DE2731570C3 - Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharide mit therapeutischer Wirkung - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharide mit therapeutischer Wirkung

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DE2731570C3 DE2731570A DE2731570A DE2731570C3 DE 2731570 C3 DE2731570 C3 DE 2731570C3 DE 2731570 A DE2731570 A DE 2731570A DE 2731570 A DE2731570 A DE 2731570A DE 2731570 C3 DE2731570 C3 DE 2731570C3
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharids mit therapeutischer Wirkung, das insbesondere gegen Krebserkrankungen wirksam ist, aus submersen Kulturen von Fungi der Gattung Coriolus der Klasse Basidiomycetes.
Es ist bekannt, daß Polysaccharide mit Anlitumorwirkung aus Kulturen von Fungi der Klasse Basidiomycetes in wäßrigen flüssigen Medien erhalten werden können. Es ist auch bekannt, daß, wenn man einen Fungus der Klasse Basidiomycetes in einem flüssigen Medium submers kultiviert, das gewünschte Polysaccharid nicht nur im Mycel, sondern auch im Kulturmedium angetroffen wird.
Für die Gewinnung eines Polysaccharids aus submersen Kulturen von Fungi der Gattung Coriolus der
30 Klasse Rasidiomycetes hat man daher allgemein ein Verfahren angewandt bei dem das Mycel zerkleinert wird, wobei man gegebenenfalls Wasser zum Kulturmedium gibt und darauf filtriert oder zentrifugiert, um den Mycelrückstand zu entfernen. Anschließend wird das gewünschte Polysaccharid aus dem flüssigen Anteil gewonnen. Vergleiche die DE-OS 21 38 329.
Obgleich man diese Methode als rationell und praktisch bezeichnen kann, ist sie mit einigen schwerwiegenden Nachteilen behaftet Wenn man zum Beispiel die submerse Kultur unmittelbar in Mycel und Flüssigkeit aufteilt, läßt sich eine solche Auftrennung nicht nur wegen der erhöhten Viskosität des Systems, sondern auch wegen des hohen Wassergehaltes des Mycels nicht wirksam durchführen. Die Zugabe von Wasser verringert zwar die Viskosität des Kulturmediums, verstärkt aber auch die Extraktion des Wirkstoffes in das Wasser. Die Verwendung eines Überschusses an Wasser verlängert die für die Auftrennung erforderliche Zeit und verringert natürlich auch nicht den Wassergehalt des Mycels.
Ziel der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharides aus den zuvor genannten submersen Kulturen mit höherer Wirksamkeit und in höherer Ausbeute.
Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert
Das wesentliche Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß man den Wirkstoff nicht direkt aus dem Kulturmedium gewinnt, sondern es erst trocknet und dann mit einem wäßrigen Lösungsmittel extrahiert.
Die verwendbaren Fungi der Klasse Basidiomycetes gehören der Gattung Coriolus an und umfassen zum Beispiel Coriolus versicolor (Fr.) Quel, Coriolus consors (Berk.) lmaz., Coriolus hirsutus (Fr.) Quel, Coriolus pargamenus (Fr.) Pat, Coriolus pubescens (Fr.) Quel und Coriolus copchifer (Schw.) Pat Die morphologischen und mykologischen Eigenschaften dieser Basidiomyceten sind in »Coloured Illustration of Fungi of Japan« von Rokuya lmazeki und Tsuguo Hongo, Band 1, 1974, und Band II, 1975, beschrieben. Von diesen Basidiomyceten sind die nachstehend aufgeführten im Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt.
Coriolus versicolor (I-"r.) Quel:
Coriolus consors (Berk.) Imaz.:
Coriolus hirsutus (Fr.) Quel:
Coriolus pargamenus (Fr.) Pat:
Hintcriegungs- Ilintcrlegungs
Nr. datum
FERM-P-2414 25. Dez. 73
FERM-P-988 24. Juni 71
FERM-P-2711 6. Sept. 74
FERM-P-2712 6. Sept. 74
Der Ausdruck »submerse Kultivierung« bezeichnet die Kultivierung in einem flüssigen Medium unter Belüftung und Rühren, so daß das Mycelwachstum nicht w) an der Oberfläche des flüssigen Mediums erfolgt, sondern meist im tiefen Teil der Flüssigkeitsschicht. Die Belüftungsgeschwindigkeit beträgt bei dieser Art der Kultivierung im allgemeinen etwa 0,1 bis 2,0 l/l/Min. (Medium) und die Rührgeschwindigkeit etwa 30 bis 800 br> U/Min.
Als Medium für die submerse Kultur kann jedes für die Kultivierung von Mikroorganismen bekannte natürliche oder synthetische Medium verwendet werden, oder geeignete Modifizierungen dieser bekannten Medien. Mit einem solchen Medium ist eine Wachstumzeit von etwa 3 bis 10 Tagen ausreichend, um das gewünschte Polysaccharid in zufriedenstellend hoher Ausbeute zu gewinnen.
Bei der submersen Kultivierung in einem wäßrigen Medium tritt das Mycel nicht an die Flüssigkeitsoberfläche unter Bildung ausgedehnter Massen wie im Falle stationärer Kulturen, sondern fällt aufgrund der Scherwirkung durch das Rühren in Form von verhältnis-
mäßig !deinen Pellet-ähniichen oder faserartigen Stükken an. Bei dieser Verfahrensweise wird das Polysaccharid nicht nur im Inneren des Mycels, sondern auch außen gebildet, daß heißt es befindet sich auch im Medium.
Erfindungsgernäß wird das bei der submersen Kultivierung eines Fungus der Gattung Coriolus der Klasse Basidiomycetes gebildete Kulturmedium getrocknet Diese Trocknung wird gewöhnlich bei Temperaturen von 60 bis 1500C durchgeführt Die Trocknung und die hierfür verwendeten Vorrichtungen können beliebiger Art sein. Gewöhnlich verwendet man die hierfür üblicherweise angewandten, zum Beispiel Trommeltrockner, Abflußtrockner oder Dünnschichtverdampfer.
Diese Trocknungsbehandlung erleichtert die nachfolgende Extraktion mit einem wäßrigen Lösungsmittel sowie die Gewinnung des Polysaccharids durch Reinigung der Extraktionslösung außerordentlich. Dabei ist darauf hinzuweisen, daß bei Durchführung der Trocknung unter 600C nicht nur die Trocknungsgeschwindigkeit gering ist, sondern auch die oben angestrebten Wirkungen nicht in zufriedenstellender Weise erreicht werden. Außerdem ist zu beachten, daß das Polysaccharid mit steigender Trocknungstemperatur zur Zersetzung neigt, so daß die Trocknung nicht bei einer Temperatur von über 150° C durchgeführt werden sollte.
Die wie vorstehend angegeben getrocknete Kulturbrühe wird dann in üblicher Weise mit einem wäßrigen Lösungsmittel extrahiert. Der Ausdruck »wäßriges jo Lösungsmittel« bezeichnet vorliegend Wasser oder eine wäßrige, ein Alkalisalz, wie zum Beispiel Natriumchlorid oder Natriumacetat, oder ein polares organisches Lösungsmittel, wie zum Beispiel Methanol, Äthanol und
Tabelle 1
dergleichen, enthaltende Lösung. Im erfindungsgemäßen Verfahren ist jedoch die Extraktion unter Erhitzen mit Wasser oder einer verdünnten alkalischen Lösung am wirksamsten. Am vorteilhaftesten für die technische Anwendung ist die Mehrfachextraktion unter Verwendung einer solchen Extraktionslösung.
Der erhaltene Extrakt wird dann zur Entfernung der Substanzen mit einem Molekulargewicht von unter 5000 gereinigt, um das gewünschte Polysaccharid zu erhalten. Diese Reinigung kann in jeder bekannten geeigneten Weise erfolgen, zum Beispiel durch Aussalzen, Dialyse, Ultrafiltration, Umkehr-Osmose, Ionenaustauschbehandlung, Gelfiltration, oder Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel Diese Techniken können allein oder in Kombination angewandt werden.
Am wirksamsten für die erfindungsgemäßen Zwecke ist die Ultrafiltration und die Umkehr-Osmose.
Nach der Entfernung der Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht von unter 5000 aus der Extraktlösung wird diese sprühgetrocknet oder gefriergetrocknet und dann in Handelsprodukte übergeführt.
Das in erfindungsgemäßer Weise erhaltene Polysaccharid stellt eine leberbraune Substanz mit einem Stickstoffgehalt von 2 bis 8%, in den meisten Fällen von 3 bis 6% dar, die keinen ausgeprägten Schmelzpunkt besitzt, sondern allmählich schwarz wird und sich bei Temperaturen von über etwa 1200C zersetzt Sie ist in Wasser löslich, in Alkohol, Pyridin, Chloroform, Benzol und Hexan aber nahezu unlöslich. Ferner ist sie nahezu geschmack- und geruchlos.
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse verschiedener Farbreaktionstests mit der erfindungsgemäßen hergestellten Verbindung zusammengestellt.
Farbreaktion
Farbe Ergebnisse
α-Naphthol-Schwefelsäure Reaktion (Molish's purpur Reaktion)
Indol-Schwefelsäure Reaktion (Disch's Reaktion) braun
Anthron-Schwcfelsäure Reaktion grünlich-blau
Phenol-Schwefelsäure Reaktion braun
Triptophan-Schwefelsäure Reaktion purpur-braun
Lowry-Folin Verfahren blau
Ninhydrin-Reaktion nach der Hydrolyse mit purpur-blau ChlorwasserstofTsäure
Saccharide, bestätigt
Saccharide, bestätigt
Saccharide, bestätigt
Saccharide, bestätigt
Saccharide, bestätigt
Peptidbindungen, bestätigt
»-Aminosäuren, bestätigt
Die Testergebnisse in der obigen Tabelle zeigen an, daß es sich bei der erfindungsgemäßen hergestellten Substanz um ein stickstoffhaltiges Polysaccharid handelt. Ihr durch Ultrazentrifugition ermitteltes Molekulargewicht lag im Bereich von 5000 bis 300 000 und das mittlere Molekulargewicht betrug 10 000 bis 100 000. Die unter Anwendung anderer Methoden ermittelten Werte, zum Beispiel durch Fraktionierung oder durch Ultrafiltration lagen sämtlich im Bereich von 10 000 bis 100 000. Man kann daher in berechtigter Weise annehmen, daß das durchschnittliche Molekulargewicht der erfindungsgemäßen Substanz im Bereich von 10 000 bis 100 000 liegt.
Das erfindungsgemäß erhältliche stickstoffhaltige Polysaccharid zeigt ausgezeichnete Antitumorwirksamkeit bei Mäusen, und zwar nicht nur bei intraperitonea-Ier, sondern auch bei oraler Verabreichung. Es stellt also ein oral wirksames Mittel für die Behandlung von Krebserkrankungen dar. Außer der oralen Antitumorwirkung zeigt es hohe Wirksamkeit bei der Wiederherstellung unterdrückter Immunreaktionen. Das heißt, die erfindungsgemäße Substanz eignet sich nicht nur für die
br) Verhinderung der unerwünschten Nebenreaktionen bei de Krebsbehandlung mit chemotherapeutischen Mitteln und der erhöhten Empfindlichkeit bei der Radiotherapie, sondern auch zur Verhinderung eines
Abfalls der Immunreaktionen oder der physischen Widerstandsfähigkeit eines Patienten nach chirurgischen Eingriffen oder Bluttransfusionen und zur Behandlung oder Verhinderung von Virus- oder Bakterieninfektionen bei verringerter Immunreaktion bzw. physischer Widerstandskraft eines Patienten. Die orale Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz führte auch zu einer ausgezeichneten Wirkung in Bezug auf die Verbesserung der Leberfunktion, die Förderung des Appetits, die Heilung von Magen-Darm-Erkrankungen und die Förderung der Urinausscheidung. Sie eignet sich auch zur Behandlung der Lepra.
Die erfindungsgemäßen Saccharide sind hinsichtlich ihrer Anti-Tumorwirkung den Glucanen der bereits
10 genannten DE-OS 21 38 329, die keinen Stickstoff enthalten und aus dem Kulturmedium der Züchtung von Fungi der Gattung Coriolus durch Abfiltrieren des Mycels und Ausfällung aus dem mycelfreien Kulturmedium mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel gewonnen werden, überlegen.
Dies wurde anhand von Vergleichsversuchen nachgewiesen, die mit dem nach Beispiel 2 der DE-OS 21 38 329 unter Verwendung von Coriolus versicolor FERMP-1022 erhaltenen Glucan sowie dem nach Beispiel 1 (Nr. 3) gemäß der Erfindung erzeugten Polysaccharid durchgeführt wurden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:
Testsubstanz
Elementaranalyse
Intraperitoneale Verabreichung
Dosis')
I. R.2)
Orale Verabreichung
Dosis3)
I. R.2)
Polysaccharid gem. Beisp. 2 der
DE-OS
40.2 7,0 0
10 mg/kg
92
95
Polysaccharid nach Beisp. 1 (Nr. 3) 42,0 5,9 3,4 10 mg/kg der Erfindung
') 10 mg/kg ein über den anderen Tag, 10 Dosen in 20 Tagen
2) Hemm-Verhältnis gegen
Gewicht des Tumors der Kontrelltiere - Gewicht des Tumors der behandelten Tiere
Sarcoma 180 = ————-—— -,—:; rrr.
Gewicht des Tumors der Kontrolltiere
3) 1000 mg/kg, 20 Tage lang jeden Tag
1000 mg/kg 1000 mg/kg
24 70
x 100
Die erhaltenen Werte zeigen, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid bei oraler Verabreichung dem bekannten weit überlegen ist. Die Vorteile einer oralen Therapie gegenüber einer, die parenterale Injektionen erfordert, liegen auf der Hand.
Das nachfolgende Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren. In ihm beziehen sich alle Prozentsätze, sofern nichts anderes angegeben ist, auf das Gewicht.
Beispiel
1600 Liter eines Mediums aus 10% Glukose, 1,5% Hefeextrakt, 0,1% KH2PO4 und 0,1% MgSO4 · 7 H2O wurden in einen senkrecht stehenden 2-m3-Fermentationsbehälter gegeben. Dieses Medium wurde mit 20 Liter einer Aufschlämmung von Coriolus versicolor (Fr.) Quel FERM-P-2414 beimpft, die aus einer Schüttelkultur nach 7tägiger Kultivierung be; 26°C bei einer B^lüftungsgeschwindigkeit von 0,5 l/Min, je Liter Medium und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/Min, erhalten worden war.
Das iio erhaltene Kulturmedium (Aufschlämmung) wurde in etwa 500 Liter Anteile aufgeteilt. Jeder dieser Teile Wurde in einem Doppeltrommel-Trockner getrocknet. Die Oberflächentemperatur des Trommeltrockners wurde so eii-äosteiit, daß die Temperatur der Oberfläche der Kulturbrühe (die Brühe befindet sich in Form einer dünnen Schicht auf der Trommeloberfläche) 65° C, 800C, 900C, 1100C bzw. 145° C betrug und der Wassergehalt jedes getrockneten Produkts weniger als 20 Gew.-% ausmachte, vgl. Tabelle 2 unten.
Dann wurden zu jedem dieser getrockneten Produkte 250 Liter heißes Wasser gegeben, und es wurde drei Stunden bei 95±1°C extrahiert. Nach dem Kühlen wurde in Mycelrückstand und Extraktlösung getrennt, wofür man eine Schrauben-Dekantiervorrichtung und eine Plattenzentrifuge verwendete. Die scheinbare Viskosität der Mischung und die für die Zentrifugalabscheidung erforderliche Zeit sind in der nachstehenden Tabelle 2 zusammengestellt.
Der in der oben beschriebenen Weise erhaltene Extrakt wurde durch eine PM-5-Membran eines HF-Ultrafilters der Amicon Company geführt, um aus dem Extrakt die Verbindungen mit einem Molekulargewicht von unter 5000 zu entfernen. Man erhielt etwa 100 Liter gereinigte Lösung. Da die Konzentration der gereinigten Lösung nur etwa 1% betrug, wurde sie auf eine für die nachfolgende Sprühtrocknung geeignete Konzentration gebracht. Nachdem bei einer Konzentrierung über einen bestimmten Wert die gereinigte Lösung geliert und die Behandlung schwierig macht, ist der Grenzwert der Konzentration, unterhalb dem keine Gelierung eintritt, als kritische Konzentration in der Tabelle 2 angegeben.
Die für die Sprühtrocknung der oben genannten konzentrierten Lösung erforderliche Zeit und die erzielte Ausbeute an Polysaccharid ist ebenfalls in der Tabelle 2 aufgeführt.
Für Vergleichszwecke wurde eine in gleicher Weise erhaltene Kulturbrühe bei 45°C bzw. 160°C bzw. überhaupt nicht getrocknet. Die mit diesen Proben erzielten Ergebnisse sind gleichfalls in der Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2 Beispiele 2 27 31 570 5 8 2 Verunreini I
ΐ
ι
ι 		3
7 Probe, 1 80 145 160 gungen keine I
Trocknung |
Nr. 65 20 6 Vergleichsbeispiele 2
Trocknungstemperatur, 0C 20 1 I
Wassergehalt nach dem 31 3 4 27 45 26 i
Trocknen, Gew.-% 31 90 110 50 ψ
Menge der getrockneten 250 17 12 250 250 ο Ι
Kultur, kg 250 50 I
Menge des für die Extraktion 150 30 28 100 100 250 I
verwendeten heißen Wassers,! 150 350 i
Scheinbare Viskosität der zu 35 250 250 30 30 90 I
extrahierenden Mischung, cps 35 200 '■%
Für die Trennung erforderliche 5,5 100 100 5 5 20 1
Zeit, Min. 5,5 60 I
Für die Ultrafiltration erforder 15 35 30 15 15 4 ρ
liche Zeit, Stunden 15 10 i
Kritische Konzentration der 10 5,5 5 10 10 37 I
gereinigten Lösung, Gew.-% 10 8 I
Für die Sprühtrocknung erforder 900 15 15 900 800 950 1
liche Zeit, Stunden 900 24 I
Ausbeute, g 10 10
Antitumorwirkung (Tumor- 97 97 950 60 95 I
Hemmung, %): 96 67 900 900 62 10 71 f
Intraperitoneale Verabreichung 65 enthält |
Orale Verabreichung 93 Verunreini- §j
• Bemerkungen 95 98 65 gungen I
70 60 enthält
Aus den Zahlenwerten der Tabelle 2 geht hervor, daß bei Trocknung der Kultur im angegebenen Temperaturbereich, insbesondere bei Temperaturen von 60 bis 150° C, die Extraklionsbehandiung, die Reinigung des Extrakts, die Einengen der gereinigten Lösung und die Sprühtrocknung sehr rationell und zweckmäßig durchgeführt werden kann.
Alle erhaltenen Polysaccharidprodukte bestanden aus einem braunen, in Wasser leicht löslichen Pulver. Das Produkt des Vergleichsbeispiels 3 enthielt eine Spur unlöslicher Stoffe. Die Elementaranalysen der Produkte zeigten, daß diese aus C, H, N und O bestanden, wobei der Stickstoff etwa 3 bis 3,5% ausmachte. Auch die Ergebnisse der verschiedenen Farbreaktionstests in der Tabelle 1 zeigen, daß die erhaltenen Produkte aus Stickstoff enthaltenden Polysacchariden bestehen.
Die Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Substanz gegenüber festen Sarcoma- 180-Tumoren bei Mäusen, sowohl nach intraperitonealer als auch nach oraler Verabreichung, geht aus der Tabelle 2 hervor, die eine ausgezeichnete Hemmwirkung in allen Fällen anzeigt, die Probe ausgenommen, bei der die Trocknungsbehandlung bei einer Temperatur über 1500C durchgeführt wurde. Die Tumor-Hemmwirkung wurde unter Anwendung einer üblichen Methode bestimmt, die nachfolgend beschrieben ist:
Die Sarcoma-ISO-Tumorzellen wurden intraperitoneal in Mäuse transplantiert und nach 7tägigem Wachstum wurden 106 dieser Zellen weiter unter die Achselhaut anderer Mäuse transplantiert, um feste Tumoren zu bilden. Die Proben wurden 24 Stunden nach der Transplantation verabreicht Bei intraperitonealer Verabreichung wurden die Substanzen einmal je Tag in einer Dosis von 10 mg/kg verabreicht, und zwar insgesamt 20 Tage, so daß eine Gesamtmenge von 0,2
so ml/20 g (Körpergewicht der Maus) verabreicht wurde. Bei oraler Verabreichung wurde die Substanz einmal je Tag in einer Menge von 1000 mg/kg verabfolgt, ebenfalls insgesamt 20 Tage lang, so daß eine Gesamtmenge von 0,2 ml/20 g (Körpergewicht der Maus) verabfolgt wurde. Jede Geschwulst wurde 25 Tage nach der Transplantation herausgeschält und die Tumor-Hemmwirkung aus dem durchschnittlichen Gewicht der Tumoren bei den Mäusen, denen die Substanz verabfolgt worden war und dem durchschnittlichen Gewicht der Tumoren der Kontrollgruppe errechnet

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Gewinnung eines therapeutisch wirksamen Polysaccharids durch Züchtung eines Fungus der Gattung Coriolus der Klasse Basidiomycetes in einem wäßrigen flüssigen Medium unter submersen Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die erhaltene Kultur bei einer Temperatur von 60 bis 1500C trocknet, dann mit einem wäßrigen Lösungsmittel extrahiert und den erhaltenen Extrakt durch Entfernung der Substanzen mit einem Molekulargewicht von unter 5000 reinigt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion mit einem wäßrigen Lösungsmittel in mehreren Stufen durchfahrt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Lösungsmittel aus Wasser und/oder einer verdünnten alkalischen Losung besteht
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung des Extrakts durch Ultrafiltration und/oder Umkehr-Osmose bewirkt.
DE2731570A 1976-07-22 1977-07-13 Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharide mit therapeutischer Wirkung Expired DE2731570C3 (de)

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