AT267057B - Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums

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AT267057B
AT267057B AT882665A AT882665A AT267057B AT 267057 B AT267057 B AT 267057B AT 882665 A AT882665 A AT 882665A AT 882665 A AT882665 A AT 882665A AT 267057 B AT267057 B AT 267057B
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Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums 
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuen, antibiotisch wirksamen Substanz. 



   Das neue, gemäss der Ertindung erhältliche Antibiotikum ist ein weisser, kristalliner Festkörper, der bei etwa 103 bis 1060C schmilzt ; der Festkörper ist in niederen Alkoholen, niederen Estern, Ketonen, Chloroform, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxyd löslich und in Wasser   unlöslich ;

     er hat eine titrierbare Gruppe mit einem   pK' < x-Wert   von 6, 65 in   661oigem, wässerigem Dimethylformamidy   er 
 EMI1.1 
 Vakuum über Phosphorpentoxyd während 2 h bei etwa   600C   eine angenäherte Zusammensetzung von   62, 780/0   Kohlenstoff,   9, 430/0   Wasserstoff und   26, 61%   Sauerstoff und nach Trocknen in einer BlockSchmelzpunktsapparatur eine angenäherte Zusammensetzung von   64, 66%   Kohlenstoff, 9, 580/o Wasserstoff und   25, 41%   Sauerstoff ein Molekulargewicht, berechnet aus Titrationsdaten, von etwa 677 ; als Lösung in Chloroform zeigt der Festkörper die folgenden unterscheidbaren Banden in seinem InfrarotAbsorptionsspektrum (Zeichnung) :

   2, 73, 2, 98 (Schulter),   3, 05, 3, 38, 3, 47, 5, 86, 6, 23, 6, 83, 7, 02,     7, 26, 7, 56, 7, 66, 7, 76, 8, 04, 9, 02,   9, 17,   9, 47, 9, 78, 9, 91, 10, 06, 10, 25, 10, 58, 10, 82, 10, 98,     11, 21, 11, 44, 11, 64, 11, 82 und 11, 97 J. 1 ; er zeigt keine signifikante Absorption   ultravioletter Strahlung. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums umfasst die Züchtung von Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 bzw. seiner Mutanten und Varianten in einem Kulturmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen, aeroben Bedingungen, bis durch diesen Mikroorganismus im Kulturmedium eine wesentliche Menge des Antibiotikums gebildet ist. 



   Das neue Antibiotikum unterliegt einer raschen Veränderung in saurer Lösung mit damit verbundenem Aktivitätsverlust. In basischer Lösung zeigt das Antibiotikum jedoch einen bemerkenswerten Stabilitätsgrad. So unterliegt eine Probe des Antibiotikums, die 60 h unter Rückflusskühlung bei einem PHWertvon 11 erhitzt wird, keiner wesentlichen Änderung, mit Ausnahme der Bildung des Salzes der Säure. Beim Lagern als trockenes, kristallines Material bleibt das neue Antibiotikum lange Zeit stabil. 



   Das Kernmagnetresonanzspektrum deutet darauf hin, dass das Molekül eine Carboxylgruppe, 3 bis 4 Hydroxylgruppen und eine Ätherbindung enthält. Der Rest des Moleküls scheint sich aus Methylenund Methylgruppen zusammenzusetzen. Das Infrarotabsorptionsspektrum des neuen Antibiotikums in Chloroformlösung mit einem Zellenweg von 0, 1 mm ist in der Zeichnung dargestellt. 



   Ein mit einem Pulver des Antibiotikums aufgenommenes Röntgenbeugungsbild, das unter Verwendung einer Chromstrahlung mit einem Vanadiumfilter zur Berechnung der Raumabstände aufgenommen wurde, ergibt nachfolgende Werte : 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> d <SEP> 1/11
<tb> 13, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> 11, <SEP> 88 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 
<tb> 9, <SEP> 70 <SEP> 0, <SEP> 80 <SEP> 
<tb> 9, <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 90 <SEP> 
<tb> 8, <SEP> 68 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> 8, <SEP> 20 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> 
<tb> 7, <SEP> 93 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> 
<tb> 7, <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> 
<tb> 7, <SEP> 21 <SEP> 0, <SEP> 80 <SEP> 
<tb> 7, <SEP> 01 <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> 6, <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 90 <SEP> 
<tb> 5, <SEP> 47 <SEP> 0, <SEP> 90 <SEP> 
<tb> 5, <SEP> 36 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> 5, <SEP> 19 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP> 
<tb> 4,

   <SEP> 93 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP> 
<tb> 4,65 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> 4, <SEP> 47 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 
<tb> 4, <SEP> 26 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP> 
<tb> 3, <SEP> 97 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 
<tb> 3, <SEP> 77 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> 3, <SEP> 58 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> 3, <SEP> 53 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> 3, <SEP> 44 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> 3, <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> 3, <SEP> 17 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> 
 
Die berechnete empirische Formel des neuen Antibiotikums ist    C36H66012.   Das Verhalten der Verbindung unter scharfen Trocknungsbedingungen lässt jedoch erkennen, dass das Antibiotikum mit einem Mol Kristallwasser kristallisieren kann und dass die empirische Formel des Antibiotikums selbst   C3-, 0   sein kann. 
 EMI2.2 
 gleichfalls negativ. 



   Das gemäss der Erfindung erhältliche Antibiotikum zeigt vielerlei interessante und wertvolle Eigenschaften. So hat das neue Antibiotikum   z. B.   eine Hemmwirkung auf das Wachstum von Bakterien und Pilzen, die Tier- und Pflanzenpathogene sind. In der Tabelle 1 sind die Hemmkonzentrationen, bestimmt mittels Agar-Verdünnungstest, für eine Anzahl von Organismen angegeben. 



   Tabelle I : 
 EMI2.3 
 
<tb> 
<tb> Minimale <SEP> Hemmkonzentration,
<tb> in <SEP> mcg/ml <SEP> : <SEP> nach
<tb> Testorganismus <SEP> : <SEP> 24 <SEP> h <SEP> : <SEP> 48 <SEP> h <SEP> : <SEP> 72 <SEP> h@
<tb> Staphylococcusaureus <SEP> < 0, <SEP> 78 <SEP> < 0, <SEP> 78 <SEP> 
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> l, <SEP> 56 <SEP> l, <SEP> 56 <SEP> 
<tb> Mycobacterium <SEP> vium- < 0, <SEP> 78 <SEP> 
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Lactobacillus <SEP> casei <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 
<tb> Leuconostoccitrovorum <SEP> < 0, <SEP> 78 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 3> 

   Tabelle I (Fortsetzung) :    
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Minimale <SEP> Hemmkonzentration,
<tb> in <SEP> mcg/ml <SEP> : <SEP> nach
<tb> Testorganismus <SEP> : <SEP> 24 <SEP> h <SEP> :

   <SEP> 48 <SEP> h <SEP> : <SEP> 72 <SEP> h <SEP> : <SEP> 
<tb> Proteus <SEP> sp. <SEP> No. <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Vibrio <SEP> metschnikovii <SEP> 50 <SEP> 50
<tb> Alternaria <SEP> solani <SEP> - <SEP> - <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 
<tb> Botrytis <SEP> cinerea--3, <SEP> 13 <SEP> 
<tb> Colletotrichum <SEP> psi--12, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Glomerella <SEP> cingulate--100
<tb> Helminthosporium <SEP> sativum--50
<tb> Polyporus <SEP> ostreatus--25
<tb> Penicillium <SEP> expansum--12, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Pullulariasp.--1, <SEP> 56 <SEP> 
<tb> Sclerotinia <SEP> fructicola--3, <SEP> 13 <SEP> 
<tb> Verticillium <SEP> alboatrum--100
<tb> Spicaria <SEP> divaricata--100
<tb> 
 
Eine weitere wichtige Eigenschaft des erfindungsgemäss erhältlichen Antibiotikums ist dessen Eignung zur Verhinderung der Entwicklung vonCoccidiosis bei Geflügel.

   Wenn beispielsweise das neue Antibiotikum im Futter junger Kücken in Konzentrationen verabreicht wird, die so niedrig wie 0, 02% sind, so ist es bei der Verhinderung der Sterblichkeit und der Abnahme der Zahl der Krankheitsfälle bei Kücken, die durch verschiedene Species von Coccidia infiziert worden sind, hochwirksam. Die bei vier der Species erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angegeben. 



   Tabelle   II :  
Aktivität des neuen Antibiotikums gegen vier Species von Coccidia 
 EMI3.2 
 
<tb> 
<tb> Infizierender <SEP> Arzneidosis <SEP> im <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> Sterblichkeit <SEP> Gewichtszunahme
<tb> Organismus <SEP> : <SEP> Futter <SEP> in <SEP> Gew.-%: <SEP> Kücken: <SEP> in <SEP> %: <SEP> in <SEP> g <SEP> :

   <SEP> 
<tb> Eimeria <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 19 <SEP> 0 <SEP> 1778
<tb> tenella <SEP> Vergleich <SEP> 50 <SEP> 36 <SEP> 133
<tb> Eimeria <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP> 4128
<tb> necatrix <SEP> Vergleich <SEP> 50 <SEP> 48 <SEP> 98
<tb> Eimeria <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 50 <SEP> 0 <SEP> 8500
<tb> maxima <SEP> Vergleich <SEP> 50 <SEP> 0 <SEP> 7100
<tb> Eimeria <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 1498
<tb> Brunetti <SEP> Vergleich <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 935 <SEP> 
<tb> 
 
Die akute Toxizität des neuen Antibiotikums bei Mäusen, ausgedrückt als LD   50'beträgt   bei oraler Verabreichung des Antibiotikums etwa   43, 8 5, 2   mg/kg   Körpergewicht ;   intraperitoneal verabreicht beträgt dieLD50 etwa   1, 68 : ! : 1, 7   mg/kg Körpergewicht.

   Das Antibiotikum scheint für Kücken viel weniger toxisch zu sein, wobei die akute orale Toxizität bei jener Species, wieder als   LD50   ausgedrückt, etwa   284,45#47,22   mg/kg Körpergewicht beträgt. 



   Das neue Antibiotikum wird durch Züchten eines neu entdeckten Actinomycetenstammes unter 

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 aeroben Bedingungen in einem geeigneten Nährmedium bis zum Auftreten einer wesentlichen antibiotischen Aktivität in dem Nährmedium erhalten. Das Antibiotikum kann durch Anwendung verschiedener Isolations- und Reinigungsverfahren, wie sie an sich bekannt sind, gewonnen werden. Diese Methoden können angewendet werden, um das Antibiotikum in relativ reiner Form zu erhalten. Es genügt ein geringerer Reinheitsgrad, wenn das Antibiotikum dem Futter für Tiere einzuverleiben ist. In einem solchen Fall braucht das Antibiotikum nicht als Feststoff rückgewonnen werden, sondern es kann gewünschtenfalls auf das Futter oder einen Träger als konzentrierte Lösung ausgesprüht werden. 



   Der Stamm des zur Herstellung des neuen Antibiotikums angewendeten Organismus ist in die dauernde Sammlung der American Type Culture Collection in Washington D. C. aufgenommen worden und hat die Kulturbezeichnung ATCC 15413 erhalten. 



   Wegen der Unsicherheit von taxonomischen Studien bei Organismen der Streptomycesgruppe besteht immer ein gewisser Zweifel bei der Klassifizierung eines neu entdeckten Organismus. Der Organismus, der das neue Antibiotikum erzeugt, scheint, was seine wichtigsten Kennmerkmale betrifft, an Streptomyces cinnamonensis Okami (NRRL B 1588) zu erinnern und ist als neuer Stamm desselben zu betrachten. Es bestehen genügend Unterschiede zwischen dem neuen Stamm des S. cinnamonensis und dem vorbekannten Stamm, dass der Organismus, der im Rahmen der Erfindung beschrieben ist, 
 EMI4.1 
 bezüglich der Anwesenheit von löslichem Pigment.

   Die Stämme unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der Verwertung von 9 Kohlenstoffquellen, der Bildung von Schwefelwasserstoff durch S. cinnamonensis (NRRL B 1588) und dem Fehlen der Bildung desselben beim neuen Stamm und besonders deutlich in ihrem Temperaturerfordernissen. So erfolgt beispielsweise mit S. cinnamonensis (NRRL B 1588) das maximale Wachstum und die maximale Sporenbildung bei 260C. Bei   300C   erfolgt nur mittelmässige Sporenbildung. Das Wachstum wird, allerdings ohne Sporenbildung, bei   370C   fortgesetzt, bei 430C aber zur Gänze unterdrückt. Im Gegensatz dazu ergibt der vorliegendenfalls angewendete Stamm S. cinnamonensisATCC 15413 ein maximales Wachstum und eine maximale Sporenbildung zwischen 30 und 370C.

   Mittelmässiges Wachstum, allerdings mit schwacher Sporenbildung, erfolgt noch bei 43 C bei einer Temperatur, bei welcher beim vorbekannten Stamm das Wachstum vollständig eingestellt ist. 



   Der das neue Antibiotikum bildende Stamm wurde aus einer Bodenprobe durch Suspendieren von Teilen derselben in steril destilliertem Wasser und Ausstreichen der Suspension auf Nähragar isoliert. Die beimpften Agarplatten wurden bei 25 bis   35 C   bebrütet, bis sichtbare Kolonien zu beobachten waren. Am Ende der Bebrütungsdauer wurden die Kolonien der antibiotikumproduzierten Organismen mittels einer sterilen Platinschleife auf Schrägagar überimpft. Die   Schrägagarkulturen   wurden dann   bebrü-   tet, um geeignete Mengen des Impfmaterials zur Bildung des neuen Antibiotikums zu erzeugen. 



   Die bei taxonomischen Studien des das neue Antibiotikum   bildendenStammesvonSinnamonen-   sis ATCC 14413 angewendeten Methoden sind solche, die üblicherweise in der Taxonomie der Actino- 
 EMI4.2 
 
107bebrütet. Morphologie- und Kulturkennmerkmale wurden nach 14 Tagen Bebrütung festgestellt. Beim Studium der Morphologie der Kulturen wurden Tomatenpasten-Hafermehlagar und Czapek's Agar angewendet. Nitratreduktion und   Gelatineverflüssigung   wurden nach 7 und 14 Tagen ermittelt, während die Beobachtungen bezüglich Schwefelwasserstoffbildung nach 24 und 48 h durchgeführt wurden. Wie dies üblicherweise der Fall ist, wurde die Kohlenstoffverwertung nach 10tägiger Bebrütung bestimmt. 



   Mikroskopische Morphologie. 



   Sporenkettenmorphologie : Sporophoren und Sporenketten sind gerade bis gebogen, wobei weder Spiralen noch Haken vorhanden sind. Die Sporen sind oval bis kurzzylindrisch, mit Abmessungen von 0, 7 bis 1, 1 mu xl, 4 bis   2, 2 II1JL.   Elektronenmikrophotographien von platinvorschattierten Kohlenstoffkopien der Sporen lassen eine relativ glatte Sporenoberfläche erkennen, die mit einem Netzwerk von sich kreuzenden Faserbündeln bedeckt sind. 



   Kulturcharakteristika. 



     Tomatenpaste-Hafermehlagar :   Das Wachstum ist reichlich mit reichlich rosa (3-D7) Luftmycel. 



  Die Rückseite ist rotbraun (8-H3). Es liegt ein lösliches, rotbraunes Pigment vor. 



     Nähragar :   Schwacher Wuchs ohne Luftmycel. Die Rückseite ist gelb (10-F3). Es liegt kein lösliches 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 Pigment vor. 



   Czapek's Agar: Das Wachstum ist mässig, mit mässigem hellrosa (2-B1) Luftmycel. Die Rückseite ist hellgelbbraun (11-F5). Es wird eine geringe Menge braunes, lösliches Pigment beobachtet. 



   Glukose-Asparagin-Agar : Das Wachstum ist spärlich, ohne Luftmycel. Die Rückseite ist hell gelbgrün   (19-B1).   



   Anorganische Salze-Stärkeagar : Das Wachstum ist reichlich, mit einem reichlichen, mässig rosa Reihenmycel ; die Rückseite ist mässig braun (14-A10). Es liegt eine geringe Menge von braunem, löslichem Pigment vor. 



   Hefeextrakt-Agar : Der Wuchs ist mässig, mit einem mässigen Luftmycel, das weiss mit einem bräunlich-rosa Schimmer ist. Die Rückseite ist dunkelgraubraun (15-A2); es liegt eine geringe Menge braunes, lösliches Pigment vor. 



   Bennett's Agar : Der Wuchs ist mässig mit einem mässigen graugelb-rosa (4-B7) Luftmycel ; die Rück- 
 EMI5.1 
 
Emerson's Agar : Der Wuchs ist mässig, aber ohne Luftmycel. Die Rückseite ist   mässig orange (10-17).   



  Es ist kein lösliches Pigment sichtbar. 



     Kalziummalat-Agar   Der Wuchs ist mässig mit einem mässigen gelbrosa (3-D7)Luftmycel.Die Rückseite ist   graubraun ;   wenig braunes, lösliches Pigment. 



   Tyrosin-Agar Der Wuchs ist nur schwach ohne Luftmycel. Die Rückseite istgraugelb (12-B2). Es ist kein lösliches Pigment sichtbar. 



   Physiologische Charakteristika :
Magermilch : Koagulation und Peptisierung sind zu beobachten. 



     Gelatineverflüssigung :   Variabel. 



   Nitratreduktion : Negativ. 



     Temperaturerfordernisse :   Maximales Wachstum und Sporenbildung sind zwischen 30 und 37 C festzustellen. Ein mittelmässiges Wachstum und mittelmässige Sporenbildung treten bei   430C   auf. Bei   500C   ist kein Wachstum zu erkennen. 



   Die Ergebnisse der Kohlenstoffverwertungsversuche, die mit den Stamm S. cinnamonensis ATCC 15413 durchgeführt wurden, sind in der folgenden Tabelle angegeben. Die Bedeutung der Symbole, die zur Kennzeichnung der Wachstumsreaktion angegeben wurden, sind folgende : + = Verwertung   (-i)   = voraussichtliche Verwertung (-) = fragliche Verwertung = keine Verwertung 
 EMI5.2 
 
<tb> 
<tb> Kohlenstoffquellen <SEP> : <SEP> Reaktion <SEP> :

   <SEP> 
<tb> D <SEP> (-i)-Xylose <SEP> + <SEP> 
<tb> L <SEP> (-f)-Ribose <SEP> (+) <SEP> 
<tb> L <SEP> (-Rhamnose <SEP> (+) <SEP> 
<tb> Dextrose <SEP> + <SEP> 
<tb> Fructose <SEP> +
<tb> Saccharose <SEP> (-) <SEP> 
<tb> Lactose <SEP> (-) <SEP> 
<tb> D <SEP> (- <SEP> !)-Raffinose <SEP> + <SEP> 
<tb> i-Inosit <SEP> + <SEP> 
<tb> Inulin <SEP> (-) <SEP> 
<tb> Maltose <SEP> + <SEP> 
<tb> Mannit
<tb> Salicin <SEP> +
<tb> d-Sorbit <SEP> (-) <SEP> 
<tb> D-Ribose <SEP> + <SEP> 
<tb> D <SEP> (+)-Trehalose <SEP> + <SEP> 
<tb> D <SEP> (* <SEP> -Mannose <SEP> * <SEP> 
<tb> 
 
Das Kulturmedium, das zur Bildung des neuen Antibiotikums aus S.

   cinnamonensis ATCC 15413 angewendet wird, kann eines einer Anzahl von Medien sein, da, wie aus den vorstehend angeführten 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 Verwertungsversuchen hervorgeht, der antibiotikumbildende Organismus in der Lage ist, Energie aus unterschiedlichen Quellen zu verwerten. Für eine wirtschaftliche Produktion ist es aber von Bedeutung, optimale Ausbeuten zu erzielen und eine leichte Isolierung des Antibiotikums zu ermöglichen, wobei gewisse Kulturmedien bevorzugt werden. So ist Melasse eine der bevorzugten Quellen für Kohlehydrate bei der Fermentation, obgleich Glucose, Fructose, Maltose, Stärke,   Inosit u. dgl. ebenfalls angewen-   det werden können. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, Sojabohnenmehl, Aminosäuremischungen u. dgl.

   Unter den anorganischen Nährsalzen, die dem Kulturmedium einverleibt werden können, 
 EMI6.1 
    Phosphat-,Chlorid-, Carbonat-u. dgl.-Ionen   liefern können. 



   Wesentliche Elemente, die für das Wachstum und die Entwicklung des verwendeten Mikroorganismus notwendig sind, sollen ebenfalls dem Kulturmedium einverleibt werden. Solche Spurenelemente kommen üblicherweise als Verunreinigungen in andern Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die ausreichend sind, um den Wuchserfordemissen des Organismus zu genügen. 



   Der Organismus, der zur Bildung des neuen Antibiotikums verwendet wird, lässt beträchtliche Variationen der Wachstumsbedingungen zu.. So wird beispielsweise der Organismus in einer Mehrzahl von Medien wachsen, in welchen der Anfangs-pH-Wert eher übermässig variiert. Vor der Beimpfung des Mediums mit dem Organismus ist es jedoch zweckmässig, den pH-Wert des Kulturmediums in Abhängigkeit von dem speziellen angewendeten Medium auf einen solchen zwischen etwa PH 6, 5 und etwa PH 7, 5 einzustellen. Wie dies bei andern Actinomyceten der Fall ist, wird das Medium bei Fortschreiten der Fermentation im allgemeinen zunehmend alkalisch und kann, während die unter Bildung des 
 EMI6.2 
 Organismus wachsen kann, bestimmt. 



   Eine submerse aerobe Kultur in grossen Tanks wird vorzugsweise für die Produktion wesentlicher Mengen des neuen Antibiotikums benutzt, ebenso wie dies bei ändern Antibiotika der Fall ist. Geringe Mengen des Antibiotikums werden zweckmässigerweise aus Schüttelkulturen in Kolben und Oberflächenkulturen in Flaschen erhalten. Das im sterilen Tank vorliegende Fermentationsmedium kann zur Einleitung der Fermentation mit einer Sporensuspension beimpft werden. Da jedoch eine Wachstumsverzögerung zu erwarten ist, wenn eine Sporensuspension als Impfmaterial verwendet wird, wird die vegetative Form der Kultur bevorzugt. Auf diese Weise wird durch Vermeidung der Wachstumsverzögerung eine wirksamere Ausnutzung der Fermentationsanlage ermöglicht.

   Demgemäss ist es zweckmässig, zuerst ein vegetatives Impfmaterial des Organismus herzustellen, indem eine relativ kleine Menge eines Kulturmediums mit einem im Sporenstadium befindlichen Organismus beimpft wird und wenn ein junges, aktives, vegetatives Impfmaterial erhalten worden ist, das vegetative Inoculat aseptisch in einen grossen Fermentationstank überzuführen. Das Medium, in welchem das vegetative Impfmaterial gebildet wird, kann entweder das gleiche, das auch für die Produktion des neuen Antibiotikums in grossem Massstab benutzt wird, oder ein davon verschiedenes Medium sein. 



   Der das neue Antibiotikum bildende   Organismus wächst   innerhalb eines breiten Temperaturbereiches zwischen etwa 25 bis etwa 450C. Maximales Wachstum und maximale Sporenbildung werden jedoch zwischen etwa 27 bis etwa 370C erfolgen und es wird bevorzugt, die Fermentation bei einer Temperatur zwischen etwa 27 und   300C   durchzuführen. 



   Wie bei aeroben submersen Kulturverfahren üblich, wird während der Fermentation sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Für ein wirksames Wachstum des Organismus und demgemäss für eine wirksame Bildung des neuen Antibiotikums beträgt das Luftvolumen, das im Tank bei der Bildung des Antibiotikums verwendet wird, vorzugsweise von etwa   0, 1 Vol. -Teile Luft/min/Vol. -Teil   Kulturmedium aufwärts. Das wirksamste Wachstum und optimale Ausbeuten an Antibiotikum werden erhalten, wenn das verwendete Luftvolumen wenigstens 1/2 Vol.-Teil Luft/min/Vol.-Teil des Kulturmediums beträgt und vorzugsweise wesentlich grösser ist. 



   Die Konzentration an aktivem Antibiotikum im Kulturmedium kann während der Fermentation bequem durch Prüfung der Proben des Kulturmediums in bezug auf deren Hemmwirkung gegen das Wachstum eines Organismus ermittelt werden, der durch die Anwesenheit dieses Antibiotikums gehemmt wird. Die Organismen Mycobakterium avium und Bacillus subtilis sind, wie gefunden wurde, für diesen Zweck geeignet. Die Prüfung der Proben kann durch an sich bekannte turbidiometrische oder SchalenPlattenmethoden (cup-plate methods) ausgeführt werden. 



   Im allgemeinen wird eine maximale Produktion des neuen Antibiotikums innerhalb etwa 2 bis 5 

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 Tagen nach Beimpfung des Kulturmediums bei Anwendung submerser aerober Kulturbedingungen oder einer Schüttelkolbenkultur und innerhalb etwa 5 bis 10 Tagen bei Anwendung einer Oberflächenkultur erreicht. 



   Die antibiotische Aktivität, die sich während der Fermentation einstellt, kann entweder in der antibiotischen Brühe, oder im Mycel, oder in beiden vorliegen. Demgemäss werden die Isolierungsmethoden, die bei der Bildung des neuen Antibiotikums angewendet werden, so abgestellt, dass eine maxima- le Rückgewinnung des Antibiotikums aus einer oder aus beiden Quellen erfolgt. So kann beispielsweise die erhaltene Fermentationsbrühe filtriert und das Filtrat mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert werden, um die antibiotische Aktivität zu gewinnen, die nicht durch den Mycelkuchen zurückgehalten wird. Ausserdem kann das im Mycelkuchen enthaltene Antibiotikum durch Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel gewonnen werden. Das Antibiotikum kann aus dem Extraktionslösungsmittel durch übliche, an sich bekannte Methoden gewonnen werden. 



   Zur noch näheren Erläuterung der Arbeitsweise gemäss der Erfindung werden die nachstehenden Beispiele angeführt. Obwohl in der Erfindung insbesondere auf den neu gefundenen Organismus Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 hingewiesen ist, ist zu berücksichtigen, dass die Bildung des neuen Antibiotikums durch Züchtung das neue Antibiotikum bildender Stämme von S. cinnamonensis oder Mutanten von das neue Antibiotikum bildenden Stämmen des S. cinnamonensis, einschliesslich der Mutanten ATCC 15413, im Rahmen der Erfindung liegt. Solche Stämme oder Mutanten können durch bekannte Methoden gebildet werden, wie beispielsweise dadurch, dass man einen Stamm von S. cinnamonensis Röntgenstrahlen oder UV-Strahlen oder der Wirkung chemischer Mittel, wie beispielsweise den Stickstoffsenfgasen, unterwirft. 



     Beispiel l :   Die Bildung des neuen Antibiotikums in Schüttelkolbenkulturen wird wie nachstehend erläutert. 



   Sporen des Streptomyces cinnamonensis-Stammes ATCC 15413 werden auf einem Schrägnähragar überimpft, der aus 5 g Casaminosäuren, 5 g Glycerin, 5 g Dextrin, 10 g Melasse, 5 g Hefe 2019, 1 g   K2HP04'5   ml einer Mineralstoffstammlösung, 20 g Agar und genügend Leitungswasser, um ein Gesamtvolumen von 11 einzustellen, hergestellt worden war. (Die Mineralstoffstammlösung enthielt 100 g Kaliumchlorid, 100 g   Magnesiumsulfat 7ES20,   2 g   FeSO   und 2 ml konzentrierte Salzsäure je Liter Lösung).

   Der pH-Wert des Sporenimpfmediums wurde auf 7, 6 bis 7, 8 eingestellt.   DerbeimpfteSchrägagar   wurde etwa 5 Tage bei etwa   300C   bebrütet und dann mit einer kleinen Menge sterilen, destillierten Wassers bedeckt und mässig abgeschabt, um die Organismen zu lösen und eine wässerige Suspension derselben herzustellen. 



   1 ml der so erhaltenen Suspension wurde zur Beimpfung von 100 ml eines Mediums für vegetatives Wachstum mit der folgenden Zusammensetzung verwendet : 
 EMI7.1 
 
<tb> 
<tb> Glucose <SEP> 15 <SEP> g <SEP> 
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Maismaische <SEP> Feststoffe <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 
<tb> Kalziumcarbonat <SEP> 2 <SEP> g <SEP> 
<tb> Rest <SEP> Wasser, <SEP> zur <SEP> Herstellung <SEP> von <SEP> 11.
<tb> 
 



    Das Medium dieser Zusammensetzung wurde vor der Beimpfung bei einer Temperatur von etwa 1200C und bei einem Druck von etwa 1, 05 kg/cm2 während etwa 30 min sterilisiert. Das beimpfte Me-   dium für das vegetative Wachstum wurde etwa 48 h bei einer Temperatur von etwa   300C   auf einer hinund herbewegten Schüttelmaschine mit etwa 5 cm Ausschlag bei einer Geschwindigkeit von 108 Umdr/min geschüttelt. 
 EMI7.2 
 wendet, das in 500 ml-Erlenmeyerkolben enthalten war.

   Das verwendete Produktionsmedium hatte folgende Zusammensetzung/l : 
 EMI7.3 
 
<tb> 
<tb> üiucose <SEP> lüg <SEP> 
<tb> Melasse <SEP> 20 <SEP> g <SEP> 
<tb> Pepton <SEP> 5 <SEP> g <SEP> 
<tb> Kalziumcarbonat <SEP> 2 <SEP> g <SEP> 
<tb> Rest <SEP> Wasser, <SEP> zur <SEP> Herstellung <SEP> von <SEP> 11.
<tb> 
 Die   beimpfte Produktionskultur wurde   etwa 5 Tage bei einer Temperatur zwischen etwa 26 und   300C   

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 auf einer wie oben beschriebenen, hin-und hergehenden Schüttelmaschine geschüttelt. Am Ende die- ses Zeitraumes wurden die Inhalte einer Anzahl von Schüttelkolben vereinigt und die Brühe wurde durch einen Büchner-Trichter unter Zuhilfenahme eines handelsüblichen Filtrierhilfsmittels filtriert.

   Die fil- trierte Kulturbrühe wurde mit 5n-Salzsäure auf einen pH-Wert von ungefähr 3 eingestellt und dann zweimal mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte wurden zur Trockne einge- dampft, der Rückstand in Chloroform wieder aufgelöst und die Lösung wurde filtriert. Das Filtrat wurde durch eine 2 X 48 cm-Säule, die mit Aktivkohle beschickt war (12 by 40 mesh Pittsburgh Cal carbon) (ein Produkt der Pittsburg Coke and Chemical Co., Neville Island, Pennsylvania) gegossen, die vorher mit Chloroform gewaschen wurde. Das antibiotische Filtrat wurde der Säule mit einem zusätzlichen Liter Chloroform aufgegeben.

   Die Fraktionen aus der chromatographischen Säule, die, wie durch Versuch festgestellt wurde, antibiotische Aktivität aufwiesen, wurden vereinigt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand in einem Lösungsmittelgemisch gelöst, das 10 Teile Methanol zu je Teil Wasser enthielt. Die verbleibende Lösung, die das Antibiotikum enthielt, wurde erwärmt und dann in einem Kühlraum abgestellt. Die Kristallisation des Antibiotikums erfolgte langsam in dem Masse, als ein Teil des Methanols verdampfte. Die Kristalle wurden in einer Zentrituge abgetrennt, mit kaltem Wasser gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet. Das so erhaltene Antibiotikum wurde aus Äther/Petrol- äther-Lösungsmittelgemisch umkristallisiert und im Vakuum getrocknet. 



   Beispiel 2 : Die Herstellung des neuen Antibiotikums im Massstab einer Versuchsanlage wird durch die folgende Verfahrensweise veranschaulicht :
Ein 2 1-Kolben,   der 800 ml   eines vegetativen Mediums mit einem Gehalt von 1% Maisstärke,   0, 50/0   Natriumchlorid,   0, 50/0   Pepton, 0,   50/0   Rindfleischextrakt und 0,   25%   Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthielt, wurde mit einer Suspension beimpft, die aus einer Nähragarschrägkultur, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurde. Das beimpfte vegetative Medium wurde bei etwa 280C 29 h auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 6, 25 cm Exzentrizität, die mit 250 Umdr/min arbeitete, bebrütet.

   Ein 50   ml-Anteil   der so erhaltenenvegetativen Kultur wurde zur Beimpfung eines 44 1-Impfbehälters verwendet : der Behälter enthielt ein Medium, das bei   1200C   30 min sterilisiert worden war und 1% lösliche Stärke, 0, 5% Hefeextrakt, 0,   5%   Pepton, 0, 5% Natriumchlorid und 0,   5%   Rindfleischextrakt in Wasser enthielt. Der Impfbehälter wurde 24 h nach der Beimpfung bei einer Temperatur von   280C   gehalten. Mit dem Rühren mit einer Rührgeschwindigkeit von 370 Umdr/min wurde nach 8 h begonnen. 



    Eine Belüftung   in einem Ausmass von 0,0113   m3/min   wurde während der ersten 8 h durchgeführt und dann auf ein Ausmass von 0,0396   m3/min   erhöht. Die Impftankkultur wurde zur Beimpfung eines 945   l   Fermenters verwendet, der ein sterilisiertes, wässeriges Fermentationsmedium enthielt, das 1% Glucose, 
 EMI8.1 
 der Fermentation gehalten. Die Belüftung während der Fermentation erfolgte in einem Ausmass von   0, 476 m3/min. Mit   einem Rühren mit 175 Umdr/min wurde nach 6 h begonnen und dieses Rühren wurde während der Fermentation fortgesetzt. Die Isolierung des Antibiotikums wurde wie in Beispiel 3 ausgeführt. 



   B   Beispiel 3 :   Die Herstellung eines gereinigten, das neue Antibiotikum enthaltenden Konzentrats aus einer Fermentationsbrühe wird durch die nachstehende Methode veranschaulicht :
Zu 825   l   einer Kultur, die nach der Verfahrensweise des Beispiels 2 erhalten worden ist, wurden 21 kg eines handelsüblichen Filtrierhilfsmittels zugesetzt. Die Brühe wurde sorgfältig mit dem Filtrierhilfsmittel gemischt und dann durch ein 61 cm-Platten-und Rahmenfilter filtriert. Der Filterkuchen wurde   aut   dem Filter mit einer Menge destillierten Wassers gewaschen, die ausreichend ist, um das Volumen des Filtrates auf 825 1 zu bringen. Der Filterkuchen wurde für eine weitere Behandlung zur Gewinnung zusätzlichen Antibiotikamaterials zurückgehalten. 



   Dem Filtrat wurden etwa 550 1 Chloroform zugesetzt und der pH-Wert der Mischung wurde durch Zugabe von 5n-Salzsäure auf etwa 3 erniedrigt. Die wässerige und organische Phase wurden innig etwa 30 min miteinander gemischt und dann durch Zentrifugieren getrennt. Die erschöpfte Kulturphase wurde abgegossen und die Chloroformphase im Vakuum auf ein Volumen von etwa 9450 ml eingeengt. Das Chloroformkonzentrat wurde dann durch eine Glassäule mit 12, 5 cm Durchmesser geleitet, die bis zu einer Betthöhe von 1674 cm mit Aktivkohle (12 by 40 mesh Pittsburgh Cal carbon) beschickt war ; die Säule wurde mit 50   l   Chloroform vorgewaschen, das durch die Säule in einer Menge von 500 ml/min hindurchgeleitet wurde. Das Chloroformkonzentrat, das das Antibiotikum enthielt, wurde durch die Säule in einer Menge von etwa 200ml/min hindurchgeführt.

   Die ersten 4   l   des aus der Säule ausfliessenden Materials, die das Säulen-Rückhaltevolumen darstellen, wurden verworfen. Nach dem Chloroform- 

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 konzentrat folgte eine Wäsche der Säule mit Chloroform. Etwa 50   l   des ausfliessenden Materials wiesen antibiotische Aktivität auf ; es wurde gesammelt und im Vakuum bis auf ein Volumen von etwa 370 ml eingeengt. 



   Ein zusätzliches antibiotisch aktives Material wurde aus dem Filterkuchen durch zweimaliges Hindurchführen von 70   l   Methanol durch die Filterpresse erhalten. Der Kuchen wurde verworfen und die vereinigten Methanoleluate wurden unter Vakuum auf ein Volumen von etwa 13   l   eingeengt. Man setzte dem Konzentrat etwa 8,   7 I   Chloroform zu und der pH-Wert wurde durch Zugabe von 5n-Salzsäure auf etwa 3 erniedrigt : die beiden Phasen wurden etwa 30 min lang innig vermischt und dann durch Zentrifugieren getrennt. Die erschöpfte Wasserphase wurde verworfen und die Chloroformphase im Vakuum auf ein Volumen von etwa 420 ml eingeengt.

   Das so erhaltene Konzentrat wurde zu jenem zugegeben, das aus dem Kulturfiltrat erhalten wurde, und die vereinigten Konzentrate wurden zur Herstellung von kristallinem Antibiotikum unter Anwendung eines Kristallisationsverfahrens verwendet, das jenem in Beispiel 1 ähnlich ist.

Claims (1)

  1. PATENTANSPRUCH : EMI9.1 zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet,das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen, aeroben Bedingungen züchtet, bis durch diesen Organismus in dem Kulturmedium eine wesentliche Menge des Antibiotikums gebildet ist, und gegebenenfalls das Antibiotikum aus dem Kulturmedium gewinnt.
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