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Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums und seiner Derivate
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur. Herstellung eines neuen, als Fumagillin
bezeichneten Antibiotikums und seiner Derivate.
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Die Synthese therapeutisch wirksamer chemischer Verbindungen mit Hilfe
der klassischen Verfahren der organischen Chemie ist eine alte, wohlfundierte Methode
zur Bereicherung der Medizin mit wertvollen Medikamenten. In neuerer Zeit wurde
gefunden, daB neue, bisher nicht verwendete chemische Stoffe mit vorher nicht erzielten
Wirkungen aus Nährmedien isoliert «erden können, in welchen gewisse spezifische
Mikroorganismen unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen gezüchtet wurden. Die
Bedingungen für Nährmedien und Kultur sind für jeden einzelnen Mikroorganismus und.
für das erzeugte Produkt spezifisch. Diese therapeutisch nutzbaren chemischen Verbindungen
wurden ohne Rücksicht auf ihre chemische Struktur als Antibiotika bezeichnet und
auf Grund ihrer Herstellungsmethode und ihrer wachstumshemmenden Wirkung gegenüber
Mikroorganismen klassifiziert. Unter diesen antibiotischen Stoffen, soweit sie isoliert
und charakterisiert wurden, konnten bisher nur wenige gefunden werden, die gegen
Viren wirksam sind oder die Aktivität von Bakteriophagen hemmen.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines gegen
Viren wirksamen Antibiotikums und eine antibiotische Substanz mit antibakteriophager
Wirkung: Ferner umfaBt die Erfindung die Herstellung von für die Behandlung von
Infektionen bei Menschen bzw. Tieren wirksamen antibiotischen Substanzen.
Fumagillin
ist eine weiße, kristalline, feste organische Carboxylsäure mit. einem pK-Wert von
etwa 6,5 (festgestellt durch elektrometrische Titration) und einem Schmelzpunkt
von 189 bis 1g4° C (Kofler-Block), oder igo bis igi° C (Kapillarrohr). Es ist optisch
aktiv, [a] D = - 26,6° (c : 0,25 °/o in Methanol).
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Es enthält lediglich die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff,
hat angenähert die empirische Formel C"H360,, und enthält neben einer Carboxylgruppe
eine Alkoxylgruppe. Sein Molekulargewicht beträgt 475 (berechnet aus einem Neutraläquivalent)
bzw. 488 (berechnet aus der Alkoxylbestimmung). Das kristalline Produkt gibt keine
Ferrichlorid- oder Millonsche Reaktion. Die Salkowski-Sterol-Probe ist fraglich
positiv, der Liebermann-Burchard-Test ist negativ. Der Legalsche Test (Aglucone
usw.) ist negativ. Sein Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt Maximal bei 239, 304
(Inflexion), 332 (Inflexion), 336 und 351 mß mit k-Werten von 7,52 bei
239 mu; 147,8 bei 336 my und 136,4 bei 351 mu, was die Anwesenheit eines
sich aus wenigstens drei, möglicherweise aus vier Doppelbindungen zusammensetzenden
Systems konjugierter Doppelbindungen anzeigt. Das Infrarotspektrum zeigt Banden
bei 3120, 1714, 1632, 1597, 1576 1491 1377 1230, 1163, 1124, 1013 und 838 my. Fumagillin
bildet einen Methylester, Schmelzpunkt 145 bis 147° C (Kofler-Block), ein Octabromid,
Schmelzpunkt 118 bis 122° C (Kofler-Block), ein Amid, welches bei 16o° C (Kofler)
verkohlt und ein 2, 4-Dinitrophenylhydrazon, Schmelzpunkt 123 bis 126° C (Kofler-Block).
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Der Organismus, welcher die neue antibiotische Substanz gemäß der
Erfindung erzeugt, wurde von aus Kalamazoo County, Michigan, stammendem Boden isoliert.
Dieser im Boden gefundene Organismus ist funktionell und strukturell ein Glied der
Aspergillusfumigatus-Reihen der Aspergillus-fumigatus-Gruppe, wie von Thom und Raper,
Manual of Aspergilli, Williams und Wilkins, Baltimore, Md., 1945, S.87 bis g1, beschrieben
wurde, jedoch ist er von der Type des Stammes Aspergillus fumigatus NRRL 163 hinsichtlich
mehrerer morphologischer Merkmale verschieden, wie in folgender Tabelle gezeigt
wird
| Tabelle I |
| Morphologischer Vergleich zweier Stämme von Aspergillus fumigatus |
| Morphologische Charakteristik I A. fumigatus H-3 I A. fumigatus
NRRL 163 (Typenstamm) |
| Kolonie=Farbe (belüftet) Weiß in blaugrün übergehend Blaugrün |
| - Farbe (Substrat) Blaßoliv-lederfarbig in honig- Meerschaumgelb
in fleisch- |
| gelb übergehend farbig übergehend (R) |
| - Wachstumstype Ausgebreitet, extrem flockig, Ausgebreitet,
samtartig |
| verästelt |
| - Sporenbildung Mäßige Mengen von Luft- Reichlich-Conidienträger
vom |
| hyphae herrührend Substrat herrührend |
| Condidienkopf-Form kompakt, säulenförmig kompakt, säulenförmig |
| - Länge 7o bis 2ooy 7o bis 2oo,u |
| - Durchmesser 3o bis 50,C6 5o bis 60,u |
| Condidienträger-Länge 15o bis 250,u 30o bis 350,u |
| - Durchmesser 3,5 bis 7,u 4 bis 7,u |
| - Farbe grün grün |
| - Wand glatt glatt |
| Vesicel-Form flaschenförmig, obere Hälfte flaschenförmig, obere
Hälfte |
| fruchtbar fruchtbar |
| - Durchmesser 12 bis 2o ,u 14 bis 25 ,u |
| Sterigmata in eine Reihe gedrängt, parallel in eine Reihe gedrängt,
parallel |
| zur Achse des Condidien- zur Achse des Condidien- |
| trägers trägers |
| - -Länge 6 bis 8,u 5 bis 7,u |
| Conidie-Farbe grün grün |
| - Form kugelförmig stachelig kugelförmig stachelig |
| - Durchmesser 2,5 bis 3,5,u 2,5 bis 3,5 ß |
| (R in Tabelle i bedeutet, daß sich die Angaben auf die Farbnomenklatur
von Robert R i d g w a y, DColor Standards |
| and Color Nomenclaturea, igi2, Washington, D. C. beziehen). |
Ergänzend zu den sich aus dem vorstehenden Vergleich ergebenden Unterschieden wird
darauf hingewiesen, daß Aspergillus fumigatus NRRL 163 keine antiphage Substanz
produziert, wenn er unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird, unter welchen
die antibiotische Substanz gemäß der Erfindung durch Aspergillus fumigatus H-3 erzeugt
wird. Der Nachweis des erfindungsgemäßen Antibiotikums in der fermentierten Nährflüssigkeit
sowie die angenäherte Bestimmung der in dieser Flüssigkeit oder in anderen Lösungen
vorhandenen Menge beruht auf der dem Fumagillin eigenen Fähigkeit, die Wirkung von
Bacteriophagen zu inhibieren. Für Versuchszwecke wurde die inhibierende Wirkung
des Fumagillins
auf Staphylococcus aureus 2o9 P als Standard gewählt.
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Bei der Zubereitung der erforderlichen Lösungen und ihrer Anwendung
für die Untersuchungen wird folgendermaßen vorgegangen Herstellung der bacteriophagen
Suspension In mehreren Flaschen wird eine geeignete Menge einer sterilen Nährbouillon
gefüllt, die aus 0,5 °/o Pepton, 0,3 °/o Rindfleischextrakt, 0,5 °/o Natriumchlorid
und Wasser besteht. Diese Bouillon wird mit o,5 Volumprozent einer 2q.-Stunden-Nährbouillon
von Staphilococcus aureus 2o9 geimpft und bei 37° C etwa 7 Stunden lang oder bis
die Bouillon trüb geworden ist, incubiert. Dann werden zum Inhalt jeder Flasche
etwa 5 Volumprozente einer aktiven bacteriophagen Suspension zugegeben und der Flascheninhalt
abermals bei 37° C etwa 16 Stunden incubiert, in welcher Zeit die Trübung der Bouillon
entweder ganz verschwunden ist oder merklich abgenommen hat. Der Inhalt der Flaschen
wird zusammengegossen, und die Zellen werden durch Filtration durch ein steriles
Filter aus gesintertem Glas (Porengröße UF) abgetrennt. Die sterile, gefilterte
bacteriophage Suspension wird auf ihre Aktivität geprüft und in einem Kühlschrank
bis zum Gebrauch gelagert.
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Vorbereitung der Testplatten Geschmolzenes, halbfestes Nähragar, das
0,5
°/o Pepton, 0,3 °/o Rindfleischextrakt, 0,5 °/o Natriumchlorid, o,7 °/o
Agar und Wasser enthält, wird auf 50° C abgekühlt und mit etwa i Volumprozent einer
24-Stunden-Bouillon-Kultur von S. aureus 2o9 gemischt. Zu der flüssigen Agarsuspension
wird eine durch Vorversuche bestimmte, zur Verhinderung des Wachstums von S. aureus
2o9 hinreichende Menge der in bereits angegebener Weise bereiteten phagen Suspension
zugesetzt. Je 5 cm3 dieser bacteriophagen S.-aureus-Suspension werden in mit flachem
Boden ausgestattete Petrischalen gegossen und erstarren gelassen. Die so zubereiteten
Testplatten werden bis zum Gebrauch unter Kühlung gelagert.
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Herstellung des Standardpräparates und der Muster Es wird eine Acetonlösung
mit ioo Mikrogramm kristallinem Fumagillin j e Kubikzentimeter hergestellt. Teile
dieser Lösung werden mit sterilem, destilliertem Wasser auf Konzentrationen von
1o, 5, 2,5 und 1,5 Mikrogramm je Kubikzentimeter verdünnt. Muster unbekannter Stärke
werden mit Aceton und Wasser (die Unlöslichkeit von gereinigtem Fumagillin kann
es notwendig machen, Lösungen, die mehr als ioo Mikrogramm je Kubikzentimeter enthalten,
mit Aceton zu verdünnen) bis zu einer schätzungsweisen Konzentration von 1,25 bis
io Mikrogramm je Kubikmillimeter verdünnt.
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Untersuchungsmethode Ein 6,35 mm Filterpapierscheibchen (Schleicher
und Schüll 740 E) wird in jede Konzentration der Standardlösung und der unbekannten
Lösungen getaucht, die überschüssige Flüssigkeit wird abtropfen gelassen und das
Papier auf eine in der beschriebenen Weise hergestellte Petriplatte gelegt. Für
jede Verdünnung der Standardlösung und der unbekannten Lösung werden gewöhnlich
vier Scheiben, jede auf einer besonderen Platte, verwendet. Die Platten werden bei
37° C 16 bis 18 Stunden lang incubiert, wonach der Durchmesser der Wachstumszonen
in Millimeter gemessen und die durchschnittliche Größe der Zonen für jede Verdünnung
ermittelt wird. Die Meßergebnisse für die Zonengröße bei den Standardverdünnungen
werden gegenüber ihren Konzentrationen aufgetragen; die so erhaltenen Punkte werden
durch Linien verbunden und ergeben eine Standardkurve. Bei Bestimmung einer Probe
unbekannter Konzentration wird mit Hilfe der Standardkurve aus dem Durchmesser in
Millimeter der Gehalt an Fumagillin in Mikrogramm je Kubikzentimeter abgelesen.
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Die erfindungsgemäße antibiotische Substanz wird durch die Züchtung
eines Fumagillin erzeugenden Stammes Aspergillus fumigatus H-3, vorzugsweise unter
submersen, aeroben Bedingungen, in einer Nährlösung hergestellt, welche ein Kohlehydrat,
Kochsalz, ein festes Corn-steep-Präparat, Calciumcarbonat und so viel Natriumhydroxydlösung
enthält, um den schließlichen p. -Wert des Mediums auf etwa 6,7 einzustellen. Unter
Corn-steep-Präparat wird ein als Abdampfrückstand nach dem Auslaugen der Mais-und
Getreidekörner mit verschiedenen Lösungen in der Getreideindustrie anfallendes Nebenprodukt
verstanden. Das auf diese Weise erzeugte Fumagillin kann vom Kulturmedium isoliert
werden, vorzugsweise so, daß man das Mycelium durch Extraktion mit Chloroform abtrennt,
das Rohfumagillin aus dem Chloroform abtrennt, das Rohfumagillin aus dem Chloroform
zurückgewinnt und das so erhaltene Rohprodukt durch Lösen in Aceton reinigt. Die
Acetonlösung wird konzentriert und gekühlt, der entstehende Niederschlag wird abgetrennt,
mit tert. Butanol gewaschen und aus Methanol und Wasser auskristallisiert.
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Für die Herstellung von Fumagillin wird ein Kulturmedium etwa folgender
Zusammensetzung bevorzugt: Dextrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
bis 15 Teile Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . i bis 7 Teile festes Corn-steep-Präparat
..... 25 bis q.o Teile Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . i bis
2 Teile Wasser ... . . . . . . . . . . Ergänzung auf iooo Teile. Das Nährmedium
wird durch Zusatz von Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von etwa 6,7 eingestellt,
durch Erhitzen sterilisiert und dann gekühlt. Mit diesem Medium ist es möglich,
in 36 bis 72 Stunden etwa 7o bis i7o Mikrogramm je Kubikzentimeter zu erzeugen.
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Für die Herstellung großer Mengen Fumagillin wird das erwähnte Nährmedium
mit einer Kultur des Aspergillus fumigatus H-3 geimpft, wodurch der Stamm vorzugsweise
in einer Menge von etwa 5 Volumprozenten des Nährmediums erzeugt wird. Die Impfkultur
kann dadurch erhalten werden, daß der Fumagillin erzeugende, auf Schrägagar gezüchtete
Stamm von Aspergillus fumigatus H-3 in Schüttelflaschen eingebracht wird, welche
ein die angegebene Zusammensetzung besitzendes Nährmedium enthalten. Nach
z
Tagen Wachstum wird ihr Inhalt in Rührflaschen übertragen, welche das oben angegebene
Medium enthalten und dort weitere 2 Tage wachsen gelassen.
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Die Fermentation wird bei 2o bis 30° C 36 bis 72 Stunden lang durchgeführt,
wobei die maximale Ausbeute nach etwa 42stündiger Incubationsdauer erreicht wird.
Während der Fermentation wird Luft durch das bewegte, geimpfte Medium geleitet,
vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,4 Volumteilen Luft in der Minute auf einen
Volumteil des Mediums. Nachdem die Fermentation die gewünschte, durch Prüfung des
Gemisches auf den Fumägillingehalt bestimmte Zeitspanne vor sich gegangen ist, wird
die Flüssigkeit durch Filtration geklärt. Die geklärte Flüssigkeit wird entfettet
durch Extraktion mit einer etwa i/io ihres Volumens betragenden Menge von handelsüblichem
Hexan. Die entfettete geklärte Flüssigkeit wird dann mit Chloroform extrahiert,
der das Fumagillin enthaltende Chloroformextrakt wird konzentriert, um das ganze
Chloroform zu entfernen. Der Rückstand wird in Aceton gelöst. Die Acetonlösung scheidet
nach Kühlung eine geringe Menge eines braunen Niederschlages aus, der aus Verunreinigungen
besteht und entfernt wird. Die Acetonlösung wird bis auf etwa 6o °/o ihres ursprünglichen
Volumens konzentriert, gekühlt und der entstehende, das Antibiotikum enthaltende
Niederschlag abgetrennt. Das Präzipitat wird nach Waschen mit tertiärem Butanol
aus einer Mischung von Methanol und Wasser umkristallisiert. Das so erhaltene Fumagillin
besitzt die oben angegebenen Eigenschaften.
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Zur Erläuterung der Erfindung dienen die folgenden Beispiele Beispiel
i Herstellung von Sporenkulturen von Aspergillus fumigatus H-3 Das vegetative Gebilde
und Sporen von auf Schrägagar gezüchtetem A. fumigatus H-3 wird in einige Halbliterflaschen
gegeben, von welchen jede ioo cm3 eines Nährmediums folgender Zusammensetzung enthält:
-Dextrin ............................... ro g Kochsalz .............................
59
festes Corn-steep-Präparat . . . . . . . . . . . . . . 329
Calciumcarbonat
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i g Leitungswasser . . . . . . . .
. . . . Ergänzung auf 1 1 Der p.-Wert des Mediums wird durch Zusatz von Natriumhydröxydlösung
auf-6,7 ringestellt.
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Dieses Medium wird sterilisiert, mit obiger Schrägagarkultur geimpft
und 48 Stunden lang bei einer Temperatur von 24° C geschüttelt (belüftet, submerse
Kultur). Diese Kultur von A. fumigatus H-3 kann direkt zur Impfung in Behältern
(Beispiel 3) oder zur Erzeugung von größeren Mengen Impfstoff (Beispiel 2) verwendet
werden.
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Beispiel 2 Herstellung des Impfmaterials Zu 61 eines Mediums, das
die im Beispiel i angeführten Bestandteile enthält, werden in einer 18,9 1 fassenden
Flasche, die für Bewegung und Belüftung eingerichtet ist, 5 Volumprozente einer
nach Beispiel i erhaltenen-Impfkultur gegeben. Das geimpfte Medium wird bei einer
Temperatur von 24° C 48 Stunden incubiert und dabei gelüftet. Nach dieser Zeit ist
die Kulturflüssigkeit zur Impfung großer Behälter geeignet.
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Beispiel 3 Erzeugung, von Fumagillin A. Fermentation. 67811
des in Beispiel i beschriebenen Nährmediums, die in einem mit Glas ausgefütterten
757o,81 fassenden Tank enthalten sind, werden mit 28i,81 einer vegetativen 48-Stunden-Kultur
von A. fumigatus H-3, die entsprechend Beispiel 2 hergestellt wurde, geimpft. Das
geimpfte Nährmedium wird 42 . Stunden bei einer Temperatur von 24° C incubiert und
dabei mit etwa 22651 Luft je Minute belüftet und gerührt. Die Untersuchung einer
Probe des Mediums zeigte, daß nach 42 Stunden 170 Phage-Einheiten j e Kubikzentimeter
vorhanden waren.
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B. Isolierung. Am Ende der Fermentationsperiode werden 68,04 kg Diatomeenerde
als Filtrierhilfe dem Inhalt des Fermentationsbehälters zugesetzt und dann mit Hilfe
einer Platten- und Rahmenfilterpresse filtriert. Die geklärte Flüssigkeit enthält
z6,6 mg Feststoff j e Kubikzentimeter und ergab 142 Phage j e Kubikzentimeter. Die
geklärte Flüssigkeit wurde mit 67o 1 handelsüblichem Hexan innig gemischt. Dabei
wurde ein Podbielniak-Extraktor verwendet. Die Hexanschicht, welche die unerwünschten
Fettstoffe enthält, wurde abgezogen. Die entfettete Flüssigkeit wurde dann mit 5871
Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wurde abgetrennt, sie enthielt iigo
g Feststoffe und 35 g Fumagillin.
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Das Chloroform wurde unter vermindertem Druck ohne Wärmezufuhr von
außen abgetrennt. Der nach Entfernung des Chloroforms zurückbleibende Sirup wurde
mit Aceton bis zu einem Volumen von 370o cm3 aufgefüllt. Die Acetonlösung wurde
auf 5° C gekühlt, wobei eine geringe Menge eines braunen Niederschlages ausfiel,
der durch Filtration abgesondert wurde. Der Niederschlag wurde mit Aceton gewaschen,
die Waschflüssigkeit wurde dem ursprünglichen Filtrat zugeschlagen. Das Volumen
von Filtrat und Waschflüssigkeit betrug zusammen 380o cm3. Diese Lösung enthielt
r062 g Feststoffe mit einer Antiphage-Potenz von 3ooYikrogramin j e Milligramm.
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1500 cm3 der erwähnten Acetonlösung werden bei vermindertem Druck
und bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre auf ein Volumen von goo cm3 konzentriert.
Die sich ergebende dicke Suspension wurde unter Stickstoff in eine 1 1 fassende
Zentrifugiertasse gebracht und auf - 30° C 1g Stunden lang gekühlt. Die Suspension
wurde i Stunde mit einer Geschwindigkeit von r5oo bis i7oo Umdr./Min. zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wurde vom festen Rückstand dekantiert, welcher fünfmal
bei Raumtemperatur mit je 15z5 cm3 tert. Butanol gewaschen wurde. Der nach dem Waschen
mit tertiärem Butanol zurückbleibende feste Rückstand betrug nach Trocknung bei
Raumtemperatur 22,2 g. Nach Rekristallisation dieses Materials aus einer Mischung
von gleichen Teilen Methanol und Wasser
wog es 19,8 g und hatte
einen Schmelzpunkt von igo bis 1g1' C (Kapillarrohr) sowie die bereits erwähnten
anderen physikalischen und chemischen Eigenschaften.
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Beispiel 4 Fumagillinmethylester Zu 500m9 Fumagillin (Schmelzpunkt
in der Kapillare igo bis 1g1' C) aus Beispiel 3, gelöst in 5oo cm3 Benzol, wurde
ein Überschuß von in wasserfreiem Äther gelöstem Diazomethan zugesetzt. Die Mischung
wurde 30 Minuten lang auf etwa + 5' C gekühlt und dann bei Raumtemperatur
weitere 2 Stunden abstehen gelassen. Äther und Benzol wurden unter vermindertem
Druck abgetrennt. Der Rückstand wurde in 7o cm3 Methanol gelöst und 3o cm' Wasser
zugesetzt. Nach Kühlung auf + 5' C schied sich kristalliner Fumagillinmethylester
aus. Die Kristalle des Fumagillinmethylesters wurden gesammelt, sie wogen nach Trocknung
370 mg und hatten einen Schmelzpunkt von 145 bis 147' C.
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Analyse: Gerechnet als C"H"07 : C = 69,11, H = 7,86, (OCH3)2 = 12,76.
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Gefunden: C = 67,8,H = 7,84, (OCH3)2 = 11,55 Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum
zeigte Maxima bei 238,5 Ina, 336 mß und 352 mu. Das Infrarotspektrum des Methylesters
in Chloroform war jenem der unter ähnlichen Bedingungen bestimmten Ausgangssäure
überaus ähnlich.
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Beispiel 5 Fumagillinoctabromid Zu einer Lösung von ioo mg Fumagillin
in einer Mischung von 2,o cm3 Chloroform und o,3 cm3 Kohlenstofftetrachlorid wurden
5,o cm3 einer 5°/oigen Lösung von Brom in Kohlenstofftetrachlorid tropfenweise unter
Rührung bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Lösungsmittel wurden in einem Luftstrom
bei Raumtemperatur verdampft und der Rückstand in 20 cm3 Methanol gelöst, zu welchem
dann 5 cm3 Wasser zugesetzt wurden. Nach Kühlung auf etwa -;- 5' C wurden gelbe
Kristalle von Fumagillinoctabromid niedergeschlagen, welche nach Sammlung und. Trocknung
iio mg wogen und einen Schmelzpunkt von 118 bis 122' C (Koflerblock) zeigten.
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Analyse: Gerechnet als C27 H36 07 Br$ : Br = 57,50,
C = 29,16,
H = 3,26, OCH3 = 2,79.
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Gefunden: Br = 57,43 C = 29,57, H = 3,6o, 0 C H,= 2,8o.
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Das Ultraviolett- und Infrarot-Absorptionsspektrum zeigte, daß das
im Fumagillin vorhandene System konjugierter Doppelbindungen eliminiert wurde.
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Beispiel 6 Fumagillin-di-2, 4-dinitrophenylhydrazon Zu einer Lösung
von ioo mg Fumagillin in 15 cm3 Äthanol wurden 75 mg 2, 4-Dinitrophenylhydrazin
zugesetzt und die Mischung zum Sieden erhitzt. Nach Zugabe von i cm3 konzentrierter
Salzsäure wurde die Lösung mit Rückflußkühlung weitere 5 Minuten erhitzt. Nach Abkühlung
über Nacht schieden sich Kristalle von Fumagillin-di-2, 4-dinitrophenylhydrazon
aus, welche nach Sammlung und Kristallisation aus Methanol 22 mg wogen und einen
Schmelzpunkt von 123 bis 126' C (Koflerblock) aufwiesen.
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Das Ultraviolett- und Infrarot-Absorbtionsspektrum zeigte Banden bei
3285 cm-1, 3100 cm-', 1618 cm-', 1596 cm-', 1505 cm-', 152o cm-', welche
für 2, 4-Dinitrophenylhydrazon charakteristisch sind und eine zusätzliche Bande
bei 171o cm-', das Zeichen einer Carbonylgruppe, wahrscheinlich einer in Fumagillin
anwesenden Carboxyl- oder Lactongruppe.
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Analyse: Gerechnet als C27 H3605 [N N H C s H3 (NO2)a] 2: N = 1346.
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Gefunden: N = 1321.