DE1795777A1 - Verfahren zur herstellung von antibiotika - Google Patents

Description

Dr. F. Zumsteln ββιΐ. · Dr- E. Anumann · / α 5 / / / Dr. R. Koenlgsberger - Dlpl.-Phye R. Holzbauer - Dr. F. Zumsteln Jun. PATENTANWÄLTE TCLfFON SAMMELN« Z35341

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GLAXO LABORATORIES LIKITiJl), Grecnford, Middlesex, England

Verfahren zur Herstellung von Antibiotika

Die Erfindung betrifft Verbesserungen bezüglich, der Herstellung von Abbauprodukten von Cephalosporin G und Derivaten davon.

Cephalosporin C ist ein Antibiotikum der Struktur

_/CH₂ -

CH₂.0.COCH₃ CGOOH,

\fH - N

I I

CK - CO

X¹

worin X· eine c-Aminoadipoylaininogruppe iat. Derivate von ' Cephalosporin C_f in welchen die Seitenkette X¹ eine andere

Acyläminogruppa als ©ine a-Aminoadipoy'laminogruppe ist, z. B.

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ORIGINAL INSPECTED

eine Phonylacetaminogruppe oder eine Thienylacetamidogruppe, oder in denen der Amidostickatoff weiter substituiert ist, können ebenfalls Über 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) hergestellt werden» und der Ausdruck "Derivate von Cephalosporin C^w bedeutet hier auch Derivate dieser Art sowie 7-ACA selbst. Beispiele anderer Varianten der Seitenkette.X» sind unter anderem in den belgischen. Patentschriften 635 137, 641 338, 645 868, 645 869 und 650 445 beschrieben.

Cephalosporin C ist ein Derivat der bioyclischen Verbindung Cepham, welche folgende Struktur aufweist:

CHn — CH nCHn

I I I

C^—-N^{5 5}CH₉ . \ ²

^CH2

(vgl. J.A.C.S., 84 (1962), Seite 3400) und wird wie angegeben beziffert. Die hier verwendeten systematischen Bezeichnungen für die Cephalosporin-Derivato beruhen auf dieser Molekularetruktur.

Cephalosporin C und dessen Derivate können einer enzyraatisehen Hydrolyse unter Verwandung einer aus Orangenschale stammenden

Eeteraee (britische Patentschrift 966 222) unterv/orfen werden, um Produkte zu ergeben, worin die Acetoxygruppe durch eine Hydroxygruppe ersetzt ist, und aus darartigen Produkten können

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Analoge von Cephalosporin C und dessen Derivaten hergestellt werden, die statt einer Aoetoxygruppe beiepielaweise andere Acyloxygruppen oder Alkoxygruppen aufweisen. Solche Analogen eind von Interesse, da mehrere von ihnen im Vergleich mit Cephalosporin C eine modifizierte V/irk3amkeit besitzen.

Die enjsymatische Hydrolyse von Cephalosporin C und dessen Derivaten mittels der Citrusesterase ist unbequem, vor allem, wenn man in größerem Maßstab arbeitet, da eine sehr große Anzahl von Orangen erforderlich ist, um ausreichend Enzym zur Hydrolyse selbst kleiner Mongon 2U erhalten.

Ee wurde gefunden, daß Weizenkeimesterase und Esterasen, die aus Specie3 der Genus Rhizobiura stammen, zur HydroJ.yce von Cephalosporin C und dessen Derivaten zu den entsprechenden Hydroxyiaethy.lvcrbindungen befähigt sind. Die Verwendung von Weiizenkoiraesterase iet besonders zweckmäßig« da sie loleht in verhältnismäßig großem Maßstab erhalten werden kenn.

Die Verwendung eines Mikroorganismus als Quelle von Enzym ist auch besonders zweckmäßig, da im allgemeinen tier Organismus leicht in großem Kaßstab durch ar. nich bekannte Arbeitsweison, die in der Fernentationsinduatrie gut ein&eführt sind, gezüchtet werden kann. Die ensyiaatiseho Hydrolyse kann beispielsweise einfach bewirkt worden, indem der Organismus mit dem Cephalosporin C oder dom Derivat davon inlsublert wird, oder, wae bevorzugter ist, der OivjaniBnms kann geaUchtet v/erden und esterase-

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haltiges Material daraus hergestellt werden, das fUr eine anschließende Hydrolysestufe benutzt werden kann.

Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel

/₂. OH
_V . . .
G.COOH II,

CH - CO

worin X eine Acylamino- oder eine Amino(NH₂)-gruppe bedeutet, durch Hydrolyse von Verbindungen der Formel

.CH₂.0.COCH₃
S CCOOH I,

Njh - vf

CH - CO
t

in welcher X die oben angegebene Bedeutung besitzt, mittels einer EstGrace, wobei eich das Verfahren dadurch auszeichnet, daß man ale Esteraae WeiaenkeiEOGteraae oder eine von einer Species der Genus Rhisobiura strjnmeiide Ksteraoo verwendet.

erTtSc wii'd voraugswtioe als estei'acehaltige Extrakte von Y/eizenkcim vorv/endet. Solche Extrakte v/erdcn £;v/eckm£ßig hergestellt, inclera man Veizenkeim duroJi Extraktion mit einem

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Kohlenwasserstofflösungsmittel» κ· Β. Petrolather, entfettet. Der entfettete Weizenkeim kann dann als solcher verwendet werden, oder das Enzym kann aus dem festen Rückstand durch Extraktion mit Wasaer extrahiert werden, wobei sioh die erhaltenen wässrigen Extrakte zur direkten Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren eignen. Ein Verfahren zur Herstellung von Extrakten von Weitenkeimesterase 1st beispielsweise von Singer et al. in Arch. Blechern, und Biophys. JI8, 229 (1948) beschrieben.

Bakterien der Genus RhiEobium sind bekannt als die Stickstoffbindenden Bakterien, die sich in den Wurzelknollen von verschiedenen Leguminosen?flanzen, z. B. Klee (l'rifollum)» Lupine (Lupinus) und SUßbohne (Lathyrus odoratus) finden. Zu Species der Genus Rhizobium, bei welchen gefunden wurde, daß sie eine Esterase des gewünschten Typs bilden, gehören Rhizobium trifolii, Rhizobium lupinii, Rhizobium Japonicum, RhizobiuM leguminosarum und Rhizobium phaseoli.

Im allgemeinen scheint die gewünschte Rhißobiiuneeterase am besten aus einer Wildkultur eines Organiomus der Genus Rhizobium abzustammen (das heißt olnes Stammes, der direkt von einer Pflanze isoliert wurde), und in einigen Fällen wurde gefunden, daß unaufriederistellendo Ergaonisse erhalten warden können, wenn man einen Organismus verwandet, der aus einer KultursamntluTiß (culture collection) stemmt, möglicherweise aufgrund einer Mutation deo Organismus unter den Bedingungen, unter welchen er

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in der Sammlung gehalten wird. Die Isolation des Organism» aus natürlichen Quellen kann naoh Nethoden durchgeführt werde*, wie sie yon Buchanan et al. in "Bacteriology", 5* Auflage, The Nacmillan Co. New York, 1951, beschrieben sind.

Bis jetzt wurden beste Ergebnisse durch Verwendung von Rhizobium trifolli erhalten, das als Staune vom wilden Typ aus Trifolium dubium isoliert wurde. Solche Stämme entsprechen der Beschreibung von Rhizobium trifolii, die von Bergey in "Manual Of Determinative Bacteriology", 7. Auflage, Ballere» lindall and Cox, London, 1957» Seite 295, beschrieben sind. Es wurde jedoch festgestellt, daß zusätzlich zu den von Bergey angegebenen Merkmalen Stämme .von R. trifolii, die sich als besonders brauchbar zeigten, ein wasserlösliches rotes Pigment auf Mannit·»Agar bilden.

Vie oben angegeben, kann die erfindungsgemäße Hydrolyse von Verbindungen der obon beschriebenen Formel I einfach durch Inkubieren des Rhizobium-Organiemus mit der zu hydrolysierenden Substanz durchgeführt werden, oder indem man alternativ zuerst den Organismus züchtet und dann ein enzymreiches Material daraus herstellt, dae man in einer getrennten Hydrolysestufe vorwendet· Die zweite dieser Arbeitsweisen wird bevorzugt.

Organismen dor genus Rhizobiuia können auf Üblichen Medien entweder mittels Oberflächenkultur odor aerober Submerskultur* gezüchtet werden, wobei letztere bevorzugt wird. Geeignete. Medien sind beispielsweise von Levine et al. in "A compilation

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of culture media for the cultivation of micro-organisms", The Williams and Wilkine Co., Baltimore 1930, unter dem Stich- _t wort "nitrogen fixation" (Stickstoffbindung) beochrieben. Ein Medium auf der Basis von Fleischextrakt und Fepton hat «loh als.sehr zufriedenstellend gezeigt. Ein.anderes Medium, das verwendet werden kann, ist ein solches auf der Basis von Hefeextrakt, Mannit und üblichen Näbrealzen. Im allgemeinen liegt der Stickstoffgehalt des Mediums vorzugsweise zwischen 0,1 und 0,3 £ N, z. B-. 0,2 + Yt, Kohlehydrate können nach Erfordernis zugegeben werden/

Zur Durchführung der Hydrolyse der Verbindung der Formel I la einem Züchtungemedium wird die Verbindung einfach in das Medium einbezogen, und der Organismus wird in Üblicher VeIse gezüchtet.

Um ein ensymhaltiges Material aus einer Züchtung einer Species der Genus Rhizobium herzustellen, wird die Züchtung durchgeführt, um ein reichliches Wachstum zu liefern, wobei eine Züchtungszelt von etwa 24 Stunden im allgemeinen zufriedenstellend ist. Die Zellen können dann geerntet werden, beispielsweise durch Zentrifugieren und anschließendes Waochen· Die isolierten Zellen werden dann einer Behandlung mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel zur Entfernung von V/asser und Fett unterworfen. Geeignete Lösungsmittel sind mit Wasser mischbare Ketone, z. B. Aceton, und mit Wasser mischbare Alkohole, z. B. Äthanol. Eine solche Behandlung kann beispielsweise durohgeführt werden, indem man die isolierten Zellen wieder in Wasser

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suspendiert, und die erhaltene Suspension in einen großen Überschuß des mit Wasser mischbaren Lösungsmittels gießt und anschließend rührt. Die erhaltene Festaubstanz kann mit frischem Lösungsmittel gewaschen werden und ist dann fertig zur Verwendung.

Die erfindungsgemäße Hydrolyse einer Verbindung der Formel I (wie eingangs definiert) unter Verwendung einer oben beschriebenen eneymhaltigen Festsubßtanz aus Rhisobium oder unter Verwendung rqn Weizenkeiuzesterase kann in wässrigen Medien, vor-EUgeweiee bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8, durchgeführt werden. Wenn 7-ACA dae Substrat ist, wird der pH-Wert vorzugsweise bei etwa 6,45 gehalten. Die enzymhaltige Feβteübstanz aus Rhizobium kann im Wasser suspendiert und für eine kurze Zeit inkubiert werden, um die Zellen zu hydratisieren. Die Verbindung der Formel I wird dann zugegeben, zweokmäßigerweise als Salz, z. B. dao Natriumsair;. Der pH-Wert wird dann rasch auf den gewünschten Wert eingestellt. Die Hydrolyse wird dann durchgeführt, indem man d&a Gemisch bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise zwischen 20 und 45° C, hält, bis die Hydrolyse beendet ist. Die Beendigung der Hydrolyse kann festgestellt v/erden, indeu 5:an von Zeit zu Zeit einen Anteil des Roaktionsgemisches mit Alkali titriert.

Der pH-Wert kann mit fortschreitender Hydrolyee eingestellt werden, um ihn innerhalb der gev.'ünschten Grfmze zu halten, indem man Alkali zur Neutraliclerung dor gebildeten Eedigsäuro

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zugibt. Wenn bei dieser Arbeiteweise die theoretische Menge an Alkali, die dem Aoetatgehalt der eu hydrolyeierenden Verbindung entspricht, verbraucht ist, kann die Reaktion als beendet betrachtet werden. Die Beendigung kenn auoh duröh ch.romatographieche Analyse verfolgt werden.

Die Hydrolyseprodukt«? können durch übliche Methoden gewonnen werden, wobei das tatsächliche Verfahren von der Art des Produktes abhängt. Als Vorstufe wird die Hydrolyseflüssigkeit vorzugsweise Euerat zur Entfernung von Protein daraus, z. B. durch Zugabe eines Proteinfällungemittels, wie eine3 mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie Aceton oder Methanol, und anechlie-Bende Abtrennung des gefällten Proteine, e. B. durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren, behandelt.

Bei Lösungsmittel-löslichen Hydroxymethylderivaten von Cephalosporin C, z, B. 7-PhenylacetamidQ-3-hydroxymethyl-ceph-3-eia-4-eäure und 7-(Thienyl-2¹ -acetamido)~3-hydrcxymathyl-ceph-3-βη-4-säure, kann die Kultur aus der Hydrolyse (unter Verwendung entweder lebender Organismen oder einer enzymhaltigen Festsubstana) bei einem saueren pH-Vert der Extraktion mit einem mit Wasaer nicht mischbaren Lösungsmittel für das gewünschte Produkt unterworfen werden. Die Extraktion wird vorzugsweise bei einem pH~V/ert von 3-4- durchgeführt. Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören beispielsweise Esterlösungsmittel, 2. B. Äthylacetat oder Eutylaeetat, und mit Wasser nicht mischbare Ketone, β. B. Kethylisobutylketon. Die so erhaltenen Lösungomittelextrakte !können mit Wasser, aweckmäßigerv/oiao bei einem pH-Wert von

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6 - θ, ε. B. etwa 7,5, reextrahiert v/erden, und das gewünschte Produkt kann gewonnen werden, z. B. durch lyophilisieren, oder die Lösungsmittelextralcte können sur Trockne verdampft werden. Das erhaltene Produkt kann nach Wunsch umkristallisiert werden. Im Falle von Produkten, die nicht in Lösungsmitteln löslich Bind, z. B. 7-(D-5'-Ainino-5^l-carboxypentanamido)~3-hydroxymethyl-ceph-3~em-4-säure und 3-Hydroxyniethyl~7~&iöino-ceph-3-em-4-säure, kann das Reaktionsgeniisch zuerst zur Entfernung von Protein und anderem hochmolekularen Hateri.il wir oben beschrieben behandelt werden. Das gewünschte Produkt kann dann durch Adsorption aus einem geeigneten Anionenaustauacherharz aus gepufferter Lösung und anschließende Elution gewonnen werden. Die erhaltenen Extrakte können aufgearbeitet werden, un die gewünoch" te Substanz zu gewinnen, beispielsweise lyophilisiert,und weiter nach Wunsch behandelt werden.

3-Hydroxyiaethyl~7-ainino-ceph-3-em-4-säure (das Reaktionsprodukt von 7-ACA) wird zweckmäßiger gewonnen, indem man den pH-Wert des Reaktionsmediums auf den ieoelektrischen Punkt des Produktes, das heißt einen pH-Wert von etv/a 4,5t einstellt, um die Ausfällung des Produktes zu bewirken. Der Niederschlag kann dann abfiltriert oder absentrifugiert und gewaschen v/erden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie au beschränken.

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Vorarbeiten;

Wenn wässrige Weizenkeimeeterase in den Beispielen verwendet wird, wurde diese wie folgt hergestellt:

100 g Weizenkeim wurden durch Extraktion mit 3 χ 5 Volumen niedrig-siedendem Petroläther (Kp 40 - 60° C) entfettet und dann an Luft trocknen gelassen. Me entfetteten Weizenkeime wurden dann mit 1 Liter Waeser bei 4° C 15 Hinuten gerührt und bei 0° C 20 Minuten bei 1800 U.p.M. (1100 x g) zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann entweder sofort bei den Versuchen verwendet oder im Tiefkühlschrank aufbewährt, bis sie gebraucht wurde.

Herstellung von Rhizobium-acetylesteraBe-haltigen Festsubetangen

a) Schütte If IaBChOTkU-ItUr₁ Aus Trifolium dubium durch Züchtung von oberflächenaterilisierten Wurzelknollenabschnitten auf Nähragarmedlum isoliertes Rhizobium trifolii wurde auf Nähragarachrägschnitten gehalten. Zellen aus einem Schrägachnitt wurden in 10 ml sterilem Wasser, suspendiert und zur Beimpfung von 10 x 40 ml Flaschen von Hährbrühe, wie nachfolgend unter b) beschrieben, verwendet. Lie Flaschen vmrden auf einem DrehBchüttler 2 Tage bei 26° inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 5° geerntet, einmal mit Ringerlösung gewaschen und wieder zur Bildung eines dicken Zellbreies

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Der Zellbrei aus 200 solcher Flasohen wurde in 50 ml Wasser verteilt und in 1 Liter kräftig gerührtes Aceton gegossen. j* Das Rühren wurde bei Zimmertemperatur 30 Minuten fortgesetzt, worauf die trockene Zellmasse durch Filtrieren gewonnen wurde. Nach Waschen mit frischem Aceton und Äther wurde der Filterkuchen an der Luft getrocknet. Ausbeute » 8,0 g.

b) Züchtung in Laboratoriumsferraentationsgefäßen. Der gleiche Stamm von Rhizobium wurde auch in 5-Liter Fermentationsgefäßen wie folgt gezüchtet:

120 g ^MLab.Lemco"-Fleischextrakt, 120 g ^MOxoid^M-Pepton und . 60 g Natriumchlorid wurden in 12 Liter Leitungswasser gelöst und 30 Minuten gerührt. Der pH-Wert wurde mit 12,5 ml 1Qn Natriumhydroxyd auf 7,2 eingestellt« Bann wurden Mengen von 3x3 Liter in 5-Liter Fermentationegefäße unter Rühren Eusammen mit 3 ml 30 tigern (Vol./YoI.) "Foamrex" (Mobil Oil Co.) in weißem Mineralöl, um als Antischaummittel zu wirken, eingefüllt. Die Feroentationsgefäße wurden 30 Minuten bei 1,05 at (15 psi) sterilisiert. Jedes Fermentationsgcfäß wurde mit 20 ml aus einer 24 Stunden alten Nährbrühkultur des Organismus beimpft und bei 26° inkubiert· Das Feraentationagefäß wurde mit 6 Liter/Hinute belüftet und mit 600 U.p.M. gerührt. Die Fermentation v.-urde bei 46 Stunden abgebrochen, wo der pH-Wert auf 8.90 gestiegen war. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 5° C geerntet, einmal mit Ringerlösung gewaschen und wieder in 50 ml Wasser suspendiertI Die Suspension wurde in 1 Liter Aceton gegossen und bei

Zimmertemperatur 30 Minuten gerührt. Der Niederschlag wurde

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filtriert, mit frischem Aceton und ither gewaschen und an der Luft, getrocknet, was ein enzymhaltiges Pulver ergab. Ausbeute β 11,6 g. -

c) Eine alternative Nährbrühe für die Kultur der Rhizoblum species ist wie folgt:

lfDifco"-Hefeextrakt	50 g
Mannit	50 g
K2HPO4	1 β
MgSO4	1 β
NaCl	1 β
CaCl2.6H2O	1 β
PoOl3	Spur
Wasser	ad 5 1
Der pH-Wert wird mit KaOH auf 7,1	eingestellt.

Es sei darauf hingewiesen, daß die Bezeichnungen "Difco", "Araberlite", "Oxoid", "Lab.Lomco", "Nujol", "Poamrax" und "Whatman", die in den Beispielen und dem einleitenden Abschnitt verwendet werden, eingetragene Wareneeiohen sind·

Der in den Beispielen erwähnte Thienylreet ist der 2*-Thienylrest» . .

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Beispiel 1;

Herstellung von 7-(D-5'-Amino~5^l-oarboxypentanamldo)-5-hydroxyftethyl~ceph"3~*en-4-8äure

1,62 g Cephalosporin C-NatriumsalE (etwa 80 jtig rein) wurden in 325 ml Weisenkeimextrakt gelöst und der pH-Wert wurde auf 6,7 eingestellt. Diese Löpung wurde dann bei 37° C inkubiert, und der pH-Wert wurde mit In NaOB in stündlichen Intervallen eingestellt. Hach 4 Stunden war die theoretische Menge an 1n WaOH (2,4 al) zugegeben, was einer vollständigen Frelsetsung der Besigeäure entsprach.

Dann wurden 2 Volumen Aceton eugegeben und das ausgefallene Protein wurde absentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit' wurde dann im Vakuum bei 30° C auf ein Volumen von 28 ml einge-* engt. laoh der Zugabe eines gleichen Volumens 0,6n Pyridinaoetat bei pH 5,0 wurde die Lösung oben auf eine Säule von Amberlite XB58-Harz in der Acetatfora gegeben, die in 0,3n wässrigem Pyridlnaoetat bei einem pH-Wert von 5,0 gepackt war. Die Blution wurde mit 0,3n wässrigem Pyridinaoetat bei pH 5»0 begonaen, und es wurden 25 ml Fraktionen gesammelt, wobei das Produkt in den Fraktionen 24 - 54 nach der Nlnhydrinmethode festgestellt wurde. Diese Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Die Festsubstans wurde in 15 ml Wasser gelöst und durch Zugabe von 100 ml trockenem Aceton ausgefällt. Bach Mehlen su einem Pulver unter trockenem Aceton wurde die Festsubstans in 20 ml Wasser aufgenommen, der pH-Wert wurde mit 1n IaOQ auf 7,5 eingestellt und die Lösung wurde gefriergetrocknet.

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Die 850 mg des so erhaltenen Feststoffes wurden in 7,5 ml Wasser gelöst und 17 ml Äthanol langsam zugegeben. Ee wurde ein gefärbter Niederschlag erhalten, der verworfen wurde, und die Kristallisation wurde in der überstehenden Lösung durch langsame Zugabe von weiterem Äthanol angeregt. Das Produkt wurde mit Äthanol und Äther gewaschen und im Vakuum über CaCIg getrocknet. Ausbeute =■ 435 mg.

200 mg wurden aus wässrigem Äthanol kristallisiert, vonach das Produkt die folgenden Eigenschaften hatte: » 260 ayu E]£_m 260 m/U »

Analyse; C₁^H₁₈O₇HjS.Na · 3,5

Berechnet: C 36,7 H 5,5 N 9,4 S 7,0 * Gefunden: 36,4 5,8 9,51 6,89 ?·.

Bine Spur Cephalosporin C (< 2 ^e£) kennte durch Bioautographi·

in Methanol auf feuchten, auf pH 6,0 gepufferten Papieren, die 16 Stunden entwickelt und auf Vibrio oholerae-Plßtten Inkubiert waren, nachgewieeen werden·.

Beispiel 2: .

Hör3tellurig, von 7~JPhei<ylacotsmido-3-hy<lro:cyaethyl~ceph-3~

.i 25 ß Natriuic-T-phenylacetamidocephalosporanat wurden in 5 Liter

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wässrigem Weizenkeimeeterasepräparat gelöst. Der pH-Wert wurde auf 6,7 eingestellt und das Gemisch bei 37° C 4 Stunden inkubiert, wobei der pH-Wert in 1-etUndigen Abständen mit 1n Natriuohydroxyd auf pH 6,7 eingestellt wurde. In 4 Stunden waren 87 # der theoretischen Aufnahme von 61 ml erforderlich und die Reaktion wurde nach der Chromatograph!sehen Untersuchung als beendet betrachtet.

Nach Einengen im Vakuum bei 18° C auf ein Volumen von 1600 ml wurde das Protein in der Lösung durch Zugabe von 2 Volumen Aceton und anschließendes 10-minütiges Zentrifugieren bai 1500 U.p.M. ausgefällt. Der Niederschlag wurde mit 1 Liter 66 tigern Aceton in Wasser gewaschen, und die Waschflüssigkeiten wurden mit der überstehenden Lösung vereinigt. Die Lösung wurde dann im Vakuum auf ein Volumen von 1500 ml eingeengt und mittels Filtrieren durch eine Aebestschicht geklärt.

Die Extraktion der 7-Phenylacetamiäo-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-säure wurde durch Einstellung des pH-Wertes der wässrigen Lösung auf 3»5 mit 10 ?»iger Phosphorsäure und Extraktion in 3x1 Volumen Äthylacetat bewirkt. Dann wurde sie in 3 x 750 ml Wasser durch Zugabe von 1n Natriumbicarbonat zur wässrigen Phase bis der Gleichgewichta-pH-Vtert 7,0 betrug, zurückextrahiert. Der Überschuß an Natriumbicarbonat wurde durch Behandlung mit überschüssigem Amberlite IRC 50 (H*)-Harz zerstört, die Lösung im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, was .

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Hf34 g amorphes Natrium-7~phenylacetamido-3-hydroxymethyloeph~3-em-4-oat von 62 ^iger Reinheit ergab.

Die Kristallisation wurde vorgenommen, indem diese Peateubstanz mit 500 ml Methanol extrahiert und die Lösung dann langsam eingedampft wurde, was in der ersten Ausbeute 3»266 g Material (95 ^ rein) und in dor zweiten Ausbeute 4,3 g (65 ?« rein) ergab. Die Reinheit dieser Proben wurde durch UV-Absorption bestimmt, wobei ein theoretischer Wert von Ε« _Λ « 260 m/U

ι cm /

= 240 für diese reine Substanz angenommen wurde.

Beispiel 3;_

Herstellung von 7-ThienylaoatRmido-3--hydyoxyiffie1;h.yl--eeph--

3,63 g 7-Thienylacetanido-cephalosporansäure wurden in 50 ml Wasser unter Zugabe von 1n Natriumbiearbonat, bis der pH-Wert 7fO betrug, gelöst. 700 ml wässrige Weizenkeimesteraselösung wurden zugegeben, und das Gemisch v/urde bei 37° C 4 1/2 Stunden inkubiert, wobei der pH-V/ert bei 6,3 gehalten wurde. Drain wurden 1200 ml Aceton unter Kühren zugegeben und das ausgefallene Protein dur^h Filtrieren entfernt. Das FiItrat wurde im Vakuum bei 30° C auf 250 ml eingeengt, dor pH-Wert wurde mit verdünnter Phosphr.rnäure auf 3φ5 eingestellt und die Lösung wurde mit 3 x 250 ml Allylacetat extrahiert. Die rereinigten Extrakte wurden' dann mit 3 x 50 ml H₂O untsr Zugabe von tn NaHCO,-Lösung bei jeder Extraktion, bio der pH-Wort im Gleichgewicht 7,0 betrug, rückextrohiort. Diese vereinigten Extrakte wurden von

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überschüssigem HaHCO, durch Zugabe von "Amberlite" IRC 50 (H⁺) befreit, bis der pH-Wert auf 5_f8 fiel. Beim Gefriertrocknen wurden 2,76 g einer amorphen Festsubstane erhalten. Biese wurde in 110 ml Methanol gelöst, durch Zentrifugieren geklärt und dann langsam eingedampft, bis die Kristallisation einsetzte. Diese war nach 24 Stunden bei 4° C beendet, was 926 mg einer kristallinen Pestsubstanz ergab.. "^_max ~ 235 m/U, EJ' = 235 m/u « 278.
Angenommene Reinheit, bezogen auf UV-Absorption, « 90 #.

Beispiel 4:

Herstellung von 7-Bensylthioaoetaffliäo~'3--hydroxymethyl-ceph-3-em-4~saure

4 g 7-Benzylthioacetamido-~cephalosppransaucres Natriums al ζ wurden in einer Enzymlösung gelöst, die aus 100 g entfetteter Weizenkeirae, wie oben beschrieben, erhalten war. Der pH-Wert wurde sofort mit 1n Natriurahydroxyd auf 6,7 eingestellt und das Ganze bei 37° inkubiert. Bor pH-Wert v/urde in Zeitabständen mit 1n Natrluinhydroxyd auf 6-7 eingestellt und die Reaktion beendet, wenn kein weiteres Alkali mehr verbraucht wurde.

Das Inkubat wurde mit 2 Volumen Aceton gerührt und das ausgefallene Protein abfiltriort. Aceton v/urde dann vom Piltrat durch Einengen im Vakuum bei 30° C entfernt. Die erhaltene wässrige Lösung wurde mit kenzentrierter Phosphorsäure auf

pH 2,5 eingestellt und mit 3 x 1 Volumen Äthylacetat extrahiert, wobei der pH-Wort nach Erfordernis wieder eingestellt wurde.

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Die Äthylaeetatschiehten wurden abgetrennt und sofort in 1/5 Volumen Wasser zurücke?ctrahiert, das so viel gesättigte Natriuiabicarbonatlösung enthielt, um die wässrige Schicht auf pH 7»0 iu bringen. Die vereinigten wässrigen Schichten wurden dann mit ^wAmberlite" IHC 50-Harz (Rohm und Haas Co.) auf einen pH-Wert von etwa 5,0 eingestellt; des Harz wurde abfiltriert und das Piltrat lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 2,84 g.

Die Analyse durch UV-Spektroskopie zeigte eine Reinheit von 68 i>. Die· Chromatographie in Ithylaoetat-pH 5,0-Natriumaoetat-Puffersyetera und die anschließende Bioautographie auf Staphylococcus aureus-Platten zeigten nur einen Pleoken, welcher der Hydroxyeäure entsprach.

Das Produkt wurde weiter durch Solventextraktion gereinigt.

Die oben erhaltene Peetsubstanz wurde in 100 ml Wasser gelOet und der pH-Wert wurde wie vorher auf 2,5 eingestellt. Die Hydroxysäure wurde in Äthylacetat aufgonommen, indeia eie mit 3 x 50 ml Lösungsmittel geschüttelt wurde. Dann wurde sie in 50 ml Wasser reextrahiert, welches die theoretische Menge an Natriumbioarbonat enthielt (420 mg). Die Äthylacetatschicht wurde dann mit 50 ml Wasser gewaschen, dae etwas gesättigtes Natriumbicarbonat enthielt.

Die wässrigen Schichten wurden vereinigt, der pH-Wert wurde mit "Amberlite" IRC 50-Harz wie vorher eingestellt und dann wurde

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lyophilieiert. Dies ergab ein Produkt, das nach der UV-spektroskopisohen Analyse eine Reinheit von 79 i» aufwies.

Die Endreinigung wurde durch Kristallisation bewirkt. Die obige Peatoubstanz (110 mg) wurde in einem Gemisch von 2 ml Dimethylsulfoxyd und 2 ml Methanol durch gelindes Erwärmen gelöst. Nach Filtrieren wurden 6 ml Äther «ugögeben und beim Abkühlen und Kratzen schieden sich Kristalle bus. Diese Kristalle wurden gewonnen und schienen nach der UV-Analyse rein su sein.

»Ι«"²⁴⁰
Beispiel 5:

(Alternatiwerfahren eu Beispiel 3)

Weizenkeime wurden entfettet, indem sie in eine chromatographieo.ae Säule gepackt wurden und Petroläther (Kp 40 - 60°) duroh ei-3 perkolieren gelassen wurden, bis das Bluat farblos war. Die ge trockne tun Keime vmrdon in einem Polythenbeutel bei Zi.siaertemper&tur aufbewahrt.

Kino Suspension von 250 g qntfettsten V/eizenkeiaen in 2 Liter destilliertem Wasser v/urde unter Rühren auf 37° C erwärmt. 30 g Natrium-V-tiiienyip-ceteiaido-coplialosporanat wurden zugegeben und das Gemisch wurde 3 Stunden bei 37° gehalten. Während dieser Zeit wurde der pH-V/ert duroh Zugabe von 2n Natriumhydroxydlösung bei ö,6 - 6,9 gehalten. Dann wurden 3 Liter Aceton

RAD 509812/1046 ^BAD

zugegeben, um Proteine auszufällen, und die ausgefallene Feetsubetans wurde durch Vakuurafiltrieren entfernt und gründlich mit Wasser gewaschen. Das Piltrat v/urde im Vakuum auf etwa 3 Liter eingeengt, bevor eo mit 2 χ 500 ml Äthylacetat gewaschen wurde, um jegliches neutrales Material zu entfernen. Die klare wässrige Schicht wurde abgetrennt, mit 1 Liter Athylacetat bedeckt und mit airupöeer Phosphorsäure auf pH 3,5 angesäuert. Während des Ansäuerna wurde das Gemisch kräftig gerührt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wässrige Schicht gründlich mit 2 χ 500 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salseole gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Während des Eindampfens schied sioh die kristalline 3-Hydroxymethyl-7-thienylacetamidoceph-3-em-4-8üure aus und würde abfiltriert* Ausbeute « 13,4 g

(~3 %)· Einengen des Piltrats ergab eine weitere Ausbeute von 0,5 g an weniger reinem Material.

Dcο Produkt v.airde aus Methanol imkriots.lliaiert. Es hatte dann

einen Schmelzpunkt von 205 - 215° C (Zersetzung), .I&]£³ =* +■ 138° (Methanol, c - 1,0), A_ranv (Phoephatpuffer, pH 6) 2Ϊ6 m/u O^_cm * 396, £ « 14 000), Infusion Lei 259 nyu UV" - 251, Β -- S 950), ^ (Nujol) 3400 (OH), 3220 (IiH), 1760 (ß-Iactoiii), 1720 (-COOII), und 1652 und 1555 cm""¹ (-CONH).

H.H.n.-Sp8l;trua (DgO, UaIICO₅): 5= 2,60, 2,98, 4,40, 4,93, 5,72, 6,10, 6,33, 6,16 p.p.?.

Hv ~ 0_F06 (..hatMO.n Pc;pier iTr. 1, mit EatrciuinacGtßt auf pH- 5 gepuffert. lUaungnnitfcel: Obere Phase ÄthylaoGtat: n-Butanol :

■ - ■ 509812/1046 bad original

O,i m Natriumacetat (pH 5,0) = 8:1:8 im absteigenden System bei 38°), Rj₁ = 0,68 (n-Propanol : Y/asser = 7:3); R_p = 0,26 auf Kioselsäureplatten mit n-Butanol:Äthanol:Wasser = 4:1:5.

Analyse: °iA^HiA^N2^5^S2

Beirechnet:	C	47	,5	H	4,	0	N	7,	9	S	18,	1
Gefunden:		47	,9		4,	0		7,	6		17,	9
Beriapiel 6:	thj			enyjL·	fioe	tarn
3-Hydroxvine	ure

(Alternativverfahren zu Beispiel 2)

Die oben bezeichnete Verbindung wurde in 50 #iger Ausbeute au3 Natriuia-7-phenylacetainido--cephalosporanat unter Anwendung der in Beispiel 5 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt. Das Produkt wurde aus Äthylacotat-Methanol umkristalllsiert. P « 190 - 195° C (Zersetzung), [a]jjp - + 152° (Methanol, c = 1,0), \ (Kioepnatpuffer, pH 6) « 260 m/U i~s]^_m = 248? £ « 8 700), (Nujol) « 3 360 (OH), 3 200 (NH), 1 752 (ß-Iactam),

1 718 (COOH) iintl 1 642 und 1 548 cm""¹ (GONH). N.M.H.-Spektrum (D.,0, NaHCO₇₅): Y» 2,58; 4,35; 4,88; 5,69; 6,26; 6,45 P^p.m. Rp = 0,06 (Whatman Papier Nr. 1_T auf pH 5 mit Haoriumace^at gepuffert. Löauiigsmifctel: Obere Phase Ätliylanetat:n-Butanol: 0,Im iiatriumacetat (pH 5) - 8;1s8 im absteigenden System bei 38³ C), Rp « 0,66 (n-PropQni>i:W&Gser = 7:3).

BAD ORIGINAL

509812/1046

Analyse: O-gH	16N2°	5S	H 4,6 H 8,0 S 9,2 £
Berechnet: C	55,2		4,7 8,0 9f3 #.
Gefunden	55,2
Beispiel 7:			«dimethoxybenzamida)-ceph-3-em-4-Bäure
3-Hyd roxyme thy1-7-(2	«-6·

3-Hydroxymethyl-»7-(2·,6·-dimethoxybenzamido)-ceph-3-em-4-säure wurde aus Natrium-7-(2·,6*-dimethoxybenzamido)-cephalosporanat nach der In Beispiel 5 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt.

Das Produkt kristallisierte aua Methanol mit [aJ_D «= + 68° (Methanol, c « 1,0), λ^_βν (Phosphatpuffer, pH 6) 253 - 256 m/U

IuBX« /

²⁷⁶» ί * ¹⁰ oax.
1690 (-COOH), 1540 und 1630 (-CONH-) und 1253 cm"*¹ (Methoxyaryl); N.M.R.-Spektrum (B2O, Natriumbiuarbonat): Resonanzen bei 6,14; 2,55; 15,25t 4,19; 4,79 und 5,72 K . Chromatographische Einzelheiten: Rj, » 0,05 (\fliatnian Papier Nr. 1, mit Natriumocetat auf pH 5 gepuffert. Lösungsmittel: Obere Phase Äthylacetat tn-Butanol:0, izn llatriuinr.eetat (pH 5) = 8:1:8 im absteigenden System bei 38° C), R_? - 0,73 (ri-Propanol:WaeBer * 7:3).

Anelyse:	C1M	51	NrtO«i	1	H	4	,6	■ N	7	,1
B-31-echnet:	C	51	,7		4	,8		6	,8
Gefunden:*		,8

Verbindung neigte blaue Pluoreaxonß bei Beatrahlung mit

UV-Licht.

509812/1046 _BAo O

Beispiel B: .

a) Einwirkung von Rhlzoblum-aoetyleateraee auf 7-Phenylacetamldo-cephalOBporan3äure .

5 g Rhizobiumacetonpulver, das wie im einleitenden Teil beschrieben hergestellt war» wurden in 200 ml Wasser suspendiert und 30 Minuten bei 30° C inkubiert. 1 g 7-Phenylaoetamidocephaloeporaneaueres Natriumsalz (7PACA) wurde dann zugegeben, das Ganze wurde schnell mit 10 ^iger (Vol./Vol.) Phosphorsäure auf pH 7,0 eingestellt und eine Probe von 0,1 ml wurde für die biologische Prüfung entnommen. Das Gemisch wurde dann bei 30° inkubiert und in Zeitabständen mit 1n llatriumhydroxyd auf pH 7,0 titriert. 0_f1 ml Proben für die biologische Prüfung wurden in entsprechenden Intervallen abgenommen. Die Reaktion zeigte den folgenden Verlauf:

Zeit (Std.) zugegebene 1n NaOH (ml) Titer, an 7PACA (γ/ml bei

1/2000 Verdünnung)

0,0	0,00	2,1
0,5	0,90	1,05
1,0	1,62	0,79
1,5	2,05	0,575
2,0	2,10	-
	Theor. «2,22

Die Reaktion wurde dann abgebrochen, indem dao Ganze unter Rühren in 400 rnl Aceton gegossen wuräo. Nach 10 Minuten würde äer Niederöchlag abfiltriert. Aceton wurde vom Flltrat durch

509812/10Λ6 _{BAD of},,_G(NAL

Verdampfen unter Vakuum entfernt und der Rückstand mit Wasser auf 200 ml verdünnt. Nach Filtrieren durch ein Seitz-Filter wurde die klare braune Flüssigkeit biologisch untersucht.

b) Extraktion von 7-Pkenylacetamido-5-hydroxymethyl~ ceph-?-em-4-Bäure

Die obige Lösung wurde mit 10 #iger (Vol./Vol.) Phosphorsäure auf pH 3,3 eingestellt und sofort mit 3 x 200 ml Äthylacetat extrahiert. Der verbrauchten wässrigen Schicht wurde nach jeder derartigen Extraktion eine 0,1 ml Probe für die biologische Prüfung entnommen, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

Extrakt Nr.	1/100 Verdünnung)
0	10,8
1	6,0
. 2	3,25
3	1,44

Es wurden also etwa 87 ?» der biologischen Aktivität in das extrahiert.

ic Tvi einigten /itliylaoetaiuchich'tcn wurden dann mit 100 ial ni ■■ ■'■ ::i■*: 50 al Wasser extrahiert, das mit gecättigtör wi «·■!_< ·. .::.rbonritl;;^!vu-i? auf pH 7,5 singes teilt war. i.-er ver- ^: /-.i■'·;". :avb:natc^t- ;^t vüVuO dann ilurch 50-ir.i:;Ut^! _t>'S Ri

'.-.S812/1046 BADORIGINAL

mit "Amberlite" IRC 50-Harz (Rohm und Haao Co.) in der Waeserstofforra auf pH 5_t5 eingestellt. Das Harz wurde ebfiltriert und mit Wasser gewaschen, und die vereinigten Filtrate und Waschwässer wurden lyophilisiert. Dioe ergab das Natriumsalz von 7-Phenylacetamido-3-hydroxymethyl~ceph-3-em--4"-säure als weiße amorphe Feataubstanz (681 rag, 75 Ί» Ausbeute), daa biologißch und durch UV-Analyse in wässriger Lösung analysiert wurde.

³⁵I^COi ⁽²⁶° ^m/^u) " ^{157t5 68>5} * ^rein# Biologische Untersuchung 64,2 ^ rein.

Die liioautographle dieser Festeubstan» unter Anwendung des ursprünglichen Ä thy Iac et at-0,1m Natriuaiacstat (pH 5,0)-Systems zeigte nur eine biologisch aktive Zone an der Stelle von 7-Phcnylacetamido-3-hydro3iymethyl-ceph-3-em-4-säure.

^c) Krigtallisation des rohen Natriumsalzee von 7-PhenylacetaEiidp-3-hyaroa.ymethyl-ceph~3-em-4-Bäure

839 rag rohes, wie in Beispiel 8b hergestelltes 7-Phenylaoet-. amido~3-hyö.rüxymethyl-ceph-3-em-4-6aure8 Hatriumsalz wurde mit 25 ml, 10 ml und 4 ml Nethftfiol extrahiert und der Rückstand durch Zentrifugieren entfernt. Hie methüiiolische Lösung wurde darm gelinde in einem langsamen Luftütroni bis sur beginnenden Kristallisation eingedinjjp.ft, worauf sie 1 Stunde auf 5° C abgekühlt, \>airde. Es wurden weiß ε fecierurtige Nadeln erhalten, die noch kalt abfiltriert und n^it e-:wa3 kaltem Äthanol gewaechen wurden. T).io Ausbeute nach TrociUxen Jo Vakuum botrag 3ü0 mg.

509812/1046

BAD ORIGINAL

Dieses Produkt wurde biologisch und durch UV-Analyse wie oben untersucht.

ΕίΊ,™ (²⁶O n/u) =199 87 % rein.

ι ent j

Biologische Prüfung 92 j» rein.

Das Verdampfen der Mutterlaugen ergab eine zweite Ausbeute von 98 mg an Kristallen. Die Reinheit war jedoch viel geringer (67,5 1» durch UV, 75,8 i» durch biologische Prüfung).

Beispiel 9:

Einwirkung von IUyizobiran-acetyles tere.se auf 7- _i (Thienyl-2^tacctamido)-cephalo8poranaäure

Vie im einleitenden Teil hergestelltes Rhizobiumpulvor (5 g) wurde in 200 ml V/asser suspendiert und bei 30° C für 30 Minuten inkubiert. 1,0 g 7-(Thienyl-2^l~acetamido)-ceph^tilo3poransaures Natriumsalz (7TACA).wurden zugegeben, und da^ Gänse wurde rasch mit 10 #iger (Vol./Vol.) Plio3phorsäure auf pH 7,0 gebracht. Das Gcl isoh wurde dann bei 30° C iiikubiert und mit In Natrlumhydro- Tzyc in regelmäßigen Zeitabotändcn auf pH 7,0 titriert. In entspj'echonden Zeitabständen wurden 0,1 ml Proben zur biologischen Erv.fung abgenoDmen. Mo Reaktion zeigte den folgenden Verlauf:

60 9-812/1046 bad original

.) «ugegebene 1n SaOH g|^

0	0,00	1,68
0,5	0,90	1,05
1,0	1,60	0,81
2,5	2,30	0,68
3,0	2,30	• 0,57
	Theor. » 2,22.

Die Reaktion wurde dann durch Eingießen in 400 ml Aceton unter Rühren "beendet. Nach 10 Minuten wurde der Niederschlag abfiltriert und das Aceton au8 dem Fi!trat durch Vakuumrerdampfen entfernt. Der Rückstand wurde mit Wasser auf 200 ml verdünnt und durch ein Seitz-Filter filtriert. Das klare, braune FiItrat wurde mit 10 #iger (Vol./VpI.) Phosphorsäure auf pH 3,3 eingestellt und mit 3 x 200 al Äthylacetat extraliiert. Die verbrauchte wässrige Schicht wurde nach jeder Extraktion auf biologische Aktivität geprüft, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden:

v^+„ov+ n~ Titer an 7TACA (γ/ml Extrakt Nr. bei 1/100 Verdünnung)

0 13,2

1 7,5

2 4,95

3 2,2

Es wurden also etwa 83 # der biologinchen Aktivität in das Lösungsmittel extrahiert.

503812/1046 ^_{0 0RIGINAL}

Die Äthylacetatschichten wurden vereinigt und mit 100 ml und

2 χ 50 ml Wasser extrahiert, das mit gesättigter Bioarbonatlb'sung auf pH 7,5 eingestellt war. Der Bicarbonatextrakt wurde dann durch Verrühren mit "Amberlite" IRC 50-Harz (Rohm und Haas Co.) in der Wasserstofforin auf pH 5,5 eingestellt. Das Harz wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, und die vereinigten Filtrate und Wasehwäeser lyophilislert, was 592 mg (66 i» der Theorie) des Natriumsalzea von 7-(Thienyl-~2'-acetamido)-3-hydroxymethyl~ceph-3-em-4-3äure ergab..

Das Produkt wurde biologisch und duroh UV-Analyoe untersucht:

^E1cm *^{256 m}/^u* " ^{276 81} ^ ^reln* Biologische Prüfung 65 # rein.

Bloautographie unter Verwendung des Äthylacetat-O,1m Natriumacetat (pH 5,0)-Systems zeigt eine größere biologisch aktive Zone an der Stelle der Hydroxymethylverbindung zusammen mit einer schwachen Spur der ursprünglichen Cephalosporansäure.

Beispiel 10:

25 g 7-ACA wurden in 100 ml Wasser durch Zugabe von 110 ml 1n NaOH gelUst. Diese Lösung wurde zu 5 Liter rohem Weizenkeimextrakt zugegeben und 4 1/2 Stunden bei 37° C umgesetzt, wobei alle Stunden 1n NaOH zugegeben wurde, um den pH-Wert bei 6,45 zu halten. In dieser Zeit vnirden 51 ml (55 % der Theorie)

5Ö9812/10A6

an 1n NaOH zugegeben. Weitere 41 ml 1η NaOH wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei 22° C über Nacht stehen gelassen.

Nach Einengen im Vakuum auf 2,5 Liter bei 25° C wurden unter Rühren 5 Liter Aceton zugegeben. Der so gebildete Niederschlag wurde entfernt und das Piltrat im Vakuum auf 450 ml eingeengt. Die Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 4_t5 mit Eisessig führte zur Ausfällung des Produktes, das abfiltriert, mit Aceton und Äther gewaschen und getrocknet wurde. Aiisbeute « 10 g. (Die Mutterlaugen wurden nicht untersucht.)

Eigenschaften: UV-Abeorption λ_möV = 265 m/U (in ⁿ/40 IaHCO,)

IDcLX* / J

^E1cm *^{60 m}/^U " ⁵^ ^" ⁰⁷⁵°* Die Reinheit wurde, bezogen auf die UV-Analyse, zu 95 i» bestimmt,

Boiepiel 11:

Einwirkung.von Rhizobiuin-acetylasteraso auf 7-ACA und Cephalosporin C

Rhissobiura trifolii (wilder Stemm) vnirde in einer Nährbrühe gezüchtet und Teile der KulturflUsaigkeit wurden dann mit einem gleichen Volumen einer Lösung von entweder 7-ACA (10 mg/al) oder Cephalosporin C (10 mg/ml) in Phosphatpuffer von pH 7,0 oder von Puffer allein ge suchtet. Die zv/ei Substratlösungen wurden auch mit einem gleichen Volumen an niohtbeimpfter.Brühe gemischt, wobei letztere ale Kontrollen wirkte.

509812/1046

• BAD ORIGINAL

A].le Prtiflösungen wurden dann in einem Wasserbad bei 33° C über Nacht inkubiert. 100X Anteile wurden auf Papiere, die auf pH 6,0 gepuffert waren, aufgetupft und die ^hromatogramme wurden in 70 tigern (Vol./Vol.) wässrigem n-Propanol über »acht entwickelt.

Die Chromatogramme wurden unter UV-Licht geprüft und die absorbierenden Zonen wurden markiert. Dann wurde ein Papier mit 1m Pyridin in Aceton und anschließend mit 1 #lgein (Vol./Vol.) Plienylacetylchlorid in Aceton besprüht. Dieses Papier und ein identisches nicht besprühtes Papier wurden dann auf Platten aufgebracht, die mit Bacillus subtilio beimpft waren, Nach Inkubieren über Nacht wurden auch die biologisch aktiven Zonen festgestellt.

Ergebnisse:
(i) 7-ACA

Die Inkubation von 7-ACA mit Ganskulturen von .Rhizobiura trifolii (vilder Stamsi) führten sur Bildung einor Substana mit R- « 0,62 χ demjenigen νοη 7-AGA, clea usiß'l, en der erwarteten Stelle für die entsprechende Hyuror.yKct/iylvcrMiiaung, Überdies seigte dr.eser Fleck biologische Aktivität gegenüber B. subtilis nur, nr.chden das Popiev wit r^zoidin \κΆ Phonylucetylchlorid baoprüht werden war. Die P6piorchroi(_;ato^ra^rac zuigton, daß koin 7-ACA nc-eh der Inkubation übrig geblieben war, während in den Kontrollen 7-ÄCA fontgastsllt werden konnte. Diese Ergebnisse zcig«-n daher, daß lihisobiusi trifolii 7-ACA öss&cetylieren kann.

509812/1046 ^₀ oRIGINAU

Cephalosporin C Es wurde auch gezeigt, daß Rhizobiura trifolii Cephalosporin C nach der gleichen Arbeitsweise wie für 7-ACA beschrieben deeacetyliert. In diesem Falle v/ar es jedoch nicht notwendig, das Papier mit Pyridin und Phenyj.anetylchlorid zu besprühen, um die biologische Aktivität des Produktes· zu zeigen.

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BAD ORfOiNAL

Claims (14)

179577%

A, Verfahren zur Her a teilung von Verbindungen der allgemeinen Formel

.CH₂. OH

S CCGOH

I i

CH-- CO

worin X eine Acylamino- oder eine AralnoCilHp)-Gruppe bedeutet, durch Hydrolyse von Verbindungen der Formel

CH₂.0.COCH₅

ß CCOOH . I,

ί I

worin Χ die ebon Giigo^iicene Bedeutung besitzt, mi'fcte3.s einer Esterece, dadurch gehemi^oialmet, daß nan al& Eßtaraoe eine Esterase, stammend von einer Spezies der Genus Rhizobium, verwendet, wobei diese Spezies dieselbe Esteraseaktivität besitzt, wie eine Wildkultur dieser Spezies.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekoiinssGlnhnct, daß man al3 RhiEobitua Speciec Rhisoliiusi iriio3.il» Rhisobium lupinii,

. ; ■* ' 509812/1046

BAD

·* 54 -

Rhiaobium japonic um, Rhizobium leguminoGaruro oder Rhizobium phaesoli verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rhisobiumeoterase von einer Wildkultur eines Rhiaobiumorganiemus stammt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 ~ 3> dadurch gekennzeichnet, daß nhizobiuri trifolii, das alo Stämme vom wilden Typ quo Trifoliuia dubium isoliert wurde, verwendet wird.

5. Verfuhren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von Rhisobium trifolii verwendet wird, der auf Mannitagar ein wasserlösliches, rotea Pigment bildet.

6. Verfahren iiRch einen der Ansprüche 1-5, dadurch gekennseIchnet, daß ein enzyznreiches liaterial verwendet wird, dao aue einer Kultur einer Rhisjobiun-Species hergestellt ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, üaß das enaymreiche Material auo einer Kultur goerntet vmd mit einem mitWaseer mischbaren Iiößuii.gfjrjittol zur Entfernung von Wasser und Fett behandelt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekonnzeiebnet_f..daß man als mit Wasser mischbares Löaungomittol ein Keton oder einen Alkohol verwendet.

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• ^ ■ BAD ORIGINAL

·- 35 -

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit V/asser mischbares liöoungsmittel Aceton oder Äthanol verwendet.

1Oo Verfahren nach einem dor Anoprüche 1 - 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rhizobiumesteraoe durch Züchtung von Rhizobium in aerober Submerskultur erhält.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch ge~ kennzeichnet, daß man die Rhiaobiumesteraae durch Züchten von Rhizobium in einem Medium auf der Baoia von Fleischextrakt und Pepton.oder Hefeextrakt, Nannit und Nöhrsalzen, erhalte

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Stickstoffgehalt des Züchtungsmediumc zwischen 0,1 und 0,5 $> liegt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Stickstoffgehalt des Nährmediums etwa 0,2 i> beträgt.

14. . Verfahren nach einem der Anaprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse in wäBbrigem Medium bei einem pH-V/ert zwischen 5 und 8 durchgeführt wird.

BAD ORIGINAL 509812/1046