AT285817B - Verfahren zur Herstellung eines neuen antibiotischen Komplexes - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung eines neuen antibiotischen Komplexes 
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen antibiotischen Komplexes Axenomycin, der   auch FJ.   2604 genannt wird und aus den Substanzen Axenomycin A, genannt F. I. 2604 A, und Axenomycin B, genannt F. 1. 2604 B, besteht, und seiner Salze mittels Kulturen des Streptomyces lisandri   n.   sp. Die neuen antibiotischen Substanzen Axenomycin A und Axenomycin B zeigen eine ausgeprägte pharmakologische Aktivität und sind in der Therapie insbesondere als Produkte mit wurmhemmender Aktivität und Aktivität gegen Protozoen und Pilze verwendbar. 



   Der neue Stamm Streptomyces lisandri   n.   sp., auch Streptomyces F. L 2604 genannt (Nummer der Stämmesammlung der   Società   Farmaceutici Italia), der den neuen antibiotischen Komplex erzeugt, wurde aus einer in der Nähe von Lisandro   Olmes   (Argentinien) entnommenen Bodenprobe isoliert. Er wurde beim pflanzenpathologischen Institut der Universität Mailand mit der Indexnummer I. P. V. 1951, beim Institute of Microbiology of the Rutger University (U. S. A.) mit der Indexnummer L M. R.

   U. 3935 und beim Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew, Surrey (England) mit der Nummer   I.   M.   I.   137718 hinterlegt und weist folgende Eigenschaften auf :
Mikroskopische Eigenschaften :
Auf den üblichen Kulturböden besteht das vegetative Mycel aus Hyphen, die mehr oder weniger dünn sind und eine Dicke von 0, 5 bis   0,     9   aufweisen, lang und reichlich verzweigt sind und lange und gerade Conidiophoren mit einer Dicke von 1, 1 bis   1,3 11 bilden.   Von diesen werden monopodial Hyphen abgezweigt, die Sporen von normaler Länge bilden, welche in ihrem distalen Bereich dicht spiralförmig ausgebildet sind.

   Diese Hyphen können abwechselnd oder entgegengesetzt an Conidiophoren eingefügt sein, und bei Reife verwandeln sie sich in   Sporen- oder Conidienketten.   Diese letzteren haben eine ovale, glatte   Oberfläche. und   eine Grösse von 0, 9 bis 1, 2 und 1 bis 1, 4   u.   



   Makroskopische Eigenschaften :
In Tabelle I sind die Kultureigenschaften angegeben, die bei Kultivieren des Mikroorganismus auf verschiedenen Kulturböden erhalten wurden, wobei man den Mikroorganismus bei   280C   wachsen liess und die Beobachtungen am 3., 8., 15., 20 und 30. Tag nach der Animpfung durchführte. 



   Der Mikroorganismus zeigt im wesentlichen ein schnelles und reichliches Wachstum unter Bildung eines kompakten, festen vegetativen Mycels, das auf synthetischen Nährböden eine glatte Patina und auf organischen Nährböden eine leicht gefaltete Patina hat. 



   Auf den synthetischen Nährböden ist das vegetative Mycel farblos, während seine Rückseite verschiedenfarbige Tönungen annimmt, je nach dem Kulturnährboden, u. zw. von strohgelb bis dunkelgelb bis kastanienbraun, oder grau mit violetten, weinrosa oder dunkelgrünen Tönungen. 



   Auf den organischen Nährböden hat das vegetative Mycel eine honiggelbe Farbe, und seine Rückseite ist weniger wechselhaft, nämlich zitronengelb oder ockergelb und beim Altern mehr oder weniger kastanienbraun. 



   Das Luftmycel ist auf den synthetischen Nährböden reichlich und auf den organischen Nährböden ziemlich   spärlich.   

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   Auf den ersteren ist die Farbe überwiegend weiss, die auf einigen Nährböden weinrosa oder elfenbeinfarbige oder braun-hellgraue Tönungen annehmen kann. Auf den organischen Nährböden ist es rein weiss oder schmutzig weiss, manchmal mit braun-hellgrauen Tönungen. Das Aussehen ist je nach den Kulturnährböden wattig bis staubig. 



   Tabelle I 
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> Kultureigenschaften <SEP> von <SEP> Streptomyces <SEP> lisandri
<tb> Vegetatives <SEP> Lösliche
<tb> Medium <SEP> Wachstum <SEP> Luftmycel <SEP> Mycel <SEP> Pigmente
<tb> Bennet- <SEP> reichlich, <SEP> reichlich, <SEP> honigfarbig, <SEP> hellAgar <SEP> leicht <SEP> gefaltete <SEP> leicht <SEP> wattig, <SEP> Rückseite <SEP> teefarbig
<tb> 1) <SEP> Patina <SEP> weiss <SEP> mit <SEP> beigerosa <SEP> hellocker <SEP> bis
<tb> Tönungen <SEP> hellbraun
<tb> Czapeck- <SEP> spärlich <SEP> reichlich, <SEP> farblos, <SEP> Rück- <SEP> hellviolett,
<tb> Agar <SEP> ziemlich <SEP> wattig, <SEP> seite <SEP> zuerst <SEP> mit <SEP> bräunlichen
<tb> 1) <SEP> weiss <SEP> strohgelb, <SEP> dann <SEP> Tönungen
<tb> grau <SEP> violett, <SEP> 
<tb> mehr <SEP> oder
<tb> weniger <SEP> satt
<tb> Asparagin- <SEP> reichlich, <SEP> mässig, <SEP> ziemlich <SEP> farblos,

   <SEP> Rück- <SEP> hellweinrot
<tb> Glukose- <SEP> glatte <SEP> Patina <SEP> glatt, <SEP> weisslich <SEP> seite <SEP> zuerst
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> rosa <SEP> Tönungen <SEP> zitronengelb,
<tb> 1) <SEP> dann <SEP> weinrosa
<tb> Glycerin- <SEP> mässig, <SEP> sehr <SEP> reichlich, <SEP> farblos, <SEP> Rück- <SEP> abwesend <SEP> 
<tb> Glycin- <SEP> glatte <SEP> Patina <SEP> wattig, <SEP> weiss <SEP> mit <SEP> seite <SEP> strohgelb
<tb> Agar <SEP> einigen <SEP> beige <SEP> bis <SEP> ockerbraun
<tb> 1) <SEP> Tönungen <SEP> 
<tb> Emerson- <SEP> reichlich, <SEP> spärlich, <SEP> weisslich, <SEP> honigfarbig, <SEP> hellAgar <SEP> Patina <SEP> leicht <SEP> glatt <SEP> Rückseite <SEP> teefarbig
<tb> 1) <SEP> gefaltet <SEP> tiefocker
<tb> Stärke- <SEP> Agar <SEP> mässig, <SEP> sehr <SEP> reichlich, <SEP> farblos,

   <SEP> Rück- <SEP> zitronengelb <SEP> 
<tb> und <SEP> Salze <SEP> glatte <SEP> Patina <SEP> glatt, <SEP> braun-seite <SEP> hellgelb
<tb> 2) <SEP> hellbeige <SEP> bis <SEP> braun
<tb> bis <SEP> grau
<tb> Kartoffel- <SEP> reichlich, <SEP> mässig, <SEP> ziemlich <SEP> stroh-bis <SEP> teefarbig
<tb> Agar <SEP> leicht <SEP> gefaltete <SEP> glatt, <SEP> weisslich <SEP> zitronengelb,
<tb> 4) <SEP> Patina <SEP> mit <SEP> beigebräun- <SEP> Rückseite <SEP> dann
<tb> lichen <SEP> Tönungen <SEP> kastanienbraun
<tb> Hafer-Agar <SEP> sehr <SEP> mässig <SEP> und <SEP> reichlich, <SEP> glatt, <SEP> farblos, <SEP> Rück- <SEP> abwesend <SEP> 
<tb> 3) <SEP> langsam, <SEP> glatte <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> braun-seite <SEP> zuerst
<tb> Patina <SEP> hellgrau <SEP> zitronengelb,
<tb> dannhellbraun
<tb> Asparagin- <SEP> mässig, <SEP> sehr <SEP> reichlich, <SEP> strohgelb,

   <SEP> hellgelbGlycerin- <SEP> glatte <SEP> Patina <SEP> glatt, <SEP> weiss <SEP> mit <SEP> Rückseite <SEP> braun
<tb> Agar <SEP> beige <SEP> Tönungen <SEP> orangeocker
<tb> bis <SEP> braun
<tb> 
 

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   Tabelle 1   (Fortsetzung) 
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Kultureigenschaften <SEP> von <SEP> Streptomyces <SEP> lisandri
<tb> Vegetatives <SEP> Lösliche
<tb> Medium <SEP> Wachstum <SEP> Luftmycel <SEP> Vegetatives <SEP> Lösliche <SEP> 
<tb> Mycel <SEP> Pigmente
<tb> Glukose- <SEP> reichlich, <SEP> reichlich, <SEP> strohgelb, <SEP> Rück- <SEP> abwesend <SEP> 
<tb> Hefeextrakt- <SEP> leicht <SEP> gefaltete <SEP> ziemlich <SEP> glatt, <SEP> seite <SEP> hellocker
<tb> Agar <SEP> Patina <SEP> weiss
<tb> 1)
<tb> Pepton- <SEP> reichlich, <SEP> reichlich,

   <SEP> honigfarbig <SEP> bis <SEP> hellStärke- <SEP> Agar <SEP> glatte <SEP> Patina <SEP> ziemlich <SEP> glatt, <SEP> zitronengelb, <SEP> teefarbig
<tb> 1) <SEP> weiss <SEP> Rückseite <SEP> ockerbraun <SEP> mit <SEP> rosa
<tb> Tönungen
<tb> Pepton-Agar <SEP> mässig, <SEP> reichlich, <SEP> farblos, <SEP> Rück- <SEP> abwesend <SEP> 
<tb> KNO <SEP> glatte <SEP> Patina <SEP> leicht <SEP> wattig, <SEP> seite <SEP> strohgelb
<tb> 1) <SEP> weiss <SEP> 
<tb> 
 1) Waksman S.   A."TheActinomycetes",   Bd. II, The William   and Wilkins CO. [1961],  
S. 328 bis 334. 



    2)   Pridham T. G., Anderson 0., Foley C., Lindenfelser L. A., Hesseltine G. M. und
Benedict R.   B."Antibiotics   Annual" [1956-1957],   S. 947   bis 953. 
 EMI3.2 
 



   Biochemische Eigenschaften : 
Gelatine : totale Proteolyse
Nitrat : keine Reduktion zu Nitriten
Stärke : totale Hydrolyse
Milch : keine Gerinnung, totale Peptonisierung
Melanoidpigmente : keine Erzeugung
Tyrosin : Zersetzung
H2S : keine Erzeugung 
Der Mikroorganismus erzeugt auf einem Agarnährboden ein lösliches Pigment, das auf synthetischen Nährböden hellweinrosa oder hellbraungelb ist, während es auf den organischen hellteefarbig ist
Der Mikroorganismus verwertet zum Wachsen folgende Kohlenstoffquellen : Glukose, 1-Arabinose, Saccharose, d-Xylose, Mesoinosit, d-Mannit, d-Fructose, Maltose und Raffinose. Rhamnose wird nicht verwertet. Der Mikroorganismus wächst bei   500C   nicht und erzeugt keine Sklerotien. In submerser gerührter flüssiger Kultur erzeugt der Mikroorganismus Antibiotika, die den Komplex Axenomycin bilden. 



   Identifizierung des Mikroorganismus :
Die vorher beschriebenen Eigenschaften, die der geprüfte Mikroorganismus zeigt, erlauben es, ihn der Art Streptomyces Waksman et Henrici (Bergeyls Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe   [1957],   S. 744 bis 745) zuzuordnen. Der Stamm gehört zur   Klasse"Spira", Serie"White"von   
 EMI3.3 
    al (Appl Microbiol(Giorn.   Microbial   6 [1958],   S. 10), zur   Serie"Albus"von   Waksman (The Actinomycetes, Bd. II [1961], S. 117) und schliesslich zur Gruppe der Streptomyceten, die nach Hütter (Systematik der Streptomyceten,   Bibl.   MicrobioL, Band 6, S. Karger, Basel [1967], S. 256) ein   Luftmycel "niveus" besitzen.   



   Ein Vergleich zwischen den Eigenschaften des geprüften Mikroorganismus und jenen der Arten, die 

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 zu den angegebenen systematischen Untergruppen (Taxa) gehören, zeigt, dass keine von ihnen alle Eigenschaften hat, die der untersuchte Mikroorganismus aufweist. 



   Aus obigen Gründen und weil der Mikroorganismus insbesondere auf synthetischen Nährböden ein lösliches Pigment erzeugt, das von rosa bis rötlich bis violett-weinfarbig bis zitronengelb wechselt, was in der Beschreibung jedes der Mikroorganismen, die zu den erwähnten Untergruppen gehören, nicht gefunden wurde, und weil er schliesslich den neuen antibiotischen Komplex Axenomycin erzeugt, wird dieser Mikroorganismus als neue Art angesehen und Streptomyces lisandri n. sp. genannt. 



   Der Mikroorganismus Streptomyces lisandri n. sp. kann durch aufeinanderfolgende Übertragungen auf feste Nährböden und durch Gefriertrocknung einer Suspension seiner Sporen in einem geeigneten Träger gelagert werden. 



   Das mikrobiologische Verfahren zur Herstellung des neuen antibiotischen Komplexes Axenomycin besteht darin, dass der neue Mikroorganismus Streptomyces lisandri n. sp. in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, fermentiert, das Antibiotikum extrahiert und danach die Substanzen, aus welchen es besteht, getrennt und charakterisiert werden. 



   Insbesondere wird der Mikroorganismus in einem flüssigen Kulturboden unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 23 bis 370C, vorzugsweise   28 C,   während eines Zeitraumes von 60 bis 160 h entwickelt. Der PH- Wert kann entsprechend den verwendeten Fermentationsnährböden von 6 bis 9 variieren. Als Kohlenstoffquellen können Glukose, Stärke, Dextrin, verschiedene Mehle (Soja-, Mais-, Weizenmehl   usw.),   Getreideweiche u. a. gewöhnlich verwendete Substanzen verwendet werden. Als Stickstoffquelle können ausser den oben erwähnten komplexen Substanzen, die Stickstoff enthalten, auch Kasein, Kaseinhydrolysate, Baumwollsamenmehl und Ammoniumsalze, wie Sulfate, Phosphate, Chloride u. a. allgemein übliche Substanzen verwendet werden. 



   Die zur Herstellung des Antibiotikums verwendeten Mineralsalze variieren je nach dem verwende-   ten Kulturnährboden. Calciumcarbonat   ist fast immer anwesend, und   ausserdem können Chloride,   Sulfate, Phosphate usw. von Natrium, Kalium, Magnesium, Eisen, Kupfer, Zink, Mangan und Kobalt zugesetzt werden. 



   Die Fermentation kann in Erlenmeyer-Kolben und in Laboratoriums- oder Industriefermentern verschiedener Kapazität durchgeführt werden. Wenn die Fermentation vorbei ist, wird der antibiotische Komplex mit geeigneten Lösungsmitteln unter geeigneten Bedingungen aus der Kulturbrühe extrahiert und durch Absorption über eine chromatographische Säule in dessen antibiotische Substanzen getrennt. 



   Die Bestimmung der Konzentration des antibiotischen Komplexes im Kulturmedium wird während der Wachstumsperiode des Mikroorganismus durchgeführt, wobei Proben geprüft werden, die durch Extrahieren des feuchten Mycels mit Äthylalkohol erhalten wurden. Nach Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum wird der Rückstand mit dem kleinsten Volumenteil eines geeigneten Lösungsmittels (Äthylalkohol, Methylalkohol, Dimethylformamid) aufgenommen und dann mit Wasser   verdünnt.   



   Solche Proben werden auf Mikroorganismen geprüft, die gegenüber dem antibiotischen Komplex empfindlich sind, z. B. Rhabditis macrocerca und   Saccharomyces carlsbergensis,   wobei eine Reihe von Verdünnungen der zu prüfenden Probe hergestellt wird und diese mit Lösungen des antibiotischen Komplexes mit bekanntem Titer verglichen werden. 



   Auf analoge Weise können die aus nachfolgenden Reinigungen erhaltenen Proben titriert werden. 



   Chemisch-physikalische Eigenschaften :
Der antibiotische Komplex Axenomycin besteht aus zwei Substanzen, welche ähnliche chemischphysikalische Eigenschaften haben. Solche Substanzen werden Axenomycin A und Axenomycin B genannt ; sie liegen in Form von gelblich-weissen amorphen Produkten vor und sind in Benzol und Petrol- äther nicht löslich, kaum löslich in Wasser, Äthylacetat, Aceton und Chloroform und löslich in Äthyl-, Methyl-und Propylalkohol. Sie reduzieren die   Fehlingtsche   Lösung und die ammoniakalische Silbernitratlösung und reagieren mitTetrazolblau. Die Molish'sche Reaktion ist schwach positiv. Die Tüpfelreaktionen mit Anilinphthalat auf Aldose und mit Naphthoresorcin auf Ketosen sind negativ. Die Reaktion mit Ferrichlorid ist negativ. 



   Das Antibiotikum Axenomycin A ergibt bei Elementaranalyse folgende Werte : C 61, 74%, H 8, 52%, 0   28, 870/0,.   Das Molgewicht beträgt 1451, 3. Die Verbindung schmilzt bei 127 bis 1420C unter Bil- 
 EMI4.1 
 
Die Spektren im UV, gemessen in Methanol, zeigen Absorptionsmaxima bei   denfolgenden Wellen-   längen : 249,254 und 330   mfl   und eine Schulter bei 265 bis 268   mu.   

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 EMI5.1 
 :11, 80, 12, 50. 



   Das Antibiotikum Axenomycin B ergibt bei Elementaranalyse folgende Werte : C 62,   80/0,   H 8,   580/0,   
 EMI5.2 
    beträgt 1330, 2.(c = 0, 9   in Methanol),   Rf = 0, 61 auf Silikagel,   gepuffert auf einen PH-Wert von 7   (n-Butanol :   Essigsäure : Wasser =   4 : 0, 5 : 1).   



   Die Spektren im UV, gemessen in Methanol, ergeben Absorptionsmaxima bei den folgenden Wel-   lenlängen :   249,254 und 330 mu und eine Schulter bei 265 bis 268   mali.   Im IR-Spektrum, gemessen in 
 EMI5.3 
 
Wurmhemmende Aktivität :
Die wurmhemmende Aktivität wurde "in vitro" an verschiedenen Würmern unter verschiedenenModalitäten geprüft. 



   Rhabditis macrocerca, gehalten auf Kulturen im Laboratorium, wurde in Hefeextrakt-Agar, das mit dem Antibiotikum in verschiedenen Konzentrationen behandelt wurde, kultiviert. 



   Nach geeigneter Bebrütung wurde die MHD, minimale Dosis des Antibiotikums, die die Entwicklung des geprüften Mikroorganismus total hemmt, bestimmt
Syphacia obvelata und   Hymenolepis nana,   die experimentell infizierten Mäusen entnommen wurden, wurden in auf einen pH-Wert von 7, 5 gepufferten Kochsalzlösungen eingetaucht Das Antibiotikum wurde in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Nach verschiedenen Kontaktzeiten wurde geprüft, wieviele der beiden Wurmarten noch überlebten, und die MID oder minimale lähmende Dosis, die die geringste Menge der Substanz, die imstande ist, die Bewegungen des geprüften Organismus "in vitro" zu lähmen, bedeutet, bestimmt
In Tabelle II sind die Werte der minimalen Hemmungsdosis und der minimalen Lähmungsdosis, bestimmt nach 4 h Kontaktzeit, angegeben. 



    Tabelle H    
 EMI5.4 
 
<tb> 
<tb> Axenomycin <SEP> A <SEP> Axenomycin <SEP> B
<tb> Geprüfte <SEP> Arten <SEP> MHD <SEP> Y/ml <SEP> MIDy/ml <SEP> MHDy/ml <SEP> MIDy/ml <SEP> 
<tb> Rhabditis <SEP> macrocerca <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Syphacia <SEP> obvelata <SEP> > 1000 <SEP> > 1000
<tb> Hymenolepis <SEP> nana <SEP> 0,5 <SEP> 0,5
<tb> 
 
Die wurmhemmende Aktivität wurde "in vivo" an Albinomäusen mit einem Gewicht von 25 g geprüft, die experimentell mit Hymenolepis nana infiziert waren. Die Versuche wurden an Gruppen von jeweils 10 Mäusen durchgeführt.

   Die Ergebnisse zeigen, dass 100% der befallenen Mäuse durch Verabreichung der Antibiotika, sei es Axenomycin A, sei es Axenomycin B, in einer einzigen Dosis auf oralem Wege geheilt wurden, Diese Dosis oder die therapeutische Dosis, die 10 mg/kg entspricht, liegt deutlich unter der Dosis, die durch Toxizitätsdaten erlaubt ist. 



   In Tabelle III sind die Daten akuter Toxizität bei Mäusen angegeben. 



   Tabelle III 
 EMI5.5 
 
<tb> 
<tb> DL <SEP> 50 <SEP> mg/kg
<tb> Verabreichungsart <SEP> Axenomycin <SEP> A <SEP> Axenomycin <SEP> B
<tb> oral <SEP> 200 <SEP> 300
<tb> intraperitoneal <SEP> 3,7 <SEP> 10
<tb> 
 
Aktivität gegen Protozoen :
Die Aktivität gegen Protozoen wurde "in vitro" an Entamoeba histolytica Stamm F 22 in einem   einphasigenPavlova-Medium   und an Trichomonas foetus in einem Zweiphasen-Medium aus geronnenem 

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 Ei und   Lock@scher Kochsalzlösung-Pferdeserum geprüft.   Nach 48stündiger Bebrütung bei   37 C   wurde durch mikroskopische Ablesung der anwesenden Protozoen die minimale Hemmungsdosis (MHD) bestimmt. Die experimentell"in vitro"ermittelten Daten der Aktivität gegen Protozoen sind in Tabelle IV angegeben. 



   Tabelle IV 
 EMI6.1 
 
<tb> 
<tb> MHD <SEP> #/ml
<tb> Axenomycin <SEP> A <SEP> Axenomycin <SEP> B
<tb> Trichomonas <SEP> foetus <SEP> 0,1 <SEP> 0,1
<tb> Entamoeba <SEP> histolytica <SEP> 1,5 <SEP> 3
<tb> 
 
Aktivität gegen Pilze :
Die Aktivität gegen Pilze wurde "in vitro" an Saccharolyces carlsbergensis und Candida albicans in einem Sabouraud-Medium geprüft. Nach 48stündiger Bebrütung bei   300C   wurde die minimale Hemmungsdosis (MHD) bestimmt, die erhaltenen Werte sind in Tabelle V angegeben. 



   Tabelle V 
 EMI6.2 
 
<tb> 
<tb> MHD <SEP> Y/ml <SEP> 
<tb> Axenomycin <SEP> A <SEP> Axenomycin <SEP> B
<tb> Saccharomyces <SEP> carlsbergensis <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP> 
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 1,25 <SEP> 1,25
<tb> 
 
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne dass diese jedoch hierauf beschränkt sein soll. 



     Beispiel l :   Zwei 300   ml-Erlenmeyer-Kolben,   die je 60 ml des folgenden Mediums enthalten, werden vorbereitet :
Dextrin 3%
Kasein   0, 5%  
Calciumcarbonat 0, 4%
Ammoniumsulfat   0, 1   
Getreideweiche   l%   (com steep liquor)
Leitungswasser auf 100 
Die Sterilisierung erfolgt durch Erhitzen im Autoklaven auf 120 C während 20 min. Der PH-Wert des Mediums variiert nach der Sterilisierung von 6, 8 bis 7. 



   Jeder Kolben wird mit 0, 5 ml einer Sporensuspension angeimpft, die durch Waschen der Patina einer 15 Tage alten, auf Glukose-Kartoffel-Agar entwickelten Schrägkultur von Streptomyces lisandri (Nr. F. L 2604 der Stämmesammlung der   Società   Farmaceutici Italia) mit 4 ml sterilem destilliertem Wasser erhalten wird. 



   Die Kolben werden bei   280C   während 48 h auf einem Drehschüttler mit 225 Umdr/min mit einem Hub von 3 cm bebrütet. 



   2ml einer derartigen Kultur werden dazu verwendet, um andere 300   ml-Kolben,   die jeweils 60 ml des folgenden produktiven Mediums enthalten, anzuimpfen :
Stärke 4, 5%
Sojamehl 2,2%
Getreideweiche 2, 3% (corn steep liquor)
Calciumcarbonat 0,   ze  
Natriumchlorid 0,5%
Leitungswasser auf 100 
 EMI6.3 
 

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Die Sterilisierung erfolgt durch Erhitzen auf 1200C während 20 min. 



   Es wird bei   280C   bebrütet, wie vorher für die vegetative Kultur beschrieben. Nach 120 h langer Bebrütung werden   50'Y   des antibiotischen Komplexes pro ml Kulturbrühe erhalten. 



   Beispiel 2 : Das Verfahren wird wie in Beispiel 1 durchgeführt. Für die produktive Phase wird das folgende Medium verwendet : 
Lösliche Stärke 8%
Baumwollsamenmehl 4%
Getreideweiche 2, 5% (corn steep liquor) 
 EMI7.1 
 
Ammoniumsulfat   l%  
Mangansulfat 0, 01%
Kobaltsulfat 0, 0007%
Leitungswasser auf 100 
Der pH-Wert wird mit einer 4n-Natriumhydroxydlösung auf 6,2 eingestellt. 



   Die Sterilisierung erfolgt durch Erhitzen auf 1200C während 20 min. Es wird unter Rühren bei   280C   bebrütet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach 120 h langer Bebrütung werden 70 Y des Komplexes pro ml Kulturbrühe erhalten. 



   Beispiel 3 : Zwei 300   ml-Erlenmeyer-Kolben,   die jeweils 60 ml des folgenden Mediums enthalten, werden vorbereitet : 
Dextrin 5%
Calciumcarbonat 0. 5%
Getreideweiche   l%   (corn steep liquor)
Kasein   l%  
Ammoniumsulfat 0, 2%   sek, -Kaliumphosphat   0, 01%
Leitungswasser auf 100 
Die Sterilisierung erfolgt durch Erhitzen auf 1200C während 20 min. Nach der Sterilisierung variiert der plI-Wert des Mediums von 6,7 bis 7. Jeder Kolben wird mit 1 ml einer Sporensuspension an- 
 EMI7.2 
 spiel 1 und 2 beschrieben,   bebrütet.   



   2 ml der so erhaltenen Kultur werden dazu verwendet, 300   ml-Kolben,   die jeweils 60 ml produktives Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten, anzuimpfen : 
Glukose 6%
Sojamehl 3%
Getreideweiche 2% (corn steep liquor)
Calciumcarbonat 1%
Natriumchlorid 0,   3%  
Sojaöl 0, 05%
Leitungswasser auf 100 
Die Sterilisierung erfolgt bei   1200C   während 20 min. Der PH-Wert des Mediums nach der Sterilisierung variiert von 6,2 bis 6, 8. Die Kolben werden bei   280C   unter den in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Schüttelbedingungen bebrütet. 



   Nach 120 h langer Bebrütung werden 120 Y des Komplexes pro ml Kulturbrühe erhalten. 

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   Beispiel 4 : Ein   2000 mI-Kolben,   der mit drei Wellenbrechereinrichtungen und einem seitlichen Inokulationsansatz versehen ist und der 500 ml des in Beispiel 3 beschriebenen Mediums für die vegetative Phase enthält, wird durch Erhitzen auf 1200C während 20 min sterilisiert. Nach Abkühlen wird der Kolben mit der gesamten Sporensuspension angeimpft, die durch Waschen der Patina von vier schrägen, 15 Tage alten, auf Glukose-Kartoffel-Agar entwickelten Kulturen mit destilliertem Wasser erhalten wird. 



   Der Kolben wird bei   28 C   während 48h auf   einem Drehschüttler   mit 120 Umdr/min mit einem Hub von 4,5 cm   bebrütet  
50 ml der so erhaltenen vegetativen Kultur werden dazu verwendet, 3   l   eines Mediums, das in einem 5   l   Glasfermenter enthalten ist und die folgende Zusammensetzung aufweist : 
Dextrin 4%
Kasein   1%  
Getreideweiche   l%   (corn steep liquor)
Calciumcarbonat 0, 5%
Ammoniumsulfat   0, 10/0  
Kaliummonophosphat   0, 01%  
Leitungswasser auf 100, das vorher bei 1200C während 30 min sterilisiert wurde, anzuimpfen. 



   Die Brühe wird bei 400 Umdr/min gerührt und mit etwa 1   VoL-Teil Luft/Vol.-Teil   Medium/min belüftet und bei einer Temperatur von 27 bis   28 C   während etwa 24 h bebrütet. Am Ende dieser Periode werden 3   l   der   erhaltenenMycelsuspension   zur Animpfung von 50   l   Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet :

   
Glukose 8%
Sojamehl 3%
Getreideweiche 2% (corn steep liquor)
Natriumchlorid 0, 25%   Calcium carbonat 10/0   
Sojaöl 0, 5%
Leitungswasser auf 100 
Nach der Sterilisierung bei 1210C während 30 min und nach der Animpfung wird das Medium mittels eines mit vier Schraubenflügeln versehenen Rührwerks mit 200 Umdr/min gerührt und mit einer Luftzufuhr von   0, 7 1/1   Nährboden/min bei einer Temperatur von 27 bis   28 C   während 120 h belüftet. 



  Das durch Filtrieren von 5   l   Kulturbrühe erhaltene Mycel wird viermal mit je 3   l   Methanol extrahiert Die gesammelten Extrakte werden unter vermindertem Druck konzentriert und der wässerige Rückstand mit Petroläther gewaschen und dann viermal mit dem gleichen Volumen n-Butylalkohol extrahiert. Die gesammelten und unter Vakuum zur Trockene eingedampften Extrakte ergeben einen Rückstand, der mit 100 ml Methylalkohol aufgenommen wird. 



   Der unlösliche Teil wird verworfen und die Lösung eingedampft. Der Rückstand wird in 200 ml Chloroform suspendiert und dann filtriert   Die Chloroformlösung   wird konzentriert und dann mit Petrol- äther ausgefällt, wobei 2, 0 g eines rohen Produkts erhalten werden, welches die Antibiotika Axenomycin A und Axenomycin   B enthält  
Das Rohprodukt wird durch Gegenstromverteilung mit dem Zweiphasensystem Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff-Methanol-Wasser (3 : 2 : 4 : 1) gereinigt. Wenn man eine Fraktionierung über 50 Röhren durchführt, erhält man die grösste Wirkung in den Röhren 10 bis 20. Bei Eindampfen des Inhaltes dieser Röhren zur Trockene erhält man 0, 20 g des reinen Axenomycinkomplexes.

   Bei Dünnschichtchromatographie zeigt sich, dass der erhaltene Komplex die zwei antibiotischen Komponenten Axenomycin A und Axenomycin B mit Rf 0, 49 und   0, 61 enthält.   Die Trennung der zwei aktiven Substanzen wird durch Chromatographie   aufSilikagelsäuren,   die mit 0, 05M Phosphatpuffer auf einen PH- Wert von 7 gepuffert wurden, und mit Zugabe von   33su0   Zellulosepulver   durchgeführt  
Für 1 g des antibiotischen Komplexes wird eine Säule mit einem Durchmesser von 2, 4 cm und einer 

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Claims (1)

1. Höhe von 30 cm benötigt. Durch Eluieren mit der Mischung n-Butylalkohol : Essigsäure : Wasser (4 : 0, 5 : 1 im Volumen) erhält man Fraktionen, die 0, 6 g der Komponente B und 0, 25 g der Komponente A enthalten. Die einzelnen Antibiotika, die nach dem Abdampfen der Eluate mit Methanol aufgenommen werden, werden durch Entfernung des Lösungsmittels gewonnen und über pros bei 0, 2 mm Hg und Raumtemperatur bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet P A T E N T A N S P R U C H : Verfahren zur Herstellung des neuen antibiotischen Komplexes Axenomycin und dessen Salzen mit pharmazeutisch verwendbaren Säuren, der aus den Substanzen Axenomycin A und Axenomycin B besteht, dadurch gekennzeichnet, dass der neue Mikroorganismus Streptomyces lisandri (I. M. R. U. 3935, LM.

   I. 137718) bzw. dessen Mutanten unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 23 bis 370C während eines Zeitraumes von 60 bis 160 h bei einem pH-Wert von 6 bis 9 gezüchtet wird und der hiebei erhaltene Komplex aus der Fermentationsbrühe isoliert und dann in die zwei antibiotischen Komponenten Axenomycin A und Axenomycin B, z. B. durch Chromatographie an Silicagel, getrennt wird.