DE2233555C3

DE2233555C3 - Verfahren zur Herstellung von Spectinomycin

Info

Publication number: DE2233555C3
Application number: DE2233555A
Authority: DE
Inventors: Isao Kawamoto; Masaru Kumakawa; Takashi Tokio Nara; Ryo Okachi; Seiji Sato; Seigo Kawasaki Takasawa; Mitsuyoshi Yamamoto
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1971-07-09
Filing date: 1972-07-07
Publication date: 1974-01-24
Also published as: CH549639A; DE2233555B2; FR2145504B1; FR2145504A1; BE786019A; AR193110A1; DE2233555A1; ES404603A1; CA983872A; GB1346278A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Spectinomycin durch Fermentation in technischem Maßstab.

Spectinomycin ist ein Antibiotikum, das von Oliver et al und Mason et al 1961 unabhängig voneinander entdeckt wurde, wie in »Antimicrobial Agent and Chemotherapy« (1961), 495,503,507,516 und 520, und »Antibiotics and Chemotherapy« (1961), 11, 118, 123, 127 und 661, berichtet Aus diesen Veröffentlichungen ist bekannt, daß das Antibiotikum durch Streptomyces fiavopersicus oder Streptomyces spectabilis erzeugt wird.

Spectinomycin, das auch als Actinospectacin bekannt ist, ist ein wasserlösliches basisches Antibiotikum der folgenden Strukturformel:

ist. Es ist auch bekannt, daß dieses Antibio-ES Wachstum verschiedener T.ere begünstigt, wena man es dem Futter zusetzt, und geringe Gifttg-Ξ nd ein breites antibakterielles Spektrum hat.

Außerdem ist Spectinomycin für die Undwrttchaft von Bedeutung. Beispielsweise wurde bei Tests im Freien gefunden, daß 5 bis 10 ppm Spectinomyc.n gegen ßfrnenbrand, der durch Bakterien des Genus lan homonas hervorgerufen wird, ™*⁵«<^

die wirksame Menge an Streptomycm bei der gleichen Erkrankung 100 ppm beträgt, hat Spectinomycin die zetabSanzigfaSheanübakterielleWirkung.Außer-

dem ist Siomycin in 5 bis 10 ppm wirksam gegen

Rost bei Orangen, der durch Xanthomonas citn her-

vorgem erw?rd, oder gegen bakteriellen Blattbrand

von Spflanzen, der durch Xanthomonas oryzae

Sege^ndtr Erfindung ist ein Wahren zur Herstellung von Spectinomycin durch Zuchten eines

Stammes von StreVtomyces in einem Nahrmedmm, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Stamm Streptomyces hygroscopicus var. sagamiensis ATCC 21703 verwendet. Der Stamm Streptomyces hygVo_Scopicu7var s^e _agamiensis ATCC ?.l 703 kann leicht

Z₅ dne verhältnismäßig große Menge an Spcctmomgui in einem Nährmedium ansammeln, ohne daß dieses durch als Nebenprodukt gebUdete Antibiotika verunrein gt ist. Die Züchtung dieses Mikroorganismus .st also ein sehr vorteilhaftes Verfahren zur Erzeugung von Spectinomycin in technischem Maßstab.

Er ist durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet:

I. Morphologie

Das allgemeine Wachstum ist gelblich-braun mit gräulich-weißem Luftmycel. Das Luftmycel ist zunächst weiß und wird dann gräulich und wird manchmal feucht und weiterhin schwarz. Das Luftmycel ist einfach verzweigt und hat in den meisten Fällen mehr als 10 Sporen an dem Spiralen bildenden Extrempurikt. Die Sporenoberfläche ist warzig.

Es ist bekannt, daß dieses Antibiotikum ein breites «· Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien Wirkungsspektrum gegen gram-positive und gram- Die Kultureigenschaften auf acht Medien nach

negative Bakterien hat und gegen verschiedene durch 45 Züchtung bei 30⁰C für 2 Wochen sind in Tabelle 1 zudiese phlogogenen Bakterien verursachte Infektionen sammengestellt:

Tabelle

Medium	Wachstum	Substratmycel	Bildung von Luftmycel	Luftmycel	Lösliche Pigmente
Rohrzucker-nitrat-agar	schlecht	farblos	gut	weiß(a) grau (5 ih)	keine
Glucose-asparagin-agar	schlecht	farblos	mäßig	weiß (a) grau (5fe)	keine
Glucose-nähr-agar	mäßig	gelblich-braun S: (2ie) R: (2 ie)	gut	weiß(a)	keine
Hafermehl-agar	schlecht	farblos	mäßig	grau (10 fe) (3nl)	keine
Stärke-agar	mäßig	gelblich-grün-braun S: (2bc) R:(2gc)·	gut	weiß (a) grau (5ih)

3	Medium	Wachstum	2 233 555	6	4	Lufimjcel	Lösliche Pigmente
	Tyrosin-agar	schlecht	Fortsetzung			grau (b)	keine
Hefemalz-agar	mäßig	Substraimicel	Bildung van Luftm>cel	grau (5ih) (3ba)	keine
Glycerin-asparagin-agar	mäßig	farblos	schlecht	weiß (a) grau (5fe)	keine
	gelblich-braun S: i2gc) R: (2gc)	gut
	gelblich-braun S: (2ec)· R: (2ec)	gut

In Tabelle 1 entsprechen die Angaben in Klammern der Farbklassifikation von Color Harmony Manual (Container Corporation of America) und

S: Farbe der Oberfläche des Substratmycels,

R: Farbe der anderen Seite des Substratmycels.

III. Physiologische Eigenschaften

Wachstumstemperaturbereich 25 bis 45⁰C

Verflüssigung von
Gelatine pcätiv

Hydrolyse von Stärke.. positiv

Wirkung auf entfettete

Milch keine Koagulierung wird

bemerkt, jedoch wird Peptoni&ierung bemerkt.

Bildung vcn melanhi-

artigem Pigmsnt kei ι Pigment wird auf

Tyrosin-agar- und Trypton-hefeextrakt-agar erzeugt, jedoch erscheint ein leicht braunes Pigment auf Pepton - hefeextrakteisenagar. Diesen Fest-Stellungen entsprechend ist es als nicht chromogen anzusehen.

IV. Assimilierbarkeit von Kohlenstoffquellen

Die Assimilierbarkeit von Kohlenstoffquellen durch den vorliegenden Stamm ist in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

	Assimilier	Kohlenstoff-	Assimilier
KohlenstofTquelle	barkeit	quelle	barkeil
D-Araginose ..		Raffinose
D-Xylose		Mannit	+ +
Glucose	+ +	Glycerin	4- +
D-Fructose ...	+ +	Salicin	+
Sucrose		Lactose	±
Inosit	_	Mannose	+ +
L-Rhamnose ..

Aus dem obigen ergibt sich, daß der vorliegende Stamm Streptomyces hygroscopicus var. sagamiensis ATCC 21 703 die Eigenschaften von Streptomyces hygroscopicus besitzt. Das heißt, er ist ein spiralige Sporophoren bildendes Actinomycetes und ist nicht dromogen. Auch ist die Oberfläche der Sporen warzig, und die Farbe des Luftmycels verändert sich von weiß bis schwärzlich-grau unter Feuchtwerden. Bekanntlich umfaßt Streptomyces hygroscopicus einen weiten Bereich von Stämmen, und von vielen Antibiotika erzeugenden Stämmen wird berichtet, daß sie zu Streptomyces hygroscopicus gehören. Beispielsweise ist bekannt, daß solche Stämme die folgenden Antibiotika erzeugen: Carbomycin, Hygromycin, Hygromycin-B, Hygroscopin-A, -B und -C, Hygrostatin, Relomycin, Tylosin, A-10598, K₁₃, K₂₁, K₂₈, NP-522, Glebomycin, Ängustomycin-A und -C, Azalomycin-B und -F, Copiamycin, Psicofuranin, Decoyinin, Antiprotozoin, Ossamycin, AM-684, Dianemycin, Streptothricin, Leucocidin, Polyethenn-A, Duamycin, 1651 i-RP, usw. (index of Antibiotics from Actinomycetes, H. U m ezawa, P.936, 1967, University of Tokyo Press, Tokyo & University Park Press, State College, Pennsylvania, and Identification Keys for Antibiotics producing Streptomyces, Nr. 2, Antibacterial Antibiotics Producers, T. A r a i, Y. M i k a m i, J. K ο i k e, p. 83, p. 84, Study Group of Actinomycetes.) Der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Stamm erzeugt jedoch ein Antibiotikum, das sich von jedem dieser Antibiotika unterscheidet, d. h. Spectinomycin, und ist insofern von den bekannten Säuren verschieden.

Die Unterschiede des vorliegenden Stammes Streptomyces hygroscopicus var. sagamiensis ATCC 21 703 gegenüber Streptomyces flavopersicus und Streptomyces spectabilis sind in Tabeille 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

	Stamm	Slreptomyces	Streptomyces
	Streptomyces	flavopersicus	spectabilis
	hygroscopi
	cus vir
	Fagamiensis	wirtelige	einfache
	ATCC 21703	Verzwei	Verzwei
Form der	einfache	gung	gung keine
Sporophoren	Verzwei	Spiralen-	Spiralenbil
	gung	bildung	dung gerade
	Spiralen		Sporo
	bildung		phoren
		rötlich	rosa-orange-
			farben
Farbe des Luft	gräulich
mycels bei
Züchtung auf
verschiedenen
Medien von
Tabelle 1

Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, gehört der gemiiß der Erfindung verwendete Stamm einer Species an, die von denjenigen der bekannten Spectinomycin erzeugenden Stämme verschieden ist. Außerdem untericheidet sich dieser Stamm, wie oben beschrieben, von Streptomyces hygroscopicus insofern, als sein Produkt Spectinomycin ist. Der vorliegende Stamm wurde daher Streptomyces hygroscopicus var. sagamiensis ATCC 21 703 bezeichnet.

Jede der üblicnen Methoden zur Züchtung von Actinomycetes kann in dem Verfahren gemiiß der Erfindung verwendet werden, und jedes übliche Medium kann verwendet werden, sofern es eine geeignete Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen sowie geringe Mengen an weiteren Nährstoffen, die für den speziellen Mikroorganismus erforderlich sind, enthält. Beispiele Tür Kohlenstoffquellen sind: Glucose, Stärke, Glycerin, Mannose, Fructose, Inosit, Mannit, Rohrzucker, Melasse und η-Paraffine allein oder in Kombination. Als anorganische Stickstoffquellen können verwendet werden: Ammoniumchlorid, Ammomumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, und als natürliche Stickstoffquelle Pepton, Fleischextrakt, riefeextrakt, Trokkenhefe, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenpulver und Casaminosäure, allein oder in Kombination. Außerdem können dem Medium erforderlichenfalls anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und -phosphat, zugesetzt werden. Vorzugsweise wird der Mikroorganismus zunächst in wenigstens einer Impfkultur gezüchtet, bevor das Hauptfermentationsmedium damit beimpft wird. Das Impfmedium wird bis zu einer geeigneten Population des Organismus bebrütet (typischerweise etwa 48 Stunden) und dann verwendet, um entweder ein zweites Impfmedium oder das Hauptfermentationsmedium zu beimpfen.

Die Kultivierung in einer Flüssigkeit, insbesondere unter der Oberfläche unter Rühren, hat sich als am geeignetsten erwiesen. Die Züchtungstemperatur ist 20 bis 40⁰C und liegt vorzugsweise in dem Bereich von 25 bis 30^c C. Die Kultivierung erfolgt zweckmäßig bei etwa neutralem pH. Unter den ewigen Bedingungen wird Spectinomycin gebildet und sammelt sich nach etwa 2 bis 7 Tagen in der Kulturflüssigkeit an. Wenn die Menge an Spectinomycin in dem Kulturmedium ein Maximum erreicht, wird die Züchtung unterbrochen, und das Antibiotikum wird von dem Kulturmedium isoliert und gereinigt, nachdem die Mikroorganismen, beispielsweise durch Filtrieren, abgetrennt sind.

Nachdem die Mikrobenzellen von dem Kulturmedium abgetrennt sind, erfolgen Isolierung ur.l Reinigung des Antibiotikums nach gewöhnlich für die Reinigung wasserlöslicher basischer Antibiotika angewandten Methoden. Beispielsweise können Adsorption und Desorption von einem Kationenaustauscherharz, Adsorption und Desorption von pulvriger Aktivkohle, Cellulosesäulenchromatographie, Adsorption und Desorption von einer Säule aus vernetzten! Dextrangel angewandt werden. Da außerdem Spectinomycin unlöslich in fast allen organischen Lösungsmitteln, jedoch löslich in Wasser und Methanol ist, kann es durch geeignete Lösungsmittel-Kombination gelöst und gefällt werden.

Vorzugsweise wird das Filtrat des Kulturmediums zunächst auf ein pH von 6,8 eingestellt und dann einer Adsorption an einer Säule eines Kationenaustauscherharzes in der H ⁺ -Form unterworfen. Nach Waschen mit Wasser erfolgt die Eluierung mit 0,5n-HCI. Die aktive Fraktion wird mit einem Anionenaustnuscherharz in der OH"-Form neutralisiert und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird mit einem porösen Entfärbungsharz entfärbt und dann unter vermindertem Druck bis zu einer Paste eingeengt. Das Konzentrat wird in Methanol gelöst und einer Adsorption an einer Säule aus ver-

,0 netztem Dextrangel unterworfen und dann mit Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt, und das erhaltene Konzentrat wird bei niedriger Temperatur stehengelassen, wobei kristallines Spectinomycin ausfallt. Durch wiederholtes Um-

kristallisieren aus Wasser oder Methanol kann reines Spectinomycin erhalten werden.

Das antibakterielle Spektrum des gemäß der Erfindung erhaltenen Spectinomycins wird durch Tabelle veranschaulicht:

Tabelle 4

Mindesthemmkonzentration bei Agarverdünnungsmethode, μg/ml

Geprüfte Mikroorganismen

Streptococcus faecalis ATCC 10 541 Staphylococcus aureus ATCC 6538 P Staphylococcus aureus KY 8942 (resistent gegen Kanamycin, Paromomycin und Streptomycin).... Staphylococcus aureus KY 8953 (resistent gegen Kanamycin, Paromomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Erythromycin, Penicillin G, Sulfonamid und Neomycin) .... Staphylococcus aureus KY 8957 (resistent gegen Paromomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Penicillin G und Sulfonamid)

Bacillus subtilis Nr. 10 707

Bacillus cereus ATCC 9634

Bacillus mycoides ATCC 9463

KlebsieHa pneumoniaeATCC 10031 Escherichia coli ATCC 26

EscherichiacoliK-12ML1629(ECR₅) (resistent gegen Chloramphenicol, Kanamycin, Tetracyclin und Neomycin)

Escherichia coli ECR₃
(resident gegen Streptomycin, Kanamycin, Neomycin, Paromomycin, Spectinomycin, Tetracyclin und Chloramphenicol)

Escherichia coli ML 1878 (ECR₈)

(resisfent gegen Streptomycin)... Escherichia coli ML 3306 (ECR₉) (resistent gegen Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin und Neomycin)

Mindesthemmkonzentration. μΒ ml

42 6,6

13,0

>1760

6,6 6,6 13,0 6,6 2,6 6,6

104,0

> 166,0

3,2

Fortsetzung	Mindesthemm- konzentration.
Geprüfte Mikroorganismen	42
Pseudomonas aeruginosa BMH Nr. !	20 20 2,6
Proteus vulgaris ATCC 6897 Shigella sonnei ATCC 9290 Salmonella typhosa ATCC 9992 ...

Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung.

Beispiel

In diesem Beispiel werden 30 ml eines ersten Mediums, das 2% Glucose, 2% entfettetes Sojabohnenpulver und 0,1% CaCO₃ (pH 7,2 vor der Sterilisierung) in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben mit einer sehr kleinen Menge voll Streptomyces hygroscopicus var. sagamiensis ATCC 21 703 beimpft. Die Bebrütung erfolgt unter Schütteln bei 30⁰C für 28 Stunden. 300 ml eines zweiten Mediums in einem 2-1-Erlenmeyer-Kolben mit Prallkörpern werden dann mit 30 ml der so erhaltenen Kultur beimpft. Die Zusammensetzung des zweiten Mediums ist gleich der des ersten. Das zweite Impfmedium wird ebenfalls unter Schütteln bei 3O⁰C 48 Stunden bebrütet. Dann werden 18 1 Hauptfermentationsmedium in einem 30-1-Glasbehälter mit 900 ml (entsprechend dem Inhalt von drei 2-1-Kolben) der zweiten Impfkultur beimpft. Die Zusammensetzung des Hauptfermentationsmediums ist gleich der des ersten Mediums. Die Bebrütung in dem Glasbehälter erfolgt bei 3O⁰C für 72 Stunden unter Belüften und Rühren (350 Upm, Belüftung 18 l/min).

12 1 eines Filtrats, das durch Abtrennen der Mikrobenzellen von der Fermentationsbrühe mittels einer Filterpresse erhalten ist, werden mit Salzsäure auf ein pH von 6,8 eingestellt. Dann wird das Filtrat durch eine Säure von 800 ml Katiionenaustauscherharz in der H⁺-Form geführt. Nach Waschen mit 3 1 Wasser erfolgt die Eluierung mit O.,5n-HCl bei einer Strömungsgeschwindigkeit von SV 1 (SV bedeutet die Durchsatzgeschwindigkeit, d. h. den Wert, der durch

ίο Dividieren des je Stunde zu behandelnden Flüssigkeitsvolumens durch das Volumen Harz in der Säule erhalten wird), wodurch Spectinomycin eluiert wird. Etwa 500 ml der aktiven Fraktion werden dann mit etwa 50 ml Anionenaustauscherharz in der OH ~ -Form neutralisiert und dann unter vermindertem Druck eingeengt. 30 ml des Konzentrats werden durch eine Säule mit einem porösen Entfärbungsharz geführt, und die durch Eluieren mit Wasser erhaltene aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck zu einer Paste eingeengt. Die so erhaltene Paste wird dann in Methanol gelöst, und die methanolische Lösung wird durch eine Säule von 100 ml vernetzten! Dextrangel geführt. Die Eluierung erfolgt mit Methanol. Das erhaltene Eluat wird unter vermindertem Druck einge-

engt, und das Konzentrat wird bei niedriger Temperatur stetKDgelassen, wobei 13,5 g Kristalle ausfallen. Durch wiederholtes Umkristallisieren aus Wasser oder Methanol kann dann eine reine weiße kristalline Substanz erhalten werden.

Elementaranalyse, Molekulargewicht, Schmelzpunkt, Ultraviolett- und Infrarotabsorptionsspektren, Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln, spezifische Drehung und verschiedene Chromatographien der so erhaltenen Substanz sind identisch mit denjenigen von Spectinomycin, wie es in den obenerwähnten Veröffentlichungen von Oliver et al und Mason et al beschrieben ist, d. h., diese Substanz ist als Spectinomycin identifiziert.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Spectinomycin durch Züchten eines Stammes von Streptomyccs in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptomyces hygroscopicus var. sagaraiensis ATCC 21 703 verwendet.