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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man in einem wässerigen Kulturnährmedium unter submersen, aeroben Fermenta- tionsbedingungen den Mikroorganismus Soopulariopsis sp. NRRL 5715 züchtet, bis eine wesentliche Menge an Deacetoxycephalosporin C von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium gebildet wird, und man dann i das Deacetoxycephalosporin C aus dem Kulturmedium isoliert.
Die Cephalosporinverbindung Deacetoxycephalosporin C wird durch die folgende Strukturformel darge- stellt :
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Sie unterscheidet sich von Cephalosporin C dadurch, dass die Acetoxymethylgmppe in der 3-Stellung des Dihydrothiazinringes des Cephalosporins C durch eine Methylgruppe ersetzt ist. Dieser Strukturunterschied wird geeigneterweise durch die Vorsilbe Desacetoxy oder Deacetoxy bei der Bezeichnung der abgebildeten Cephalosporinverbindung ausgedruckt. Alternativ wird der formale Name, nämlich 3-Methyl-7- (5' -amino- - 5'-carboxyvaleramido)-3-cephem-4-carbonsäure, der dem Cepham-Nomenklatursystem entspricht, oft verwendet. Der Einfachheit halber wird die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung als"Deacetoxycephalo- sporin" bezeichnet.
Aus der deutschen Offenlegungsschrift 1492053 ist ein Verfahren bekannt, bei welchem Cephalosporin C, Penicillin N oder Cephalosporin P mittels einer Emericellopsis-Cephalosporium-Kultur gewonnen wird. Dieses bekannte Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus in einer kontinuierlichen Kultur in einem Gleichgewichtszustand gezüchtet wird, wobei in jedem Fall die wachstumsbesehränkenden Nährstoffe auf jenen Wert eingestellt werden, der die Bildung der Antibiotika begünstigt. Beim erfindungsgemässen Verfahren wird hingegen in einem wässerigen Kulturnährmedium ein Mikroorganismus gezüchtet, der zur Gattung Scopulariopsis gehört, wobei Deacetoxycephalosporin C gebildet wird.
Deacetoxycephalosporin C ist ein wertvolles Zwischenprodukt, das für die Herstellung von Cephalosporin-Antibiotika verwendet werden kann. Beispielsweise kann es mit Nitrosylchlorid unter den in der USA-Patentschrift Nr. 3, 188, 311 beschriebenen Bedingungen umgesetzt werden, wobei die AminoadipoylSeitenkette entfernt wird und 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) gebildet wird. Die 7-ADCA kann mit der gewünschten Acylgruppe acyliert werden, wobei das Cephalosporin-Antibiotikum gebildet wird.
Beispielsweise kann 7-ADCA nach bekannten Verfahren mit einem aktiven Ester, mit gemischtenAnhydriden oder andern geeigneten Derivaten von Phenylglycin acyliert werden, wobei das bekannte Antibiotikum Cephalexin gebildet wird.
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bindung als Zwischenprodukt bei der Herstellung von Cephalosporin-Antibiotika besteht ein Bedarf für andere wirtschaftlichere Verfahren für die Herstellung dieser Verbindung.
Der Penicillin N (Cephalosporin N) bildende Mikroorganismus der Gattung Scopulariopsis wird in einem wässerigen Kultumährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen kultiviert, wobei Deacetoxycephalosporin C gebildet wird. Deacetoxycephalosporin C wird von den andern, gleichzeitig gebildeten Substanzen wie Cephalosporin C, Penicillin N und Desacetylcephalosporin C abgetrennt, indem man zuerst die gesamte Reaktionslösung mit einer Mineralsäure wie mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von ungefähr pH 2 angesäuert. Die angesäuerte Lösung wird dann bei Zimmertemperatur während ungefähr 1 h gerührt.
Während dieser Zeit werden die säureempfindlichen Verbindungen zersetzt. Danach wird der PH-Wert durch die Zugabe einer geeigneten Base wie Natriumhydroxyd wieder auf einen pH-Wert von 6, 0 eingestellt. Das Mycel und andere unlösliche Stoffe werden abfiltriert und das filtrierte Kulturmedium wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert, um weitere Verunreinigungen zu entfernen.
Das Deacetoxycephalosporin C wird aus dem wässerigen semi-gereinigten Kulturmedium durch Chromatographie auf folgende Weise gewonnen. (Wenn hier von Kulturmedium oder-lösung beim Züchten von Mikroorganismen gesprochen wird, wird darunter das Medium verstanden, das man bei der Züchtung erhält. Dieses kann auch einfach als "Brühe" bezeichnet werden. Das Wort "Medium" wird in diesem Zusam-
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menhang im Sinne des englischen Wortes"broth"verwendet.)
Das wässerige Medium wird zuerst über Aktivkohle chromatographiert. Die mit Aktivkohle beschickte Säule wird mit Wasser gewaschen, um Verunreinigungen weiter zu entfernen, und danach wird die Aktivität mit 50% igem wässerigem Aceton eluiert. Das Eluat wird konzentriert und über ein anionisches Austauschharz geleitet.
Das Deacetoxycephalosporin C wird davon, bevorzugt mit einer O, 15n Natriumacetatlösung, eluiert. Die Eluate werden dann zur Trockne eingedampft oder lyophilisiert, wobei man eine rohe Deacetoxycephalosporin C-Präparation erhält.
Das Rohmaterial wird durch weitere Chromatographie über eine Cellulosesäule oder über Silikagel gereinigt. Die aktiven Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden entweder auf ein geringes Volumen konzentriert oder zur Trockne eingedampft. Das Konzentrat oder der trockene Feststoffrlickstand wird in einer minimalen Menge an Isopropanol gelöst und die Lösung wird in Diäthyläther gegossen, um
Deacetoxycephalosporin C als Natriumsalz auszufällen.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird ein Mikroorganismus der Gattung Scopulariopsis, der
Penicillin N bildet, in einem Nährmedium kultiviert, das assimilierbare Quellen der Kohlenstoff, Stickstoff i und anorganischen Salzen enthält, wobei Deacetoxycephalosporin C gebildet wird.
Der Mikroorganismus, der bei dem erfindungsgemässen Verfahren nützlich ist, wurde als Glied der
Klasse Fungi imperfect klassifiziert, da er keine geschlechtlichen Sporen bildet. Er wird weiter in die
Klasse Moniliales, die Familie Moniliaceae und die Gattung Scopulariopsis klassifiziert.
Die obige Klassifizierung des Mikroorganismus, der bei der Erfindung nützlich ist, basiert auf den be- obachteten morphologischen und Kultureigenschaften. In den folgenden Abschnitten erfolgt eine taxanomlsche
Beschreibung des Mikroorganismus.
Die Bezugnahme auf "Maerz und Paul Farbplatten" bezieht sich auf die Farbplatten in Maerz und Paul, Dictionary of Color, McGraw-Hill Book Co., Inc., New York [1950].
Morphologie und Kultureigenschaften von Scopulariopsis sp. NRRL 5715 :
Die Eigenschaften dieser Kultur entsprechen denen, wie sie von Raper und Thom in Scopulariopsis
Bainier (1) beschrieben sind. Die Bildung von Konidien mit entweder glatten oder rauhen Wänden, die sowohl aus den lateralen als auch aus den endständigen Phialiden, aber nicht vollständig gebildet werden, wie auch die Farbmuster und die Koloniebeschreibung zeigen, dass diese Kultur am besten zwischen die Gruppe m von Raper und Thom, die durch Scopulariopsis brevicaulis var. glabra Thom dargestellt wird, und die Gruppe
IX, die durch S. diversispora dargestellt wird, passt.
Das Wachstum dieses Fungus auf Lösungsagar nach Czapek ist sparsam und farblos. Es tritt keine
Fruchtbildung auf.
Auf Kartoffel-Dextrose-Agar wird eine Kolonie gebildet, die innerhalb von 10 Tagen bei 260C aus einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 22 mm zu einer Kolonie mit einem Durchmesser von 34 mm wächst. Die Sporulation ist mässig und auf die inokulierte Zone beschränkt, die Nährmedium enthält, das in das Inokulum mit übertragen wurde. Das Mycel ist farblos auf beiden Oberflächen und hat einen glatten, gleichmässigen Rand.
Malzextrakt-Agar ergibt eine Kolonie, die aus einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von
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messerflächen mit einem farblosen, 4 mm breiten, strahlenförmig gefalteten Rand. Sowohl aufrechte als auch liegende Synnemata und funiculäre Hyphen bilden Phialiden, die Konidien, allgemein in Ketten, aber gelegentlich in feuchten Knäulen, entwickeln.
Modifizierter V-8-Saft-Agar ergibt die beste Konolieentwicklung von Luftkomponenten. Diese Kolonie erreicht aus einer inokulierten Zone mit einem Durchmesser von 15 mm einen Durchmesser von 33 mm.
Eine vergleichsweise flache, 3 mm breite Randzone ist nicht gut gewachsen und durch strahlenförmig verlaufende Sporulationsgriffel bzw. -finger markiert. Der grössere mittlere Teil dieser Kolonie ist schwach dunkelgelb, das Ergebnis einer relativ starken Sporulation. Diese Fläche ist stark synnematisch. Die Umkehrfarbe ist mittelbraun, nach 10 Tagen dunkelt diese Farbe zu einem hellen schokoladenbraun.
Um die Konidienstufe dieser Kultur zu beschreiben, wurde der Kartoffel-Dextrose-Agar verwendet.
Phialiden entstehen aus Synnemata und Funiculi, einige sind endständige Verlängerungen der Konidlophoren.
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gross.
Die Konidien sind entweder grobwandig oder glatt, hyalin, nicht-septiert, kugelförmig bis subkugelförmig und besitzen typischerweise abgestumpfte Rundteile, die für den Genus Scopulariopsis charakteristisch sind. Die glatten Sporen sind oft elliptisch bis oval, im allgemeinen kleiner und sie sind offensicht-
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Die groben oder rauhen Sporen sind von 3, 5 bis 5, 6 P, lang und von 2, 8 bis 4, 2 ju breit, durchschnitt- lich beträgt ihre Grösse 4, 3 x 3, 6 g. Diese rauhen Konidienoberflächen variieren von verrucös (= mit kleinen
Warzen versehen) bis zu echinulat (= seeigelartig) und ähnelnPenicillium-Sporen. Bis zu 14 Tagen tritt keine perfekte Stufe auf. i Literaturstellen : K. B. Raper und C. Thom, [1949]. A manual of the Penicillin. The Williams and Wilkins
Company, Baltimore, S. 697 bis 701.
Wie zuvor erwähnt, ist der Mikroorganismus, der bei dem erfindungsgemässen Verfahren nützlich ist, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass er Penicillin N bildet. Zusätzlich besitzt der oben beschriebene
Mikroorganismus die morphologische Eigenschaft der Bildung von Phiolensporen aus Phialiden, die entwe- der einzeln aus Hyphen oder aus verzweigten oder unverzweigten Konidiophoren gebildet werden.
Der oben beschriebene Stamm von Scopulariopsis wurde ohne Beschränkung hinsichtlich der Verfügbar- keit bei der dauernden Kulturkollektion von der Northern Regional Research Laboratory, Agricultural
Research Serive, United State Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt, wo den Kul- turen die bei der zuvor angegebenen taxanomischen Beschreibung nach dem Namen der entsprechenden Kul- tur aufgeführten Zahlen als Eingangszahlen zugeordnet wurden.
Wie zuvor erwähnt, wird der Organismus, der bei der Erfindung verwendet wird, nach einem submer- sen aeroben Fermentationsverfahren kultiviert. Das Kulturmedium, das verwendet werden kann, kann irgendeines einer Anzahl von unterschiedlichen Medien sein. Beispielsweise kann man verschiedene Kohlen- stoffquellen verwenden wie Saccharose, Glucose, Stärke und ähnliche Kohlenstoffquellen. Ähnlich kann man die Stickstoffquellen aus einer Vielzahl von Verbindungen auswählen wie Sojabohnenmehl, Sojabohnengriess oder -staub, Baumwollsamenb1, Erdnussmehl, Aminosäuren, Aminosäuremischungen, Peptonenu. ähnl.
Aus Wirtschaftlichkeitsgründen bei der Herstellung, wegen der maximalen Ausbeute und der leichten
Isolierung sind bestimmte Medien bevorzugt, beispielsweise sind Melassen eine bevorzugte Quelle von
Kohlenhydraten, und bevorzugt Quellen von Stickstoff sind Sojabohnenmehl und Aminosäuren.
Anorganische Nährsalze, die in das Kulturmedium einverleibt werden können, umfassen die gewöhnli- chen Salze, die fähig sind, Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-,
Bromid-, Nitrat-, Carbonat-, Eisen- (II)-, Eisen- (ni)-, Magnesium-, Mangan-Ionen und ähnliche Ionen zu ergeben. Die erfindungsgemässen Fungi erfordern ähnlich wie andere Mikroorganismen, die Antibiotika er- geben, bestimmte unentbehrliche Spurenelemente für das Wachstum, ihre Entwicklung und ihren Metabolis- mus. Solche Spurenelemente können zu dem Fermentationsmedium zugegeben werden, jedoch sind sie im allgemeinen in ausreichender Menge als Verunreinigungen in den andern Bestandteilen vorhanden, die zu dem Kulturmedium zugefügt werden.
Der erfindungsgemäss verwendete Scopulariopsis-Stamm kann in Vorrichtungen kleiner Grösse wie in 11-Schüttelkolben kultiviert werden, wobei man geringe Mengen an Deacetoxycephalosporin C erhält. Für eine Herstellung der Cephalosporinverbindungen in grösserem Massstab werden die Organismen in Fermentationstanks in grösserem Massstab unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen kultiviert.
Bei der Herstellung von Deacetoxycephalosporin C in grösserem Massstab werden die Sporen des Organismus auf einer Agar-Schrägfläche gehalten. Die Sporen aus der Schrägfläche werden verwendet, um ein vegetatives Medium mit geringem Volumen zu inokulieren. Das vegetative Medium wird inkubiert, wobei man eine starke frische, tiefwachsende Kultur des Mikroorganismus erhält. Dieses vegetative Wachstum wird dann als Inokulum für das Fermentationsmedium in grösserem Massstab verwendet.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, weiters vegetatives Medium als Inokulum für das Fermentationsmedium zu verwenden. Solche vegetativen Medien der zweiten Stufe oder Organmedien werden im allgemeinen verwendet, wenn das Volumen des Fermentationsmediums signifikant oder wesentlich grösser ist als das Volumen des ersten vegetativen Mediums.
Auf diese Weise werden die Sporen der Organismen zuerst in einem geringen Volumen an vegetativem Medium kultiviert, wobei man das Inokulum für ein vegetatives Medium mit grösserem Volumen erhält. Das vegetative Medium mit grösserem Volumen bildet dann eine ausreichende Konzentration an Organismus, um einen schnellen Beginn der Fermentation in einem Fermentationstank in grossem Massstab zu initiieren. Das vegetative Medium kann die gleiche Zusammensetzung wie das Fermentationsmedium besitzen, oder es kann zusätzliche Bestandteile enthalten, um das Wachstum und die Bildung der Organismen in kleinem Massstab zu unterstützen.
Es wurde beobachtet, dass der erfindungsgemäss verwendete Mikroorganismus Deacetoxycephalosporin C innerhalb eines pH-Bereiches von ungefähr pg6, 2bisungefährpg8, 0 bildet. Während der submersen, aeroben Fermentation in Tanks in grossem Massstab nimmt der pH-Wert des Mediums von einem Anfangs- - pH-Wert von ungefähr 6, 5 auf einen End-pH-Wert von ungefähr 7, 5 zu.
Der erfindungsgemäss verwendete Organismus kann bei Temperaturen zwischen ungefähr 20 und 350C gezüchtet werden. Das Deacetoxycephalosporin C scheint bei einer Temperatur von ungefähr 260C in optimalen Ausbeuten gebildet zu werden.
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Die maximale Bildung von Deacetoxycephalosporin C tritt auf, wenn der Organismus in Tanks in grossem Massstab während einer Zeit zwischen ungefähr 4und 7 Tagen gezüchtet wird. Wenn man jedoch in Vorrichtungen in kleinerem Massstab züchtet, wie in 1 l-SchUttelkolben, verläuft das Wachstum der Organismen schneller und Deacetoxycephalosporin C wird in einer kurzeren Zeit, beispielsweise während 2 oder 3 Tagen, gebildet.
Da der End-pH-Wert im Fermentationsmed1um in grossem Massstab einen Wert von PH 8, 0 oder höher zu erreichen scheint, kann die Ausbeute an Deacetoxycephalosporin C nachteilig beeinflusst werden. Es ist daher wünschenswert, den pH-Wert des Fermentationsmediums in grossem Massstab von Zeit zu Zeit während der Fermentation zu prüfen. Es scheint so zu sein, dass der pH-Wert solche Werte vor dem Zeitpunkt erreicht, zu dem eine maximale Bildung an Antibiotikum auftritt. Der pH-Wert kann geeigneterweise durch Zugabe einer geeigneten Säure oder eines geeigneten Puffermittel zu dem Fermentationsmedium niedriger eingestellt werden.
Die Bildung von Deacetoxycephalosporin C während der Fermentation kann verfolgt werden, indem man Testproben der Fermentationsbrühe chromatographisch untersucht. Alternativ kann die Anwesenheit von Deacetoxyoephalosporin C durch Bloautographlen geprüft : werden. Der Organismus Pseudomonas solanacearcum kann verwendet werden, um bei der Bioautographie den Organismus festzustellen.
Wie bei den meisten submersen, aeroben Fermentationen wird sterile Luft durch das Kulturmedium geleitet, um ein wirksameres Wachstum des Organismus zu erreichen und um die Bildung an Fermentationsprodukten zu erhöhen. Das Luftvolumen, das durch das Kulturmedium gezwungen wird, beträgt im allgemeinen mindestens ungefähr 0, 2 V ol. Luft/min/V ol. Kulturmedium. Jedoch kann eine erhöhte Geschwindig-
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gunstigebesitzen.
Der Mikroorganismus, der bei dem Verfahren nützlich ist, bildet zusätzlich zu Deacetoxycephalosporin
C und dem charakteristischen Penicillin Nebenfalls Desacetylcephalosporin C, Cephalosporin C und gele- gentlich das Lacton, das mit Desacetylcephalosporin C gebildet wird, wie auch andere unidentifizierbare Metaboliten. Einige der zuvor erwähnten Verbindungen sind säurelabil. Es ist daher bei der Gewinnung von Deacetoxycephalosporin C aus dem Fermentationsmedium wünschenswert, das gesamte Fermentationsmedium für kurze Zeit bei einem sauren pH-Wert zu behandeln, um einen Teil der mitgebildeten Verunreinigungen zu zerstören. Bei Fermentationen in kleinem Massstab kann das Penicillin N durch die Zugabe einer Penicillinase zu dem Medium zerstört werden.
Das Deacetoxycephalosporin C-Fermentationsprodukt wird aus der filtrierten FermentationsbrUhe, die so behandelt wurde, gewonnen und von den andern Bestandteilen des Fermentationsmedium durch Chromatographie über einem Ionenaustauschharz abgetrennt. Es wird weiter durch Chromatographie über Cellulose oder Silikagel gereinigt und anschliessend ausgefällt und umkristallisiert.
Zu Beginn wird das filtrierte Fermentationsmedium einem vorläufigen Reinigungsverfahren unterworfen, wobei eine erste Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel wie n-Butanol, Amylacetat erfolgt, um Verunreinigungen zu entfernen. Das extrahierte Medium kann dann weiter vorbereitet werden, durch Chromatographie über aktiviertem Kohlenstoff gereinigt werden. Das extrahierte Medium wird über einer Säule chromatographiert, die mit aktiviertem Kohlenstoff, beispielsweise Pittsburgh 12 x 40 Kohlenstoff, gepackt ist und die Säule wird dann mit Wasser gewaschen, um wasserlösliche, ge- färbte Verunreinigungen und wasserlösliche anorganische Stoffe zu entfernen.
Die Fermentationsprodukte werden dann mit 50% ! gem Aceton-Wasser von dem Kohlenstoff eluiert. Das Eluat wird zu einer wässerigen Phase konzentriert, die dann über einem basischen, anionischen Austauschharz chromatographiert wird. Unter den basischen anionischen Austauschharzen, die verwendet werden können, sind solche der Polystyrol quaternären Ammoniumart, beispielsweise solche, die im Handel unter den Bezeichnungen Dowex 1, Dowex 2 (Dow Chemical Co., Midland, Mich.) und solche, die unter den Be- zeichnungen IRA-400, IRA-45, IRA-68 (Amberlite, RohmandHaas, Philadelphia, Pa. ) erhältlich sind.
Die Harze können in dem Hydroxylzyklus, dem Acetatzyklus, dem Formiatzyklus oder andern geeigneten Zyklen vorliegen bzw. verwendet werden. Das konzentrierte Eluat aus der Kohlenstoffsäure wird auf das anionische Austauschharz gegeben und dann wird das Harz mit Wasser gewaschen. Das Deacetoxycephalosporin C wird aus dem Austauschharz in Salzform mit einer geeigneten schwachen Base eluiert, beispiels-
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eine wässerige Lösung aus Natriumacetat In einer Konzentration von ungefähr In oder geringer.
Die Konzentration der Natriumacetatlösung ist nicht kritisch. Um jedoch die Anwesenheit von überschüssigem anorganischem Salz (Natriumacetat) im Eluat aus der Austauschsäule zu vermeiden, liegt die wünschenswerte Konzentration an Natriumacetat zwischen ungefähre, In und 0, 5n. Eine besonders bevorzugte Konzentration für die Eluierung, die überschüssiges Salz In dem Eluat vermeidet, beträgt 0, 15n. Wird das Austauschharz in dem Formiatzyklus oder bei andern geeigneten Zyklen verwendet, so kann das entsprechende Salz in wässeriger Lösung als Elutionslösungsmittel verwendet werden.
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Beispielsweise kann man Ammoniumformiat verwenden, wenn das Harz in dem Formiatzyklus vorliegt.
Viele Fraktionen werden gesammelt und die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthalten, bestimmt durch Bioautogramm, werden vereinigt. Die vereinigten Eluate werden dann über aktiviertem Kohlenstoff chromatographiert, über überschüssige anorganische Salze, beispielsweise Natriumacetat, das als Salz- lösung zum Eluieren verwendet wurde zu entfernen.
Die Kohlenstoffsäule wird mit Wasser gewaschen, um diese anorganischen wasserlöslichen Salze zu entfernen und das Deacetoxycephalosporin C wird dann aus der Säule mit einer 50%igem Aceton-Wasser-Mi- schung entfernt. Das Eluat wird zur Trockne eingedampft oder, alternativ, wird das Aceton abdestilliert und die konzentrierte wässerige Lösung wird dann lyophilisiert, wobei man bei beiden Verfahren Deacetoxy- cephalosporin C als festes Rohprodukt erhält.
Die rohe Präparation von Deacetoxycephalosporin C wird durch Chromatographie über Cellulose oder
Silikagel oder über andere geeignete nicht ionische Adsorbentien weiter gereinigt. Das Deacetoxycephalo- sporin C wird aus der Säule mit Aceton : Wasser, 80 : 20, eluiert und viele Fraktionen werden gesammelt. Die
Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C, bestimmt durch Papierchromatographie oder Bioautogramm, unter Verwendung eines Versuchsorganismus von Pseudomonas solanacearcum enthalten, werden vereinigt und auf ein geringes Volumen konzentriert oder bis zur Trockne eingedampft.
Der stark konzentrierte wässerigeRückstand oder der trockene Rückstand wird dann in einer minimalen
Menge an Isopropylalkohol gelöst und die alkoholische Lösung wird in ein grosses Volumen an Diäthyläther gegossen. Das gereinigte Deacetoxycephalosporin C wird in Form des Salzes, das dem wässerigen Elutions- mittel, das man bei der Elution des anionischen Austauschharzes verwendet hatte, entspricht, erhalten.
Wenn beispielsweise Natriumacetat als Elutionsmittel verwendet wurde, wird das Deacetoxycephalosporin C als Mononatriumsalz erhalten. Die Salzform des Deacetoxycephalosporins C wirdfiltriertund getrock - net.
Bei dem erfindungsgemässenVerfahren verwendet man bevorzugt bei der Isolierung die folgenden Bedin- gungen. Die gesamte Fermentationsbrühe wird auf einen pil-Wert von 2 durch Zugabe von Schwefelsäure an- gesäuert und dann wird das Medium 1 h bei Zimmertemperatur gerührt. Der pH-Wert des Mediums wird dann mit Natriumhydroxyd auf 6, 0 eingestellt und das basisch gemachte Medium wird anschliessend filtriert, wobei man eine Filterhilfe verwendet, um Mycel und andere unlösliche Stoffe zu entfernen.
Das wässerige Medium wird mit n-Butanol extrahiert, um weitere Verunreinigungen zu entfernen, und dann wird das extrahierte Medium über aktiviertem Kohlenstoff chromatographiert. Die Kohlenstoffsäule wird mit Wasser gewaschen und das Fermentationsprodukt wird daraus mit 50%igem Aceton-Wasser eluiert. Das Eluat wird zu einer wässerigen Phase konzentriert. Die wässerige Phase wird über einem anionischen quaternären Ammoniumaustauschharz im Acetatzyklus, bevorzugt dem quaternären Ammoniumpolystyrolharz, das im Handel erhältlich ist und alsAmberliteIRA-68 (RohmandHaas, Philadelphia, Pa.) bezeichnet wird, chromatographiert.
Das Austauschharz wird zuerst mit Wasser gewaschen und dann werden das Deacetoxycephalosporin C und andere mitgebildete Verbindungen mit 0, 15n wässerigem Natriumacetat eluiert. Die aktiven Eluate werden an aktiviertem Kohlenstoff absorbiert und die Säule wird mit Wasser gewaschen, um wasserlösliche Salze wie überschüssiges Natriumacetat, das von den Harzeluaten mit übergetragen wurde, zu entfernen. Das Deacetoxycephalosporin C wird aus dem Kohlenstoff mit 50%igem Aceton : Wasser eluiert. Das Eluat wird dann zur Trockne eingedampft, wobei man rohes Deacetoxycephalosporin C als Natriumsalz erhält.
Das rohe Material wird bevorzugt durch Chromatographie über eine Cellulosesäure (Avicel PH 101) gereinigt. Die Cellulosesäule wird mit Acetonitril : Wasser (80 : 20) eluiert und viele Fraktionen werden gesammelt. Die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C, bestimmt durch Bioautogramme, enthalten, werden zusammengegeben und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der getrocknete feste Rückstand an Deacetoxycephalosporin C wird in einer minimalen Menge an Isopropylalkohol gelöst. Die Alkohollösung wird dann in Diäthyläther gegossen, um das Mononatriumsalz von Deacetoxycephalosporin C auszufällen.
Bei einem andern Verfahren zur Isolierung von Deacetoxycephalosporin C wird das Eluat aus dem anionischen Austauschharz in dem Acetatzyklus durch Eindampfen konzentriert und eine 20% igue wässerige Lösung aus Natriumacetat wird zu dem Konzentrat zugefügt. Das Konzentrat wird unter Kühlen gerührt, um das Mononatriumsalz von Deacetoxycephalosporin C auszufällen.
Die Salzform von Deacetoxycephalosporin C kann in die freie Säure durch Verfahren überführt werden, die man üblicherweise verwendet, um Salze in Säuren zu überführen. Beispielsweise kann das Salz über ein kationisches Austauschharz geleitet werden, wobei man die Säure in freier Form erhält.
Das Chromatographiesystem, das verwendet wird, um Deacetoxycephalosporin C in rohen Fermentationsmedien oder in Harzeluatfraktionen zu identifizieren, wird unter Verwendung von Whatman Nr. 1-Chromatographierpapier in absteigender Weise durchgeführt. Das Lösungsmittelsystem, das man zur Entwicklung verwendet, ist Aoetonitril : Wasser, 80 : 20 Vol. : Vol., wobei die Kammer mit den Dämpfen der Lösungmittelmischung, die aus n-Propanol: Pyridin: Essigsäure: Acetonitril: Wasser in Verhältnissen von
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45 : 30 : 9 : 40 : 36, ausgedrückt durch das Volumen pro Volumen, besteht, gesättigt wird.
Die entwickelten Chromatogramme werden dann als Bioautogramme verwendet, wobei man Pseudomonas solanacearcum als Mikroorganismus für die Ermittlung verwendet.
Um die Chromatographie zu vereinfachen, ist es wünschenswert, die Versuchsprobe mit einer Penicillinase zu behandeln, bevor das Chromatogramm durchgeführt wird.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel : Sporen des Organismus Scopulariopsis sp. NRRL 5715 wurden auf eine Schrägplatte aus Nähragar mit der folgenden Zusammensetzung eingeführt :
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<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol) <SEP>
<tb> Lactose <SEP> 1 <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 1
<tb> Soja.
<SEP> pepton <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> lösliche <SEP> Stoffe, <SEP> erhalten <SEP> durch
<tb> Trocknen <SEP> von <SEP> Getreide <SEP> und
<tb> Malzextrakten <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Eisen- <SEP> (n)-sulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0,2
<tb> Spuren <SEP> Minerallösung <SEP> 3 <SEP> 0,625
<tb> Agar <SEP> 2
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> gewünschte <SEP> Volumen
<tb>
1 Enzymatischer Auszug von Sojabohnenmehl
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3 Die Lösung enthält die folgenden Salze pro 100 ml entionisiertem Wasser :
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<tb>
<tb> Gewicht <SEP> Salz
<tb> 0, <SEP> 102 <SEP> g <SEP> CuSO4. <SEP> 5O <SEP>
<tb> 4 <SEP> 2
<tb> 0, <SEP> 018 <SEP> g <SEP> FeS04. <SEP> 7H20 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 126 <SEP> g <SEP> MnC12. <SEP> 4H20 <SEP>
<tb> 0,024 <SEP> g <SEP> ZnSO4. <SEP> 7H2o
<tb>
Die Schrägplatten wurden während 7 Tagen bei einer Temperatur von 260C inkubiert. Die reifen Schrägkulturen wurden im sterilem destilliertem Wasser bedeckt und mit einem sterilen Stab leicht gekratzt, wobei man die Sporensuspensionen erhielt.
Die Sporensuspensionen, die so erhalten wurden, wurden jeweils verwendet, um zwei getrennte sterile Wachstumsmedien der folgenden Zusammensetzung zu inokulieren :
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<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol)
<tb> Erdnussmebl <SEP> 2
<tb> Malzextrakt <SEP> : <SEP> 2 <SEP>
<tb> Maiswasser <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> Kaliumdihydrogenphosphat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Dikaliumhydrogenphosphat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Calciumchloridclihydrat <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> Spur <SEP> Minerallösung <SEP> 0,625 <SEP>
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> gewünschte <SEP> Volumen
<tb>
1 Fussnote 3 wie oben
Der pH-Wert des vegetativen Mediums wurde vor der Behandlung in dem Autoklaven auf PH 6. S eingestellt.
Die inokulierten vegetativen Medien wurden bei einer Temperatur von 26 C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung mit 250 Umdr/min mit einer Weite von 5, 08 cm während 48 h inkubiert.
Die inkubierten vegetativen Medien wurden dann als Inokulum für das Fermentationsmedium in einem Verhältnis von 1% vegetativem Medium pro Volumen Fermentationsmedium verwendet. Die sterilen Produktionsmedien, die verwendet wurden, hatten die folgende Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew. <SEP> /Vol)
<tb> Saccharose <SEP> 4
<tb> Glycerin <SEP> 1
<tb> Natriumglutamat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Erdnussmehl <SEP> 2
<tb> Eisen- <SEP> (M-ammoniumsulfathexahydrat <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Kaliumnitrat <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> Volumen
<tb>
Die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln oder Entschäumungsmitteln findet gelegentlich statt, wenn man eine Fermentation in grossem Massstab durchführt.
Der pH-Wert der Fermentationsmedien wurde vor der Sterilisation auf pH 6, 5 eingestellt. Die inokulierten Fermentationsmedien wurden dann unter Rühren bei einer Temperatur von 260C während 5 Tagen inkubiert ; während der Fermentation wurde sterile Luft
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einen Pli-Wert von 2 angesäuert. Die angesäuerten vollständigen Medien wurden 1 h bei Zimmertemperatur gerührt und danach wurde der pH-Wert mit Natriumhydroxydlösung auf PH 6, 0 eingestellt. Die Medien wurden filtriert und die wässerigen Filtrate wurden mit n-Butanol zur Entfernung von unlöslichen Stoffen in Suspension extrahiert.
Die wässerigen Phasen wurden dann durch Säulen geleitet, die mit aktiviertem Kohlenstoff beschickt waren und die Säulen wurden mit destilliertem Wasser gewaschen. Das Eluat aus der Wasserwäsche wurde verworfen. Die Säulen wurden dann mit 50%igem wässerigem Aceton eluiert. Die Eluate wurden im Vakuum bis zur wässerigen Phase eingedampft, die dann über Säulen chromatographiert wurde, die mit Amberlite IRA-68 einem quaternären Ammoniumpolystyrolharz im Acetatzyldus gepackt waren.
Die Säulen wurden zuerst mit Wasser gewaschen und dann wurde das Wasser verworfen. Die aktiven Fermentationsprodukte wurden aus den Säulen mit 0, 15n wässeriger Natriumacetatlösung eluiert. Es wur -
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den viele Fraktionen gesammelt und die Fraktionen aus jedem einzelnen Versuch, die Deacetoxycephalosporin C enthielten, wurden vereinigt.
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gramme bestimmt. In jedem Versuch wurde das folgende System verwendet : Die erste Chromatographie i wurde In absteigender Weise unter Verwendung von nichtbehandeltem Whatman Nr. 1 Chromatographie- papier durchgeführt. Als Elutionslösungsmittel verwendete man Acetonitril : Wasser (80% : 20%).
Der Boden der Chromatographiekammer war mit einer Lösungsmittelmischung, die 300 ml einer Lö- sung aus 37, 5% n-Propanol, 25" Pyridin, 7, 5% Essigsäure und 30% Wasser enthielt und die auf 100 ml mit
Acetonitril verdünnt war, beschichtet. Die Lokalisierung von Deacetoxycephalosporin C auf dem Chromato- gramm erfolgte, indem man ein Bioautogramm mit dem entwickelten Chromatogramm durchfdhrte und als
Feststellungsorganismus Pseudomonas solanacearcum verwendete.
Die Fraktionen, die nach dem oben beschriebenen Chromatographieverfahren erhalten wurden und De- acetoxycephalosporin C enthielten, wurden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden dann auf einer
Säule absorbiert, die mit aktiviertem Kohlenstoff geftillt war, und dann wurde die Säule zuerst mit destillier- tem Wasser gewaschen, um lösliche anorganische Stoffe, beispielsweise Natriumacetat, zu entfernen. Da- nach wurde die Säule mit 50% igem wässerigen Aceton elulert. Das Eluat wurde Im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man eine rohe feste Präparation von Deacetoxycephalosporin C-natriumsalz erhielt.
Das rohe Material wurde weiter durch Chromatographie über einer Säule gereinigt, die mit Cellulose (Avicel PH 101) gepackt war. Das Antibiotikum wurde aus der Cellulosesäule mit einer Lösungsmittelmi- schung, die Acetonitril : Wasser (80 : 20) enthielt, eluiert. Es wurden viele Fraktionen gesammelt und dann wurden die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthielten, vereinigt, wobei man zur Feststellung das oben beschriebene Chromatographiesystem verwendete.
Die vereinigten Fraktionen wurden dann zur Trockne eingedampft und der trockene Rückstand, der De- acetoxycephalosporin C enthielt, wurde in einer minimalen Menge Isopropanol gelöst. Die Alkohollösung wurde in eine Äthermenge gegossen, die ungefähr das 20-fache Volumen der Isopropanollösung hatte. Unter
Rühren bildete sich das Natriumsalz von Deacetoxycephalosporin C als Niederschlag. Der Niederschlag wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet, wobei man 126 mg des Antibiotikum als Natriumsalz erhielt.