DE1792362C3

DE1792362C3 - Verfahren zur Herstellung von reiner beta-Amylase. Ausscheidung aus 1517810

Info

Publication number: DE1792362C3
Application number: DE1792362A
Authority: DE
Inventors: Masakazu Okayama Mitsuhashi (Japan)
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 1965-07-08
Filing date: 1966-07-08
Publication date: 1974-04-25
Also published as: DE1792362A1; DE1517810B2; GB1130398A; DE1517810C3; US3492203A; DE1517810A1; DE1792362B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von reiner /9-Amylase aus Weizenkleie.

Für die Verzuckerung von Stärke, im wesentlichen durch Hydrolyse, ist es bekannt, Säure oder Malzextrakt zu verwenden. Die Bestandteile des bei der sauren Verzuckerung erhaltenen Produkts sind Dextrose, Maltose und andere hochmolekulare Oligosaccharide, Dextrin und Oemische derselben. Bei Verwendung von Malz als 1 nzymquelle wird Malz (geke'mte Herste) roh oder getrocknet verwendet. Das Enzym enthält \-Amylase und /3-Amylase. Das bei der Verwendung von Malz erhaltene verzuckerte Produkt enthält hauptsächlich Maltose und eine kleinere Menge Dextrose und ist b-ciracb'lich von dem Vorausgehenden, hinsidv'ich der Eigenschaften und des süßen Geschmacks, verschieden. Darüber hinaus sind die Bestandteile des bezeichneten Produkts schwierig /\i reinigen, sind trübe, gefärbt und besitzen einen unangenehmen Geruch.

Λ js Biochemical Journal, Vol. 84 (1%2), S. 73, ist bekannt, daß eiua NO⁰Z₁, der/f-Amyla^e in ungekeimtem Weizen als inaktive latente /i-Amylase vorliegen. Diese inaktive Form ist sehr stabil und nicht leicht in die aktivierte Form zu überführen. Mehr als 80^r ₀ der b'enten /j-Amyiase des Weizenmehls liegen in der i .löslichen Glutenin-Stärke-Fraktion vor. Hieraus kann die latente /J-Amylase durch mit Cystein aktiviertes Papain in Lösung gebracht werden. Cs ist a jch möglich, mit Speichel-\-Amylase die gesamte Stärke abzubauen, wobei eii: geringer Verlust des an das vorbleibende unlösliche Glutenin geb"nd· .en Enzyms eintritt. Von diesem Glutenin kann rMe /J-Aiitylase mit Papain abgelöst werden. Für den 1 folg ist also de Einsatz von Enzymen zwingend.

In CA., Vol. 62 (1965), Spalte 15000, wird ein Verfahren zur Herstellung von /?-Amylase aus Hard-Spnng-Weizenmehl angegeben, das eine komplizierte Reihe von Verfahrensstufen, wie Extraktion, Zentrifugieren, Aussalzen mit Ammoniumsulfat und Fraklionieren an Diäthylaminoäthyl-Cellulose (DFAl:- Cclhilose), umfaßt. Angaben über die erhaltenen Ment'cn und Ausbeuten an /J-Amylase fehlen. Das Verfahren dieser Veröffentlichung erfordert, wie der Beschreibung entnommen werden muß, zur Durchführung etwa 7 bis 10 Tage. [Ls ist deshalb und infolge der Verwendung der kostspieligen DEAF.-Cellulose unökonomisch und fur die Anwendung in der Praxis nicht geeignet.

Das Referat in C. A., Vol. 46 (1952), 4135a stellt fest, daß Analysen verschiedener Siebfraktionen zeigen, daß die Weizen-Weißniehl-Fi aktion die reichste an /5-Amylase und die amine an \-Amylasc ist, daß hingegen die Kleie, der Keim und das Mehl vom vierzehnten Sieb die an \-Amylase reichsten Fraktionen sind. Hiernach erschien eine Extraktion von/ϊ-Amylase aus Weizenkleie nicht naheliegend.

Es wurde nunmehr gefunden, daß man in sehr einfacher und ökonomischer Weise reine /?-Amylase aus Weizenkleie erhält, wenn man die Weizenkleie mit Wasser bei einer Temperatur von 20 bis 40⁼C extrahiert, wobei die Wassermenge die gleiche bis vierfache Menge der Kleie ist.

Die Weizen kleie wurde ohne vorausgehende Pasteurisierung mit Wasser behandelt und die so extrahierte Lösung untersucht. Die Extraktlösung enthielt eine große Menge an ß-Amylase.

500 verschiedene Weizenkleiearten wurden mit der vierfachen Wassermenge bei 40"C 1,5 Stunden lang gewässert und zentrifugiert. Die Ergebnisse der Wirksamkeitsuntersuchungen von /?-Amylase bei diesen extrahierten Lösungen sind in der Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Weizenkleie
als Rohmaterial aus

Kanadischer

Weizen*) und
Amerikanischer

Kanadischer

Weizen A

Kanadischer

Weizen B

Kanadischer

Weizen C

Kanadischer

Weizen E

Japan:

Nisshin Seifun

K K. Produkt .
Japan:

Marusho Seifun

K. K. Produkt .

*) Manitoba-Weizen.
*·) Hard-Winler; Western-White.

Stär!:-- wert %	Gesamt stickstoff Vo
41	2,39
41,6	2,55
41,3	2,55
41,7	2,85
41,6	3,4
58,2	3,47
48,4	2,47

/i-Amylaseeinheiien/g

274
243
319
448
441

350

471

Die rf-Amylasewirksamkcil wurde mit einer Probe folgender Zusammensetzung ermittelt:

l°/_oige lösliche Stärkelösung 5 ml

M/10 Essigsäure-Pufferlösung,

pH-Wert 5,0 4 ml

Enzymlösung 1 ml

Die Lösung mit der obigen Zusammensetzung wurde 30 Minuten lang bei 40⁰C umgesetzt, wobei der gebildete reduzierende Zucker quantitativ als Glucose bestimmt wurde. Der Enzymwetl für die Zeit zur Herstellung von 10 mg Glucose wurde als 1 Ver-/lckerungseinheit bezeichnet.

Aus der Tabelle I ist zu ersehen, daß die Aktivitätswerte der ,'?-Amylase in dem weiten Bereicl. der Weizenkleiearten beträchtlich variieren, daß sie aber annähernd der Hälfte von denen der Malzamylasc gleich sind.

Die Wassermenge zur Extraktion ist etwa gleiJ.i oder viermal so groß wie die eingesetzte Kleiemengc. Wenn sie zu groß ist, wird die Enzymlösung zu stark verdünnt. Weiterhin wurden die Enzymeigenschaften dieser Fxtraktlösungen untersucht und die Ergebnisse

in der Tabelle II niedergelegt. Daraus ist zu ersehen, Zeit, bis die Farbanzeige von Jod mit der Rot-Farbe

daß die saccharogene Wirksamkeit stark ist, daß jedoch des Standards übereinstimmt, wurde gemessen. (Die

das Abbauvermögen von Stärke zu Dextrin fast voll- Farbphase einer O.ln-Jodlösung wurde als Standard-

itändig fehlt. farbe bestimmt.)

Darüber hinaus besitzt das Enzym nicht die Eigen- 5 Die Enzymwirksamkeit, die bei dieser Behandlung

schaft. Maltose zu Glucose abzubauen, so daß somit in einem Zeitraum von 10 Minuten die Reaktions-

die Eigenschaften unterschiedlich von denen von lösung rötlich färbt, wurde als 1 Einheit der dextrino-

Clucoamylase sind. genen Wirksamkeit definiert.

Tabelle II Maltasewirksamkeit

Saccharogene Wirksamkeit 95,8 Einheiten/ml ¹⁰ 1 °/₀ Maltoselösung 5 ml

Dextrinogene Wirksamkeit 0,53 Einheiten/ml N/10 Essigsäure-Pufferlösung,

Maltase-Wirksamkeit 0,14 Einheiten/ml pH-Wert 4,5 4 ml

Die Einheiten in Tabelle II wurden wie folgt be- Enzymlösung 1 ml

stimmt: i₅ Die bezeichnete Reaktionslösung wurde bei 40⁰C

Saccharogene Wirksamkeit ^{30 Minuten lan}8 ymgesctztund der reduzierte Zucker

ιοί ι- r ι. c*- quantitativ analysiert. Eine Enzym-Einheit der Maltase-

L¹An* ■ - η « '.' Wirksamkeit wird als die Menge definiert, die in 30 Mi-

M/10 Essigsäure-Pufferlösung, nuten 10 mg Glucose freisetzt.

pH-wert 5,u 4 ml _{20 Der} Rückstand, der nach der Enzymextraktion

bnzymlosung 1 ml zurückbleibt, kann für feste Kulturen von Mikro-

Die Reaktionslösung der vorstehenden Zusammen- Organismen, z. B. Rhizopus oder Aspergillus, oder als

Setzung wurde 30 Minuten lang bei 40⁰C gehalten. Futtermittel für Haustiere verwendet werden. Der

Nach dem Fehling-Lehman-Schoorl-Verfahren wurde Rückstand der Weizenkleie hat sich gegenüber dem

der reduzierende Zucker quantitativ als Glucose 25 Ausgangsprodukt mengenmäßig um etws. 10 bis 20°/₀

analysiert. verringert.

Die Bildung von 10 mg Glucose wird als 1 Einheit Die vorliegende Erfindung wird durch das nach-

der saccharogenen Wirksamkeit bezeichnet. folgende Beispiel erläutert:

Dextrinogene Wirksamkeit ,₀ Beispiel

Eine Reaktionslösung von gleicher Zusammen- Zu 500 g Weizenkleie aus kanadischem Weizen

Setzung wie im Falle der Bestimmung der saccharo- wurde bei 40⁰C die vierfache Menge warmes Wasser

gencn Wirksamkeit wurde bei 40° C umgesetzt und zugegeben, ausgelaugt und dann mit der Zentrifuge

dann 0,5 ml der erhaltenen Lösung in das Rohr entwässert; man erhielt 890 g Extraktrückstand

(Innendurchmesser: 9 mm) des Colorimeters einge- 35 (Feuchtigkeitsgehalt:62,5°/₀,Trockensubstanz:383,8g)

bracht. Dann wurden 0,5 ml einer 0,001 n-Jodlösung und 1550 ml Extraktflüssigkeit (Trockensubstanz:

in 0,5 ml der bezeichneten Lösung zugegeben. Die 89,7 g, Saccharogene Aktivität 105 Einheiten/ml).

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von reiner /3-Amylase aus Weizenkleie, dadurch gekennzeichnet, daß man die Weizenkleie mit Wasser bei einer Temperatur von 20 bis 4O⁰C extrahiert, wobei die Wassermenge die gleiche bis vierfache Menge der Kleie ist.