DE1792362A1

DE1792362A1 - Verfahren zur Herstellung von ss-Amylase

Info

Publication number: DE1792362A1
Application number: DE19661792362
Authority: DE
Inventors: Masakazu Mitsuhashi
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 1965-07-08
Filing date: 1966-07-08
Publication date: 1971-05-13
Also published as: DE1517810B2; DE1517810C3; GB1130398A; US3492203A; DE1792362B2; DE1517810A1; DE1792362C3

Description

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8 München 2, HllbiestroBe 20

Anwaltsakt en-iir. 17 602

HAYA3HIBARA Company Ltd. 198 Shimoishii, Okayama-shi /Japan.

Ihr Zeichen Unser Zeichen Datum

IV/Gd 17.602 P 17 92 362.5

ii 9. Aug. 1969

Verfahren zur Herstellung von ß-Amylase.

i< Ur die Verzuckerung von Stärke, im wesentlichen durch Hydrolyse, ist es bekannt, Säure oder Malzextrakt zu verwenden. JLfie" Bestandteile des bei der sauren Verzuckerung erhaltenen Produkts sind Dextrose, Maltose und andere hochmolekulare Oligosaccharide, Dextrin und Gemische derselben. Hei Verwendung von Malz als Enzymquelle wird Malz (gekeimte Gerote) roh oder getrocknet verwendet. Das Enzym

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109820/1716 ßAO ORtöiNAL

enthält cC-Amylase und ß-Amylase, Das bei der Verwendung von Malz erhaltene verzuckerte Produkt enthält · hauptsächlich Maltose und eine kleinere Menge Dextrose, und ist beträchtlich von dem vorausgehenden, hinsichtlich der Eigenschaften und des süssen (J-eschmacks, verschieden. Darüberhinaus sind die .Bestandteile des bezeichneten Produkts schwierig zu reinigen, sind trübe, gefärbt und besitzen unangenehmen Geruch..

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her stellung reiner ß-Amylase aus Weizenkleie.

I\lach der vorliegenden Erfindung wird Weizenkleie mit Wasser bei der Temperatur von 20 bis 4O⁰G behandelt und ein ß^Amylase enthaltender Extrakt gewonnen.

Die Weizenkleie wurde mit wasser, ohne vorausgehende Pasteurisierung, behandelt, und diese extrahierte Lösung wurde geprüft. Die bezeichnete, extrahierte Losung enthielt eine grosse Menge ß-Amylase im Malz. Ed wurde hierbei festgestellt, dass die enthaltene Menge ungefähr der Hälfte der im Malz enthaltenen ß-Amylase entsprach.

g verschiedene Weizenkleiearten wurden mit der vierfachen Wassermenge (warm) bei 4O⁰C 1 1/2 Stunden gewässert

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BAD

und zentrifugiert. Die Ergebnisse der Wirksamkeitsunter sucbungen von ß-Amylase "bei diesen extrahierten liösungen sind in der Tabelle 1 angegeben.

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Weizenkleie als , _; ,Stärke- ₍ Gesamt- ß«Amylase- Rohmater'ial ' ' ^; "'wert ⁰Jq ''" stickstoff °/> einheiten/g Kanadisch.Weizen^x'u. '^{; :}"i- 2 39 274 Amerikan.Weizen^XX(i.;) =.-- '·,■■·■■ __■.:<.■;.■ . . ";■_■ ■■."-,.■-':..-,

Kanadisch.Weizen	A	41	,6	2	,55	243
Kanadisch.Weizen	1 .·. ; -	41	f3..	,2	,55	,: :319
Kanadisch.Weizen		41	1.1	2	,85	448
Kanadisch.Weizen	E	41	,6	3	,4	441

Japan:Nisshin oeifun _{CQ o} , _An ■ _xc-_r> K;L Produkt- (Schutz^ ■■"■ 58,2_: . .ν·;3,47 .350

marke "Flower "brand")

Japan: Marusbo Seifun

K.K.Produkt (Schutz-' ^! 48,^ - 2,47' ' " 471

marke "AA mark")

^yManito"ba Weizen

xx Hard Winter; Western White. -

Hie ß-Amylasewirksamkeit wurde an einem Produkt folgen der zusammensetzung ermittelt :

Iffcigre lösliche Stärkelösung 5 ml

iiii/TOEssi.e-säure'pufferlösung : ph 5,0 ' 4 ml'

SfizymlÖsüni? ' ' ' " ^; 1 ml

109820/1716 :' * ; - /·;

BAD

Die Lösung obiger Zusammensetzung wurde 3U Minuten bei 40⁰G umgesetzt, wobei der gebildete reduzierende Zucker quantitativ als Glucose bestimmt wurde. Der Enzymwert für die Zeit zur Herstellung von 1U mg Glucose wurde als 1 Verzuckerungseinheit bezeichnet.

Folgende Weizenkleienarten wurden verwendet : Kanadischer Manitobaweisen,
Amerikanischer Hardwinter,

Hisshin Seifun (Flower brand):. Gemisch von kanadischen, amerikanischem und|j apanischem Produkt,

Marusho Seifun (A.A.brand): Dito.

Aus der Tabelle I ist zu ersehen, dass die Aktivitätswerte der ß-Amylase beträchtlich in dem weiten Bereich der Weizenkleiearten wechseln, dass sie aber annähernd gleich sind der Hälfte von denen der Malzamyiase. Die Wassermenge ist ungefähr gleich oder viermal so gross als die Kleiemenge. Wenn sie zu gross ist* wird die EttzyiLLösung verdünnt. Weiterhin wurden die Enzymeigenschaften dieser Extraktlösungen untersucht und die Ergebnisse in Tabelle II festgehalten. Daraus ist zu ersehen, dass die Abbaukraft derselben in Maltose stark ist, jedoch das Abbauvermögen von Stärke in Dextrin vollständig fehlt.

Die Enzymeigenschaften sind daher in dieser Hinsicht

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BAD ORIGINAL

— D - '

unterschiedlich von einem Malzenzym. Darüberhinaus hat das Enzym nicht die Abbaueigenschaft von Maltose zu Glucose, sodass die Eigenschaften unterschiedlich sind von einer Glucoamylase und einer Hauptkomponente der ß-Amylase zugesprochen werden können.

Tabelle II.

Saccharogene Wirksamkeit 95,8 Einiu/ml Bextrinogene Wirksamkeit 0,53 ^H

Maltose Wirksamkeit 0,14 ⁿ

Die Einheiten in Tabelle II wurden wie folgt "bestimmt :

Saccharogene Wirksamkeit

1 f° lösliche Stärke 5 ml

M/10 Essigsäurepufferlösuhg 4 ml Snzymlösung 1 ml

Die Reaktionslösung der vorausgehenden Zusammensetzung wurde: bei 4U⁰G 30 u/finuten gehalten. Nach dem Fehling Lehman Schoorl Verfahren wurde der reduzierende Zucker quantitativ als Glucose analysiert.

Die Bildung von 10 mg Glucose wird als eine saccharogene Wirksamkeitseinheit bezeichnet.

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Dextrinogene Wirksamkeit

Eine Reaktionslösung mit der gleichen Zusammensetzung wie im Falle der Bestimmung der saccharagenen Wirksamkeit wurde bei 40 C umgesetzt und dann 0,5 ml der ergebenden Lösung gesammelt und in das colorimetrische Rohr (Innendurchmesser: 9 mm) eingebracht. Dann wurden 0,5 ml 0,001 N Jodlösung in 0,5 ml der bezeichneten Lösung zugegeben. Die Zeit, bis die Farbanzeige von Jod mit der Standard-Rot Farbe übereinstimmt, wurde gemessen.

(Die Farbphase einer 0,1 IT Jodlösung wurde als Standardfarbe bestimmt).

Die Enzymwirksamkeit der Überführung der Reaktionslösung in die rötliche Farbe im Zeitraum von 10 Minuten bei dieser Behandlung wurde als 1 Einheit der dextrinogenen Wirksamkeit bestimmt.

Maltasewirksamkeit

1 °/o Maltoselösung 5 ml

N/10 Essigsäurepufferlösung, pH 4,5 4 ml Enzymlösung 1 ml

Die bezeichnete Reaktionslösung wurde bei 40⁰G 30 Minuten umgesetzt und der reduzierte Zucker quantitativ analysiert.

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Sine Einheit Enzym wird als die Menge erläutert,die 10 mg Glucose in JO Minuten in Freiheit setzt.

Der Rückstand, der nach der Jüxzymextraktion zurückbleibt, kann für feste Kulturen für Mikroorganisamen, zum Beispiel Rhizopus oder Aspergillus, oder als Fut-termittel für Haustiere verwendet werden. Der Rückstand der Weizenkleie ist gegenüber dein Ausgangsprodukt um etwa TO bis 20$ mengenmässig verringert. Zum-Ausgleich kann man ungefähr 50 fo neue Kleie mit dem Extraktrück~ stand mischen, den Gesamtfeuchtigkeitsgehalt des sich ergebenden Gemische auf eine optimale Feuchtigkeit für die Kultivierung einstellen, das sich ergebende Gemisch nach einem herkömmlichen Verfahren dampfsterilisieren und die Mikroorganismen auf dem Medium zur Kultivierung impfen, wodurch das Enzym in 3 bis 4 Tagen, praktisch, wie wenn nicht-extrahierteKleie verwendet worden wäre, hergestellt werden kann,

Rhizopus formosensis wurde auf diesem Kulturmedium kultiviert, und die Verzuckerurtgs aktivität wurde bei dem hergestellten Enzym untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgezeigt.Bei diesem Versuch wurde nicht-extrahierte Weizenkleie, extrahierter Rückstand von Weizenkleie und ein Gemisch von extrahiertem Rückstand von Weizenkleie mit- AOfo nicht -extrahierter Weizenkleie auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 48 $ eingestellt. 16,5 g des

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bezeichneten sich ergebenden Gemische wurden in einen 200 ml fassenden, konischen Kolben gegeben und mit einem Baumwollpfropfen verschlossen un.d nach dem herkömmlichen Verfahren unter Druck sterilisiert. Dann wurde Rhizopus JTr. 47 mit einer Platinöse auf diesem Kulturmedium geimpft und die Kultivierung bei 28 bis 30⁰C durchgeführt. Dem Kulturmedium wurde in Zeitabständen am zweiten Tag, am dritten Tag und am vierten Tag Jeweils 100 ml warmes Wasser zugegeben. Dieses wurde unbewegt nach 1,5 Stunden bei Zimmertemperatur von 28 bis 30⁰C gelassen und dann, um die Extraktlösung zu erhalten, filtriert. Der Vergleich der Verzuckerungsaktivität wurde bei den bezeichneten Extraktlösungen vorgenommen.

Tabelle III

Saccharogene Aktivität Einheit/Gramm Kleie	2. Tag	3, Tag	4. Tag
	165,2 155,2 (160,2)	184,4 184,4 176,4 (181,7)	169,2 167,2 165,2 (167,2)
Weizenkleie Durchschn.	139,6 135,6 (137,6)	164,8 154,8 154,8 (158,1)	179,6 179,6 177,6 (178,9)
Extraktrückstand von Weizenkleie Durchschn.	146,8 146,8 (146,8)	182,0 180,0 176,0 (179,3)	Ϊ93,2 189,2 185,2 (189,2)
Extraktrückstand von Weizenkleie und Weizenkleie Durchschn.

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SAD

Dieses extrahierte saccharogene Enzym wurde in einer Menge von 4 Einheiten pro Gramm Stärke einer verflüssigten, süssen Kartoffelstärkeschlämme zugegeben in einem Abbauverhältnis (D.Ä.) von 5 bis 10$. Die sich ergebende Lösung wurde auf pH 5 eingestellt und 48 Stunden bei 55⁰C verzuckert und hierbei eine D ext ro selb'sung mit einem Abbauverhältnis (D.Ä.) von 98$ erhalten, Die obige Dextroselösung wurde gereinigt und auskristallisiert, und auf diese Weise wurde raffinierte Dextrose erhalten.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert :

B e i s ρ 1 e 1 1

Zu 5Ü0 g Weizenkleie aus kanadischem Weizen wurde die vierfache Menge warmes Wasser bei 40⁰G zugegeben und die erhaltene Lösung ausgelaugt und dann mit der Zentrifuge entwässert, wodurch 890 g Extraktrückstand (Feuchtigkeitsgehalt: 62,5$, Trockensubstanz: 383,8 g) und 1550 ml Extraktflüssigkeit (Trockensubstanz 89,7 g, Enzymaktivität o.A. 105 Einheit/ml) erhalten wurden.

B e i s ρ i e 1 2

Weizenkleie wird mit Wasser in einem gleichen Verhältnis gemischt und dieses Gemisch in einen zylindrischen Extra-

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hierungsturm gefüllt. Am Kopf des Turms wurde das Wasser mit einer Temperatur von 20 Ms 40⁰C eingesprüht und in den Turm eingebracht, und nach 10 Stunden war die Lösung bei dem unteren Abfluss auf das Zweifache der Kleiemenge, das heisst 200 Einheiten pro (ml) erhöht.

Patentansprüche :

109820/t718

Claims

Patentansprüche:

1, Verfahren zur Herstellung reiner ß-Amylase, dadurch gekennzeichnet, dass Weizenkleie mit Wasser bei einer Temperatur von 20 bis 4O⁰C extrahiert wird.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Jilxtrahieren der Weizenkleie verwendete Wassermenge gleich oder das bis Vierfache des Gewichts der Weizenkleie ist, '

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