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ÖSTERREICHISCHES PATENTAMT Verfahren zur Herstellung von Porfiromycin
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums.
Es wurde gefunden, dass gewisse Stämme des Organismus Streptomyces verticillatus, wie diejenigen die in der American Type Culture Collection deponiert wurden und dort die ATCC Nr. 13495, 13538 und 13539 erhielten, beim Kultivieren unter gesteuerten Fermentationsbedingungen ein neues Antibioticum
EMI1.1
gram-negative als auch gegen gram-positive Bakterien. In der Beschreibung wird ein Spektrum der anti- bakteriellen Aktivität aufgeführt. Dabei soll betont werden, dass Porfiromycin hinsichtlich seiner Aktivi- tät nicht auf diese speziellen Bakterien beschränkt ist.
Die zur Bildung von Porfiromycin angewendeten Stämme von Streptomyces verticillatus gehören zu der taxonomischen Untergruppe des Genus Streptomyces, die wegen der Art und Weise, in der sich die sporenbildenden Zweige im verwirtelten Knoten längs der Luft-Hyphe erheben, gewöhnlich als"Wirtel- Formen" (whorled forms) bezeichnet werden. Dieser Charakter, zusammen mit der olivgelben Farbe der Sporen in Masse bestimmt die Einstufung dieses Organismus in der olivgelben Reihe der BiverticillusGruppe, entsprechend der Aufteilung des Genus in Gruppen und Reihen, wie sie von Pridham et al in Applied Microbiology 6 [1958] S. 52-79 angegeben ist. Der Einfachheit halber werden die neuen Stämme in der vorliegenden Beschreibung als Stämme AB-929, AA-849 und AB-286 bezeichnet.
Bei der Beschreibung des Organismus sind die unterstrichenen Farben jene, die von der"Color Standards and Color Nomenclature'*von R. Ridgway, Washington, D. C., [1912] bestimmt wurden.
Die allgemeine Beschreibung von AB-929 ist wie folgt :
Wachstum : Mässiges bis gutes Wachstum in den meisten Medien, weitgehende Ausbreitung auf Mais- quell-Flüssigkeit-Agar ; geringes Wachstum auf Czapek-, Czapek-Mannit-und Nährmittel-Agar.
Luft-Mycel und/oder Sporenfarbe in Masse : Die Sporen sind in Masse tief olivgelb. Das Luft-Mycel ist weisslich und manchmal durch spurenweise Sporenbildung grau getönt.
Lösliche Pigmente : Keine.
Farbänderung : Auf den meisten Medien in Schattierungen von hellem Braun, das auf einem Nährmit- tel, aufBennett-, Sabouraud-und Kobalt-Amidex-Agar dunkler wird.
Morphologie : Das Luft-Mycel ist samtartig und besitzt einfache und spärlich verzweigte vegetativeFa- sern. Die Sporophoren (Sporophores) erheben sich in zweifachen Wirteln (biverticillate) von Sporenketten auf den geraden Luftfasern. Die Sporen sind zylindrisch. 0, 6-0, 8 p x lez kleben in langen Ketten aneinander und sind schwierig aufzubrechen.
Temperatur-Verhältnisse : Der optimale Bereich für Wachstum und Sporenbildung liegt bei 28-37 C.
Die folgende Tabelle gibt die Charakteristika für die Züchtung von AB-929 auf mehreren verschiedenen Agar-Medien in Petrischalen :
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Tabelle 1
EMI2.1
<tb>
<tb> Medium <SEP> Wachstum <SEP> Luft-Mycel <SEP> und <SEP> Sporenfarbe <SEP> Lösliches <SEP> Pigment <SEP> Farbänderung <SEP> Bemerkungen
<tb> Waksmans <SEP> mässig <SEP> : <SEP> Luft-Mycel <SEP> weisslich: <SEP> Sporenbildung <SEP> kein <SEP> farblos <SEP> bis <SEP> tief <SEP> oliv- <SEP> gute <SEP> Hydrolyse
<tb> Stärke-Agar <SEP> etwas <SEP> beschränkt <SEP> en <SEP> masse <SEP> mässig, <SEP> tief <SEP> olivgelb <SEP> gelb
<tb> Asparagin <SEP> mässig <SEP> ;
<SEP> weisses <SEP> Luft-Mycel, <SEP> Spuren <SEP> grauer <SEP> kein <SEP> tonfarben <SEP> begrenztes <SEP> farbloses <SEP> Exsudat
<tb> Dextrose <SEP> sich <SEP> ausbreitend <SEP> Sporenbildung
<tb> Fleischextrakt-Agar
<tb> Benedicts-Agar <SEP> mässig <SEP> ; <SEP> Luft-Mycel <SEP> weiss <SEP> ; <SEP> keine <SEP> Sporen- <SEP> kein <SEP> tonfarben <SEP> reichliche, <SEP> farblos-bis <SEP> geletwas <SEP> beschränkt <SEP> bildung <SEP> bes <SEP> Exsudat
<tb> Synthetischer <SEP> Agar <SEP> dünn <SEP> ; <SEP> Luft-Mycel <SEP> weiss <SEP> ; <SEP> keine <SEP> Sporen- <SEP> kein <SEP> gelblichweiss <SEP> bis
<tb> (Czapeks-Agar) <SEP> beschränkt <SEP> bildung <SEP> weiss
<tb> Emersons-Agar <SEP> gut <SEP> ; <SEP> Luft-Mycel <SEP> weiss <SEP> ;
<SEP> keine <SEP> Sporen- <SEP> kein <SEP> tonfarben <SEP> begrenztes <SEP> farbloses <SEP> Exsudat
<tb> sich <SEP> ausbreitend <SEP> bildung
<tb> Nähr-Agar <SEP> leichtes <SEP> Waschs- <SEP> Lfut-Mycel <SEP> weisslich; <SEP> leichte <SEP> kein <SEP> natalbraun <SEP> Ausgezeichnete <SEP> Sektorentum <SEP> graue <SEP> Sporenbildung <SEP> bildung
<tb> Calciummalat <SEP> mässig <SEP> ; <SEP> Luft-Mycel <SEP> weiss <SEP> ; <SEP> getönt <SEP> mit <SEP> Grau <SEP> kein <SEP> gelblich <SEP> bis <SEP> keine <SEP> Klärung <SEP> von <SEP> Malat
<tb> etwas <SEP> beschränkt <SEP> aus <SEP> leichter <SEP> Sporenbildung <SEP> tonfarben
<tb> Glucose-Agar <SEP> gut <SEP> ; <SEP> weisses <SEP> Luft-Mycel <SEP> ; <SEP> Spuren <SEP> an <SEP> kein <SEP> tonfarben
<tb> sich <SEP> ausbreitend <SEP> grauer <SEP> Sporenbildung
<tb> Krainkys- <SEP> mässig <SEP> weissliches <SEP> Luft-Mycel <SEP> ;
<SEP> Sporen-kein <SEP> tonfarben <SEP> begrenztes <SEP> farblos <SEP> bis <SEP> gelbDextrose- <SEP> Agar <SEP> bildung <SEP> leicht <SEP> ; <SEP> hellgrauoliv <SEP> bis <SEP> liches <SEP> Exsudat <SEP> ; <SEP> dünn, <SEP> federolivgelb <SEP> artiger <SEP> Rand
<tb> Kartoffel- <SEP> mässig <SEP> weisses <SEP> Luft-Mycel <SEP> ; <SEP> Spuren <SEP> an <SEP> kein <SEP> tonfarben
<tb> Dextrose-Agar <SEP> grauer <SEP> Sporenbildung
<tb>
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Tabelle l (Fortsetzung)
EMI3.1
<tb>
<tb> Medium <SEP> Wachstum <SEP> Luft-Mycel <SEP> und <SEP> Sporenfarbe <SEP> Lösliches <SEP> Pigment <SEP> Farbänderung <SEP> Bemerkungen
<tb> Bennets-Agar <SEP> mässig <SEP> weisses <SEP> Luft-Mycel <SEP> ;
<SEP> Spuren <SEP> kein <SEP> natalbraun <SEP> wenig, <SEP> farblos <SEP> bis <SEP> gelbliches
<tb> von <SEP> grau <SEP> bis <SEP> tief <SEP> olivgelber <SEP> Spo-Exsudat <SEP> ; <SEP> dünn, <SEP> federartiger <SEP> Rand
<tb> renbildung
<tb> Maisquell-Flüssigkeit <SEP> gut <SEP> ; <SEP> Kolonie <SEP> Oberfläche, <SEP> charakteri-kein <SEP> farblos <SEP> bis <SEP> tief <SEP> oliv-ausgezeichnete <SEP> Sektorenbildung
<tb> weitgehende <SEP> siert <SEP> durch <SEP> schwere <SEP> Sporenbil- <SEP> gelb <SEP>
<tb> Ausbreitung <SEP> dung <SEP> in <SEP> tief <SEP> olivgelben <SEP> SchatterungenSabourauds- <SEP> mässig; <SEP> weisses <SEP> Luft-Mycel; <SEP> keine <SEP> Sporen-kein <SEP> kastanienbraun <SEP> geringes, <SEP> farblos <SEP> bis <SEP> gelbliches
<tb> Maltose-Agar <SEP> etwas <SEP> beschränkt <SEP> bildung <SEP> Exsudat <SEP> ;
<SEP> dünn, <SEP> federartiger
<tb> Rand
<tb> Cobalt-Amidex <SEP> gut <SEP> ; <SEP> weisses <SEP> Luft-Mycel, <SEP> getönt <SEP> mit <SEP> kein <SEP> schwärzlichbraun
<tb> sich <SEP> ausbreitend <SEP> Grau <SEP> aus <SEP> der <SEP> leichten <SEP> Sporenbildung
<tb> Hefe-Malz-Agar <SEP> mässig <SEP> Luft-Mycel <SEP> weisslich <SEP> ; <SEP> keine <SEP> kein <SEP> tonfarben <SEP> gerunzelte <SEP> Kolonie
<tb> Sporenbildung
<tb> Czapeks-Dox-spärlich, <SEP> dünn <SEP> weiss <SEP> ; <SEP> keine <SEP> Sporenbildung <SEP> kein <SEP> farblos <SEP> bis <SEP> weiss
<tb> Mannit-Agar
<tb>
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EMI4.1
Tabelle 2
EMI4.2
EMI4.3
<tb>
<tb>
Medium <SEP> Wachstum <SEP> Luft-Mycel <SEP> und <SEP> Sporenfarbe <SEP> Lösliches <SEP> Pigment <SEP> Farbänderung <SEP> Bemerkungen
<tb> Pepton-Eisen-Agar <SEP> gut---Hg <SEP> positiv
<tb> Gelatine-Agar <SEP> gut-Tyrosinase <SEP> positiv
<tb> (Tyrosinase <SEP> Test)
<tb> Gelatine <SEP> gut-teilweise <SEP> Verflüssigung
<tb> Kartoffel-Pfropfen <SEP> stark <SEP> Luft-Mycel <SEP> weiss <SEP> ; <SEP> grau <SEP> getönt <SEP> von <SEP> geringe <SEP> Graufärbung <SEP> an
<tb> spurenweiser <SEP> Sporenbildung <SEP> der <SEP> Kartoffel
<tb> Karotten-Pfropfen <SEP> gut <SEP> weisses <SEP> Luft-Mycel, <SEP> keine <SEP> kein
<tb> Sporenbildung
<tb> Lackmus-Milch <SEP> mässig <SEP> weisses <SEP> Luftwachstum <SEP> ; <SEP> keine <SEP> geringe <SEP> braune <SEP> Farbe-keine <SEP> Koagulation <SEP> ;
<SEP>
<tb> Sporenbildung <SEP> im <SEP> oberen <SEP> Medium <SEP> teilweise <SEP> Peptonisierung <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Cellulose <SEP> + <SEP> geringes <SEP> keine <SEP> Cellulose-Zer-
<tb> (Filtrierpapier <SEP> in <SEP> Wachstum <SEP> setzung
<tb> Czapeks <SEP> Lösung)
<tb>
EMI4.4
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In der oben erwähnten olivgelben Reihe von Pridham gibt es vier Arten. Diese unterscheiden sich von
AB-929 wie folgt :
Die erste, S. albireticuli, unterscheidet sich von AB-929 dadurch, dass sie Sporenmassen in Schattierungen von fahlem, ockerfarbigem Lachs bis warmem Ledergelb besitzt und dass die Sporenbildung in vielen Medien leicht erfolgt. Bezugskulturen von S. albireticuli zeigen Kulturabweichungen von AB-929 wie Wachstum, Farbänderung usw.
Streptomyces caespitosus besitzt laut Beschreibung auf verschiedenen Medien ein Luftmycel in gelblichen bis grünlichen Schattierungen ; auch werden auf synthetischem Agar erhöhte und caespitose Koloniezentren gebildet, die diese Art von AB-929 unterscheidbar machen. S. caespitosus lässt sich ferner von
AB-929 durch die geringere Grösse seiner Conidia, fehlende Tyrosinase-Bildung, durch seine grössere Auflöskapazität für Gelatine und durch seine reichliche Produktion von löslichen gelb-braunen Pigmenten auf vielen Medien unterscheiden.
Streptomyces eurocidicus unterscheidet sich von AB-929 dadurch. dass er sich auf verschiedene Medien gelblich bis bräunlich entwickelt, durch seine mangelnde proteolytische Wirkung in Gelatine und dadurch, dass er Milch nicht peptonisiert.
Vom Streptomyces olivoverticillatus ist weder eine Beschreibung noch eine Bezugskultur für Vergleichszwecke verfügbar ; jedoch kann seine Gleichartigkeit mit AB-929 aus dem folgenden abgeleitet werden. Wenn man AB-929 mit einer veröffentlichten Beschreibung von Streptomyces verticillatus vergleicht (die von Pridham et al mit der nichtdifferenzierten Reihe der Gruppe Biverticillus durchgeführt wurde) findet man eine enge Verwandtschaft hinsichtlich wichtiger diagnostischer Eigenschaften. Dies würde die Möglichkeit der Gleichartigkeit der gemäss der Erfindung isolierten Substanz mit S. olivoverticillatus ausschliessen, da sich die letzte entschieden von S. verticillatus unterscheiden müsste, um ein wertvoller Stamm zu sein und damit notwendigerweise von AB-929 verschieden sein müsste.
Wenn S. verticillatus und S. olivoverticillatus synonym wären, würde der letztere Name unrechtmässig sein und die frühere zweinamige Bezeichnung Priorität besitzen, da der älteste rechtmässige Name Vorzug geniesst gemäss dem internationalen Nomenclatur-Codex für Bakterien und Viren. Im vorliegenden Fall wurde S. verticillatus 1938 benannt, während S. olivoverticillatus 1956 benannt wurde.
Die allgemeinen Fermentationsverfahren, nach denen die vorliegende Erfindung ausgeführt wird, sind wie folgt :
Allgemein.
Porfiromycin wird während der Fermentation von Streptomyces verticillatus gebildet, u. zw. durch die Stämme AB-929, AA-849 und AB-286aerob in einem geeigneten Nährmedium unter den im folgenden angegebenen Bedingungen. Das Nährmedium enthält eine assimilierbare Kohlenstoffquelle wie Stärke, Zucker, Melasse, Glycerin usw., eine assimilierende Stickstoffquelle, wieMaisquell-Flüssigkeitund anorganische Kationen wie Kalium, Natrium, Calcium usw. und Anionen wie Sulfat, Phosphat, Chlorid usw. Spurenelemente wie Bor, Molybdän, Kupfer usw. werden nach Bedarf in Form von Verunreinigungen durch die andern Bestandteile des Mediums zugegeben. Die Luftzuführung in Tanks und Gefässen wird vorgesehen, indem man sterile Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentationsmediums drückt.
Schüttelkolben-Fermentation.
Die Kultur von AB-929 erfolgt bei 28 C auf einem Hefe-Malz-Agarnährboden der folgenden Zusammensetzung :
EMI5.1
<tb>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 4 <SEP> g/l
<tb> Malzextrakt <SEP> 10 <SEP> g/l
<tb> Glucose <SEP> 4 <SEP> g/T.
<tb>
Agar <SEP> 20 <SEP> g/l
<tb>
Der PH wird mit Kaliumlauge auf 7,0 eingestellt. Die Überführung erfolgt direkt von den Nährmedien in das Inoculum-Medium, das die folgende Zusammensetzung besitzt :
EMI5.2
<tb>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 20 <SEP> g/l
<tb> Maisquell-Flüssigkeit <SEP> 5 <SEP> g/1
<tb> Glucose <SEP> 20 <SEP> g/1
<tb> CACAOS <SEP> 3 <SEP> g/1
<tb>
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100 ml des obigen Mediums werden in einen 500 ml Erlenmeyerkolben übergeführt, sterilisiert, inoculiert mit einem Sporenmycelauszug aus einem 1 Woche alten Agar-Medium und 48 h bei 280C auf einer hin-und hergehenden Schüttelvorrichtung (5, 0 cm = 2 inch Ausschlag, 104Cyclen/min) geschüttelt.
Die fertige Maische wird zur Inoculierung des Schüttelkolben-Fermentationsmediums verwendet, das die fol gende Zusammensetzung besitzt :
EMI6.1
<tb>
<tb> Maisguell-Flüssigkeit <SEP> 12. <SEP> 5 <SEP> g/1
<tb> Maisstärke <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g/1
<tb> (NH4) <SEP> 2S04 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g/1
<tb> Citronensäure <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g/1 <SEP>
<tb> (NHHPO <SEP> 2,0 <SEP> g/1
<tb> NaCl <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 1,5 <SEP> g/1
<tb> K2HPO4 <SEP> 0,5 <SEP> g/l
<tb> MgSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0,25 <SEP> g/s
<tb>
Der pH-Wert wird mit Natronlauge auf 7, 0 eingestellt. 50 ml dieses Mediums werden in einen 250 ml Erlenmeyerkolben übergeführt, sterilisiert, inoculiert und 4 Tage bei 28 C auf einer rotierenden Schüttel-
EMI6.2
: 24.bacterium Nr. 607.
Tank-Fermentationen.
Das Inoculum wird wie folgt hergestellt : Ein Agar-Medium der Kultur wird 1 Woche incubiert. Nach dieser Zeit'werden die Sporen und das Mycel in zwei 500 ml-Kolben übergeführt, die 100 ml des vorher beschriebenen Inoculum-Mediums enthalten. Die Kolben werden dann auf einem hin-und hergehenden
EMI6.3
Maische wird dazu verwendet, um einen Tank zu inculieren, der das oben erwähnte Fermentationsmedium enthält.
Die Temperatur zur Tankfermentation beträgt 20-35 C, zweckmässig 28 C. Die Belüftung erfolgt durch Zuführung von steriler Luft durch oder auf die Oberfläche der Maische (0, 2-2, 0, gewöhnlich 11 Luft
EMI6.4
in Schmalzöl zugegeben. Die Fermentationszeit variiert von 72 bis 140 h.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern.
Beispiel 1 : Fermentation der Kultur AB-929 (ATCC Nr. 13 495).
Vier 500 ml-Kolben mit Inoculum wurden wie bei der Inoculum-Herstellung beschrieben, bereitet.
Diese Inoculumkolben wurden zur Beimpfung von zwei 20 1-Gefässen angewendet, von denen jedes 12 l des Fermentationsmediums enthielt. Als Fermentationsmedium wurde das vorher beschriebene angewendet, wobei jedoch kein Ammoniumsulfat enthalten war. Vor der Inoculierung wurde das Medium auf bekannte Weise sterilisiert. Die Fermentationsbedingungen waren wie folgt :
Rühren Schnellrührer. Geschwindigkeit 400 Umdr/min
Belüftung 0, 8 l/min
Temperatur 26 - 28 C
Man liess die Fermentation 46, 5 h fortschreiten, dann wurden die Gefässe geerntet und die Brühe geprüft.
Beispiel 2 : "Tankfermentation von AB-929.
Zwei 500 ml-Kolben, von denen jeder 100 ml des Mediums enthielt, und ein 9 1-Gefäss, das 6 l des Mediums enthielt, wurden inoculiert und wie bei der vorher beschriebenen Inoculum-Herstellung präpa-
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riert. Dieses Inoculum wurde angewendet, um einen 757 l (200 Gallon) Tank, der 500 l des Fermentationsmediums enthielt, zu besamen. Das Tankmedium wurde 60 min bei 1200C vor der Inoculierung sterilisiert.
Die Fermentationsbedingungen waren wie folgt :
EMI7.1
<tb>
<tb> Temperatur <SEP> 28 C
<tb> Belüftung <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> Luft/l <SEP> Maische/min <SEP>
<tb> Rühren <SEP> Schnellrührer, <SEP> Geschwindigkeit <SEP> 130 <SEP> Umdr/min <SEP>
<tb> Antischaummittel <SEP> Hodag-Öl
<tb>
Der ursprüngliche pH der Fermentationsbrühe betrug 7, 0 und man liess die Fermentation 73 1/2h fortschreiten. Dann wurde die Maische geerntet. Die Erntemaische, pH 6, 4 wurde biologisch geprüft gegen B. subtilis bei PH 6. 0. wobei die Ausbeute 4,5 mglml betrug, und gegen Streptococcus haemolyticus, wobei die Ausbeute 2,2 mg/ml betrug und der ChloromycetinAktivität äquivalent war.
Beispiel 3 : Isolierung eines gereinigten Porfiromycinpräparates.
1500 l belüfteter Maische werden beim PH 7 unter Zugabe von 36 kg Diatomeen-Erde filtriert. Die 1200 l Filtrate werden nach einem Gegenstromverfahren in einem Luweste-Extraktor mit 1000 l Äthylacetat ausgezogen und der Extrakt wird auf 300 ml eingeengt. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat auf 500 ml mit Äthylacetat aufgefüllt. 250 ml dieser Lösung werden zu einem schweren Syrup eingeengt, 600 g Seesand und 120 g Diatomeen-Erde zugegeben und die Mischung wird fünfmal mit 700 ml Wasser bei PH 5 extrahiert. Die wässerige Phase wird auf PH 6, 5 eingestellt und lipoide Substanzen werden mit Hexan extrahiert (zweimal mit 1/5 des Volumens). Die wässerige Phase wird dann dreimal mit einem halben Volumen Äthylacetat extrahiert.
Der Äthylacetat-Extrakt wird im Vakuum bei 30 C fast gänzlich zur Trockne eingeengt und dann mit Wasser extrahiert. Der wässerige Extrakt wird lyophilisiert (16,5 g) und ein Viertel auf die erste Verteilungschrom atographiersäule gegeben.
Beispiel 4 : Isolierung und Charakterisierung von Porfiromycin in kristalliner Form.
5, 5 g des gemäss Beispiel 3 hergestellten Materials wurden auf einer Celitsäule (900 g) unter Entwicklung mit Hilfe eines Lösungsmittelsystems aus Benzol, Methanol und Phosphatpuffer (UH 5) im Volumenverhältnis 20:1:1 chromatographiert.Die erhaltene purpur-blaue Bande wurde bei 35 C unterVakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 21 ml der unteren Phase eines Systems aus Benzol, Äthylacetat, Methanol, wässeriger Phosphatpuffer PH 6 (8 : 2 : 1 : 1 Vol. ) gelöst und sorgfältig mit 30 g Kieselsäure vermischt. Diese Mischung wurde auf einer Kieselsäure-Säule (150 g) mit der oberen Phase des obigen Lösungsmittelsystems fraktioniert. Die erhaltene purpurfarbene Bande wurde zur Trockne eingedampft und in Äthylacetat gelöst. Nach Zugabe von Skellysolve B wurden dunkelblaue Nadeln (480 mg) erhalten.
Nach dem Umkristallisieren aus Äthylacetat-Petroläther besass das kristalline Porfiromycin (410 mg) auf einer heissen Stufe einen F = 202-204 C.
EMI7.2
H 5, 90
O 22. 56
N 16, 05
Asche keine Das durch X-Strahlen-Diffraktion bestimmte Molekulargewicht war 351 : 10.
EMI7.3
Ultraviolettes und sichtbares Spektrum in absolutem Methanol :
1%
EMI7.4
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EMI8.1
EMI8.2
<tb>
<tb> max <SEP> : <SEP> 215 <SEP> (Elcm <SEP> = <SEP> 660)Jl
<tb> #max <SEP> :
<SEP> 2,91 <SEP> 3,00 <SEP> 3,41 <SEP> 5,76
<tb> 5, <SEP> 83 <SEP> 6, <SEP> 04 <SEP> 6, <SEP> 18 <SEP> 6,33
<tb> 6. <SEP> 88 <SEP> 7, <SEP> 39 <SEP> 7, <SEP> 50 <SEP> 8, <SEP> 20 <SEP>
<tb> 8, <SEP> 56 <SEP> 8,74 <SEP> 9, <SEP> 02 <SEP> 9, <SEP> 31 <SEP>
<tb> 9, <SEP> 30 <SEP> 9, <SEP> 66 <SEP> 10. <SEP> 20 <SEP> 10, <SEP> 41 <SEP>
<tb> 10, <SEP> 85 <SEP> 11, <SEP> 72 <SEP> 12, <SEP> 35 <SEP> 12, <SEP> 70
<tb> 13, <SEP> 09 <SEP> 13, <SEP> 89 <SEP> 14, <SEP> 38
<tb>
Das in den obigen Beispielen hergestellte Porfiromycin lässt sich weiters wie folgt charakterisieren :
Elektrophoretische Beweglichkeit.
Von einer wässerigen Lösung von Porfiromycin wurden Flecken auf Papier verteilt, das mit 0, 1 m Phosphatpuffer von pH 6, 0 getränkt war. Der Streifen wurde dann 16 h einem elektrischen Feld von 7, 2 Volt/cm ausgesetzt. Nach dem Trocknen wurde er auf Agarplatten bei PH 6, die mit B. subtilisinoculiert waren bioautographiert. Die erhaltene Zone besass eine elektrophoretische Beweglichkeit von - 1, 39 X 10-5.
Antibakterielles Aktivitäts-Spektrum.
In der folgenden Tabelle 3 ist das in vitro-Spektrum der antibakteriellen Aktivität gezeigt. Einfachheitshalber sind die Organismen in der Tabelle durch Zahlen angegeben worden. Die Aktivitätswerte entsprechen der Breite (in mm) der Inhibitionszonen im Agar-Diffusionstest.
EMI8.3
EMI8.4
<tb>
<tb> l <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 5* <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 7* <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11
<tb> 3,0 <SEP> 6,0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10,9 <SEP> 14,9 <SEP> 4,0 <SEP> > 19,0 <SEP> > 15,0 <SEP> 6,0 <SEP> gering <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20
<tb> 12,0 <SEP> 7,5 <SEP> 11,3 <SEP> 6,0 <SEP> 0 <SEP> 5,0 <SEP> 10,1 <SEP> gering <SEP> l <SEP> 0 <SEP>
<tb>
* bei pH 6 Nr. Organismus
1. Bacillus cereus
2. Klebsiella pneumoniae (Friedlanders)
3. Alcaligenes sp. ATCC 10153
4.
Hormodendrum cladosporoides
5. Bacillus subtilis (Mutterstamm von Stamm 6)
6. Bacillus subtilis (Resistent gemacht gegen Streptothricin)
7. Mycobacterium Nr. 60 7
8. Micrococcus pyogenes var. albus (resistent gegen die Tetracycline)
9. Klebsiella pneumoniae 10. Escherichia coli (Mutterstamm von Stamm 11) 11. Escherichia coli (Resistent gegen Chloramphenicol) 12. Streptococcus pyogenes haemolyticus NY-5
EMI8.5
14. Cornynebacterium xerose NRRL B 1397 15. Erwinia amylovora 16. Salmonella gallinarum Nr. 605 17. Basteurella multocida Typ I, Stamm 310
EMI8.6
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Papierchromatographische Rf-Werte.
Die folgende Tabelle zeigt die Rf-Werte in einer Reihe von chromatographischen Systemen. Zur Bioautographie wurde als Organismus B. subtilis angewendet.
Tabelle 4
EMI9.1
<tb>
<tb> System <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP>
<tb> Rf's <SEP> von <SEP> Porfiromycin <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 3
<tb>
EMI9.2
System l : Benzol, Methanol, Wasser (1 : 1 : 2 Vol) System 2 : Benzol, Isoamylalkohol, Wasser (4 : 1 : 2 Vol.) System 3 : 1,2-Dichloräthan, Tetrachlorkohlenstoff, Essigsäure, Wasser (4 : 4 : 1 : 2 Vol.) Porfiromycin ist von andern rot-purpur-blauen Antibiotica in Tabelle 5 unterscheidbar.
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Tabelle 5
EMI10.1
EMI10.2
<tb>
<tb> Antibioticum <SEP> UVmax <SEP> m <SEP> F <SEP> M. <SEP> G. <SEP> Indikator <SEP> Bemerkungen
<tb> Actionflocin <SEP> 230,270
<tb> Actinomycine <SEP> "'1000 <SEP> Chromopeptide
<tb> Actinorhodin <SEP> 285,523, <SEP> 531,571 <SEP> 2700C <SEP> 575 <SEP> ja <SEP> enthält <SEP> keinen <SEP> N
<tb> Bostrycoidin <SEP> 251,320 <SEP> 243-244 C <SEP> 342 <SEP> unlöslich <SEP> in <SEP> HO
<tb> Coelicolorin <SEP> 142-146 C <SEP> ja <SEP> wasser-unlöslich <SEP> unter <SEP> pH <SEP> 8, <SEP> grün <SEP> bei <SEP> PH <SEP> 8
<tb> Cyanomycin <SEP> 240, <SEP> 278,384 <SEP> 128 C <SEP> 250 <SEP> ja <SEP> C <SEP> H <SEP> N <SEP> O
<tb> (O. <SEP> IN <SEP> HCl)
<tb> Isothodomycin <SEP> 240, <SEP> 310, <SEP> 551, <SEP> 563, <SEP> 610 <SEP> 220 C <SEP> 460 <SEP> C20-21H29-32O8N.
<SEP> HCl
<tb> Iodinin <SEP> 2630C <SEP> nein <SEP> unlöslich <SEP> in <SEP> Alkohol <SEP> und <SEP> H. <SEP> O. <SEP> Durch <SEP> das
<tb> Bakterium <SEP> wurde <SEP> eine <SEP> Säure <SEP> produziert
<tb> Javanicin <SEP> 303, <SEP> 505 <SEP> in <SEP> Äthanol <SEP> ja <SEP> kein <SEP> N: <SEP> gebildet <SEP> durch <SEP> einen <SEP> Pilz
<tb> Lactaroviolin <SEP> 242, <SEP> 314, <SEP> 398, <SEP> 527 <SEP> 53 C <SEP> kein <SEP> N <SEP> ; <SEP> gebildet <SEP> durch <SEP> einen <SEP> Pilz
<tb> in <SEP> Äthanol
<tb> Litmocidin <SEP> 144-1460C <SEP> ja <SEP> unlöslich <SEP> in <SEP> HO <SEP> ;
<SEP> inaktiv <SEP> gegen <SEP> Staph.
<tb> in <SEP> Mäusen
<tb> Mycothodin <SEP> 258, <SEP> 420, <SEP> 471 <SEP> 200-202 C <SEP> 635-698 <SEP> ja <SEP> 2% <SEP> N
<tb> Microcin <SEP> A <SEP> unlöslich <SEP> in <SEP> H20
<tb> Mitomycin <SEP> A <SEP> 215,318, <SEP> 530 <SEP> 159-161 C <SEP> ja <SEP> papierchromatographisch <SEP> abgetrennt
<tb> IR <SEP> E1%
<tb> 1cm
<tb>
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Tabelle 5 (Fortsetzung)
EMI11.1
<tb>
<tb> Antibioticum <SEP> UVmaxm <SEP> F <SEP> M.G.
<SEP> Indikator <SEP> Bemerkungen
<tb> Mitomycin <SEP> B <SEP> 298, <SEP> 320, <SEP> 550 <SEP> 182-184 C <SEP> ja <SEP> papierchromatographisch <SEP> abgetrennt
<tb> IR <SEP> E1cm1%
<tb> Mitomycin <SEP> C <SEP> 216, <SEP> 360, <SEP> 560 <SEP> > 360 C <SEP> 1120 <SEP> ja <SEP> papierchromatographisch <SEP> abgetrennt
<tb> E1%
<tb> lcm
<tb> Pluramycin <SEP> B <SEP> unlöslich <SEP> in <SEP> HO
<tb> Prodigiosin <SEP> 225,288, <SEP> 337, <SEP> 471, <SEP> 539 <SEP> 70-80 C <SEP> 390 <SEP> ja <SEP> unlöslich <SEP> in <SEP> H20
<tb> Äthanol <SEP> pH <SEP> 7, <SEP> 4 <SEP> C2oH2! <SEP> sN3 <SEP>
<tb> Pyocyanine <SEP> 1300C <SEP> unlöslich <SEP> in <SEP> Benzol;
<SEP> C13H10N2.Durch <SEP> ein
<tb> (zers. <SEP> ) <SEP> Bakterium <SEP> gebildet
<tb> Ractinomycin <SEP> 245, <SEP> 40-450 <SEP> kein <SEP> 692 <SEP> C33H30N3O14
<tb> Rhodocidin <SEP> 515 <SEP> unterschieden <SEP> durch <SEP> Verteilungskoeffizienten
<tb> Rhodomycetin <SEP> 235,520, <SEP> 540,580 <SEP> > 300 C <SEP> ja <SEP> inaktiv <SEP> gegen <SEP> Staph <SEP> in <SEP> Mäusen <SEP> ; <SEP> unlöslich <SEP>
<tb> in <SEP> H20 <SEP>
<tb> Rhodomycine <SEP> A <SEP> : <SEP> 498,532, <SEP> 566 <SEP> A: <SEP> 193 C <SEP> 420 <SEP> ja <SEP> papierchromatographisch <SEP> abgetrennt
<tb> B <SEP> : <SEP> 496,530 <SEP> B: <SEP> 193 C
<tb> Rubidin <SEP> 500,530 <SEP> (HCl) <SEP> ja <SEP> kein <SEP> N, <SEP> stabil <SEP> in <SEP> Säure
<tb> 400,520 <SEP> (NaOH)
<tb> Rubromycin <SEP> 546,584 <SEP> (NaOH) <SEP> 2150C <SEP> unlöslich <SEP> in <SEP> H2O;
<SEP> kein <SEP> N
<tb> 518, <SEP> 520 <SEP> (N <SEP> ; <SEP> SO4) <SEP> (zers. <SEP> )
<tb> Spinulosin <SEP> 201-203 C <SEP> 184 <SEP> ja <SEP> keine <SEP> optische <SEP> Drehung <SEP> ; <SEP> kein <SEP> N <SEP> ; <SEP> gebildet
<tb> durch <SEP> Pilz <SEP> ; <SEP> unlöslich <SEP> in <SEP> kaltem <SEP> Wasser
<tb>
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Das Verfahren der vorhergehenden Beispiele wurde unter Verwendung der Organismen ATCC-Nr.
13538 (AA-849) und ATCC-Nr. 13539 (AB-286) wiederholt, wobei das gleiche Produkt, Porfiromycin, erhalten wurde.
Die Erfindung ist nicht auf die drei beschriebenen identischen Kulturen beschränkt, sondern schliesst auch Varianten und Mutanten ein, die auf verschiedene Weise von den beschriebenen Organismen gebildet werden, wofür Strahlung oder chemische Behandlung typisch sind. In der Beschreibung und in den Ansprüchen schliessen deshalb die aufgezählten Kulturen Mutanten ein, die die beschriebenen Antibiotica bilden.
EMI12.1
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Porfiromycin, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Porfiromycin erzeugenden Stamm von Streptomyces verticillatus, wie den Stamm ATCC-Nr. 13495, Nr. 13 538 oder Nr. 13 539 bzw. deren Mutanten oder Varianten einer aeroben Fermentation in einem üblichen Nährmedium unterwirft.