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Die Züchtung des Mikroorganismus kann sowohl im Oberflächenverfahren
wie auch im submersen Verfahren unter Zuführung von Sauerstoff bzw. Luft erfolgen.
Man erhält je nach pa schwachgelblich gefärbte bis gelbe Lösungen mit weißlich bis
grau gefärbtem Mycel. Das Geomycin befindet sich zum weitaus überwiegenden Teil
in der Nährlösung.
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Es kann aus der Nährlösung nicht mit den üblichen Extraktionsmitteln
extrahiert werden, auch nicht nach Veränderung des p$ nach der alkalischen oder,
sauren Seite. Dagegen läßt es sich an Adsorptionsmitteln adsorbieren und aus den
Adsorbaten wieder eluieren.
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Als Adsorptionsmittel sind geeignet Kohle und Ionenaustauscher, insbesondere
Kationenaustauscher, wie Polymerisate mit Carboxyl- oder Sulfonsäuregruppen bzw.
Kondensate von Phenolcarbonsäuren und Formaldehyd. Die Elution aus solchen Adsorbaten
wird zweckmäßig mit verdünnter Säure, der zur Vermeidung des Herauslösens anorganischer
Verunreinigungen mit Wasser mischbare Lösungsmittel, vorzugsweise Methanol oder
Aceton, zugesetzt werden können, vorgenommen.
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Es ist auch möglich und oft zweckmäßig, die beiden Prozesse der Züchtung
und Adsorption dadurch zu vereinigen, daß man das Adsorptionsmittel von vornherein
der Nährlösung zusetzt und nach beendeter Züchtung das Antibioticum Geomycin aus
dem mit dem Mycel abgetrennten Adsorbat gewinnt. Bei dieser Arbeitsweise enthält
das Kulturfiltrat kein Geomycin. Dieses wird vielmehr aus dem Adsorbat eluiert.
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Aus den Eluaten läßt sich das Rohgeomycin durch mit Wasser lösliche
Lösungsmittel wie niedere Alkohole oder Ketone ausfällen. Gegebenenfalls können
zur weiteren Reinigung diese Adsorptions- und Elutionsvorgänge wiederholt werden.
Das Geomycin liegt nach der Ausfällung als Salz der zur Elution verwendeten Säure
vor.
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Das Sulfat des Rohgeomycins zeigt keinen definierten Schmelzpunkt.
Es zersetzt sich oberhalb i85° unter Dunkelfärbung. An solchen Rohprodukten wurden
Drehungen von Fad D = etwa -i5° in wäßriger Lösung gefunden. Sie enthalten C, H
und N.
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Eine weitere Reinigung läßt sich durch Verteilung zwischen verschiedenen
Lösungsmittelphasen erzielen. Als geeignetes Lösungsmittelpaar kommt hierfür z.
B. Phenol und Wasser in Frage. Dabei werden Begleitstoffe abgetrennt, die leicht
in Phenol löslich sind, während das Geomycinsulfat bei der Verteilung vorwiegend
in der wäßrigen Phase verbleibt.
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Das rohe Geomycinsulfat, hat eine antibiotische Wirksamkeit von i
: i ooo ooo gegen Staph. aureus, i : Zoo ooo gegen Bact. coli und zeigt auch gegenüber
Proteus, Pneumobact. Friedländer, Bact. lactis aerogenes, Bact. faecalis alcaligenes,
Typhus- und Paratyphusbakterien, Gärtner- und E-Ruhr-Bakterien sowie gegen Influenzabakterien
in vitro eine starke Hemmwirkung. Gegen Enterokokken, Pneumokokken und gegen haemolytische
und vergrünende Streptokokken hat Geomycin nur eine geringe Wirkung.
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Auch bei der mit Entamöba histolytica infizierten Ratte hat Geomycin
eine gute therapeutische Wirkung. Beispiel i Für die Züchtung des Impfmaterials
für einen iooo 1 Ansatz werden mehrere i-1-Erlenmeyer mit je i5o ccm Nährlösung
folgender Zusammensetzung beschickt und
sterilisiert: 2 °/o Glycerin,
0,15 °j, Glykokoll, 0,2 °/o Maisquellwasser, 0,15 °,1o sekundäres Kaliumphosphat,
o,1 % Natriumchlorid, o,oo5 °,/o Magnesiumsulfat, o,ooi °/o Ferrosulfat, o,oo1 °/o
Calciumcarbonat gefällt.
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Die Lösung hat dann ein p$ von 6,8 bis 7,0. Man @eimpft sie mit Sporen
von Streptomyces xanthophaeus, die auf einer Agarkultur gewonnen worden sind. Die
Koben werden 6 Tage bei 30° geschüttelt und danach vereinigt. Es werden etwa 11;'Z
bis 2 1 für die Beimpfung eines looo-l-Ansatzes verwendet.
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In einem mit Rühr- und Belüftungsvorrichtung versehenen Fermenter
werden etwa 8oo 1 folgender Nährlösung bereitet: 2o kg Glycerin, 1o kg Kaliumnitrat,
1 kg sekundäres Kaliumphosphat, i kg Natriumchlorid, 5o g Magnesiumsulfat, 1o g
Ferrosulfat, 1o g Calciumcarbonat.
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Nach dem Sterilisieren und Beimpfen rührt man die Kultur Zoo Stunden
lang bei 30° unter Belüftung mit steriler Luft. Das Filtrat hat dann einen Hemmwert
gegen Streptomyces aureus von 1 : 1ooo. Man filtriert oder zentrifugiert dann das
Mycel ab und rührt das Filtrat 1 Stunde lang mit 4 kg Adsorptionskohle. Die Kohle
wird abzentrifugiert und mit 400 1 Wasser auf der Zentrifuge gewaschen. Das Waschwasser
wird verworfen. Das Adsorbat wird mit 4001 15%igem wäßrigem Aceton, das mit verdünnter
Schwefelsäure auf p112 angesäuert ist, i Stunde lang gerührt. Dabei wird so viel
Schwefelsäure nachgegeben, daß das pg dauernd auf p112 gehalten wird.
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Das Eluat wird von der Kohle abgetrennt und mit Barytwasser auf p11
6 eingestellt. Dabei scheidet sich Bariumsulfat aus, das durch Zentrifugieren abgetrennt
wird. Das blanke Zentrifugat wird dann im Vakuum bei niedriger Temperatur auf etwa
ro 1 eingeengt. Man saugt die ausgeschiedenen Salze ab und konzentriert das Filtrat
auf 51. Dann wird wieder mit verdünnter Schwefelsäure ein p11 von 2 eingestellt
und unter Rühren so viel Methanol zugesetzt, bis eine 3o°/oige Methanolkonzentration
erreicht wird. Die sich hierbei ausscheidenden amorphen Substanzen haben eine nur
geringe antibiotische Wirkung.
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Das Filtrat der Methanolfällung wird mit Schwefelsäure wiederum auf
p$ 2 eingestellt und dann weiterhin unter Rühren Methanol zugesetzt, bis eine 8o°/oige
Methanolkonzentration erreicht ist. Hierbei fällt ein amorpher, flockiger Stoff
aus, der hygroskopisch ist. Er wird mit Methanol ausgewaschen und mit Äther trockengesaugt.
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Man erhält ein kaum gefärbtes, weißes Pulver, das aus dem Sulfat des
Geomycins besteht und das in Wasser blank löslich ist. Es ist nicht mehr hygroskopisch.
Ausbeute etwa 28o g. Beispiel 2 looo 1 Nährlösung werden in der in Beispiel 1 angegebenen
Weise angesetzt. Man fügt 4 kg Adsorptionskohle hinzu, sterilisiert und beimpft
wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach viertägigem Rühren und Belüftung unter sterilen
Bedingungen zentrifugiert man das Mycel zusammen mit der Kohle ab und erhält etwa
2o bis 25 kg feuchtes, kohlehaltiges Mycel. Diese Masse wird in derselben Weise
aufgearbeitet wie das Kohleadsorbat in Beispiel 1. Die Ausbeute beträgt etwa 3oo
g.