Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia wielocukru, znajdujacego zastosowanie do pro¬ dukcji leków, zwlaszcza leku przeciw rakowi, z brzeczki hodowlanej, otrzymanej po hodowaniu w zanurzeniu grzyba z klasy Basidiomycetes.Wiadomo, ze z brzeczki* otrzymanej po hodo¬ waniu grzyba z klasy Basidiomycetes w cieklej po¬ zywce wodnej, mozna otrzymac wielocukier, posia¬ dajacy aktywnosc przeciiwnowotworowa. Ustalono równiez, ze jezeli grzyb z klasy Basidiomycetes hoduje sie w zanurzeniu w cieklym srodowisku, to wielocukier tworzy sie nie tylko w grzybni, ale równiez w pozywce. Dlatego tez w celu otrzymania wielocukru z takiej hodowli w zanurzeniu grzyba z klasy Basidiomycetes stosuje sie zwykle metoda, polegajaca na rozgniataniu grzybni, utrzymujac pozywke, czyli brzeczke hodowlana w takiej pos¬ taci, w jakiej ona jest, albo po dodaniu do niej wody, a nastepnie saczeniu lub oddzielaniu z po¬ zywki przez odwirowanie pozostalej grzybni i wy¬ dzieleniu wielocukru z otrzymanego w ten sposób roztworu.Chociaz metode te uwaza sie za racjonalna i pra¬ ktyczna, to posiada ona pewne istotne wady. Na przyklad, w przypadku hodowli, prowadzonej w zanurzeniu, produkt ulega naty dzialowi miedzy grzybnie i' brzeczke, przy czym podzial ten nie moze byc efektywnie dokonany nie tylko ze wzgledu na podwyzszona lepkosc ukladu, ale równiez z powodu wysokiej zawartosci wody 16 00 125 w grzybnli. Dodanie wody moze obnizyc lepkosc brzeczki hodowlanej i poprawic szybkosc ekstrak¬ cji produktu woda, ale uzycie nadmiernej ilosci wody powoduje przedluzenie czasu potrzebnego na rozdzielenie i nie przyczynia sie do obnizenia za¬ wartosci wody w grzybni. Z tych wzgledów po¬ trzebny jest ulepszony sposób otrzymywania wielo¬ cukru z hodowli, prowadzonej w zanurzeniu, poz¬ walajacy na wytworzenie wielocukru w skali prze¬ myslowej z wyzsza wydajnoscia.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wy¬ twarzania wielocukru, posiadajacego dzialanie przeciiwnowotworowe i inna korzystna aktywnosc farmakodynamiczna z prowadzonej w zanurzeniu hodowli grzyba z klasy Basidiomycetes, nadajace¬ go sie do stosowania w skali przemyslowej i za¬ pewniajacego wysoka wydajnosc. Inne aspekty sposobu wedlug wynalazku beda oczywiste po za¬ poznaniu sie z dalszym opisem.Sposób wytwarzania wielocukru wedlug wyna¬ lazku polega na hodowaniu w cieklej pozywce wodnej, w zanurzeniu grzyba, który nalezy do ro¬ dzaju CorLolus z klasy Basidiomycetes i suszeniu otrzymanej brzeczki hodowlanej w temperaturze 60—150°C, a nastepnie poddaniu jej ekstrakcji wo¬ dnym rozpuszczalnikiem i rafinowaniu otrzymane¬ go w ten sposób wyciagu przez usuniecie z niego substancji o ciezarze czasteczkowym mniejszym niz 5000. Najbardziej Charakterystyczna cecha sposobu* wedlug wynalazku polega na tym, ze wytwairza-, 103 04C103 045 i i nej substancji nie usuwa sie bezposrednio z brze¬ czki hodowlanej, ale otrzymuje sie ja po uprzed¬ nim wysuszeniu brzeczki, a nastepnie przez wyek¬ strahowanie jej wodnym rozpuszczalnikiem.Grzyby z klasy Basiddomycetes, stosowane w sposobie wedlug wynalazku, sa organizmami nale¬ zacymi do rodzaju Coriolus, takimi na przyklad jak Coriolus verLsieolor (Fr.) Quel, Coriolus con- sors (Berk.) Imaz., Coriolus hiirsutus (Fr.) Qucl, Coriolus pargamenus (Fr.) Pat., Coriolus pubescens (Fr.) Quel i Coriolus conchifer morfologiczne i wlasciwosci mykologiczne tych or¬ ganizmów typu Basidiomycetes sa wyjasnione w „Coloured illustration oi fungi of Japan" Rokuya Imazeki i Tsuguo Hongo, Tomy I, 1974 i II, 1975.Sposród organizmów typu Basidiomycetes te, któ¬ re zestawiono ponizej, sa zdeponowane w The Fer- mentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, który jest in¬ stytucja wyznaczona przez dyrektora naczelnego Japonskiego Urzedu Patentowego do deponowania szczepów.Nr depozytu Data depozytu Coriolus versicolor (Fr.) Qusl: FERM-P-2414 .12.1973 Coriolus consors (Berk.) Imaz.: FERM-P-988 24.06.1971 Coriolus hirsutus (Fr.) Qucl: FERM-P-2711 6.08.1974 Coriolus pargamenus (Fr.) Pat.: FERM-P-2712 6.08.1974 Zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku wymie¬ nione powyzej grzyby hoduje sie w zanurzeniu.Okreslenie „hodowla w zanurzeniu" oznacza spo¬ sób prowadzenia hodowli W cieklej pozywce z na¬ powietrzaniem i mieszaniem, przy czym wzrost grzybni przebiega nie na powierzchni plynnej po¬ zywki, ale glównie w glebszej czesci cieklej war¬ stwy. Taka hodowle prowadzi sie przy szybkosci napowietrzania 0,1—2,0 litra na litr pozywki na minute i przy szybkosci mieszania 30—800 obrotów n* minute.Jako pozywke, uzywana do hodowli podpowierz- chniowej mozna stosowac dowolne znane pozywki naturalne lub syntetyczne, stosowane zwykle do ho¬ dowli drobnoustrojów lub odpowiednie modyfikacje takich znanych pozywek. Okolo 3—tlO^dniowa ho¬ dowla, prowadzona na takiej pozywce, jest odpo¬ wiednia do wytwarzania wielocukru z zadowala¬ jaco wysoka wydajnoscia.W przypadku prowadzenia hodowli w wodnej pozywce w zanurzeniu, grzybnia nie rozprzestrze¬ nia sie na powierzchni cieczy-i nie tworzy duzych skupisk, jak w przypadku hodowli nieruchomej, ale tworzy stosunkowo niewielkie skupiska podob¬ ne z wygladu do pastylek lub wlókien, co jest wynikiem dzialania sil scinajacych, powstajacych podczas mieszania. Podczas tego procesu wielocu¬ kier jest produkowany nie tylko wewnatrz grzyb¬ ni, ale równiez poza nia, czyli w pozywce.W procesie, prowadzonym sposobem wedlug wy¬ nalazku, brzeczke hodowlana, otrzymana podana wyzej metoda, czyli przez hodowanie w zanurzeniu griyba Basidiomycetes, suszy sie, zwykle w tem¬ peraturze zawartej w zakresie 60—150oC Suszenie przeprowadza sie w róznego typu urzadzeniach, taikach jak suszarka bebnowa^ suszarka pneumatycz¬ na lujb odparowywaiciz cienkowarstwowy^ przy czym suszenie mozna przeprowadzac równiez w innych, dowolnych urzadzeniach nadajacych sie do tego celu.Suszenie brzeczki hodowlanej znakomicie ulat¬ wia ekstrakcje wodnym rozpuszczalnikiem, jak ró¬ wniez zbieranie wielocukru podczas rafinacji wy¬ ciagu, otrzymanego w wyniku ekstrakcji. Nalezy podkreslic, ze jezeli temperatura suszenia jest niz¬ sza niz 60°C, to powoduje ona nie tylko zmniej¬ szenie szybkosci suszenia, ale równiez komplikuje przeprowadzenie samej operacji. Trzeba pamietac, ze wytworzony wielocukier wykazuje narastajaca sklonnosc do rozkladania sie podczas wzrostu tem¬ peratury suszenia, a zatem zaleca sie przeprowa¬ dzac suszenie w temperaturze, nie przekraczajacej 150°C.Brzeczke fermentacyjna po przejsciu opisanej wyzej operacji suszenia poddaje sie nastepnie ek¬ strakcji wodnym rozpuszczalnikiem. Ekstrakcje pro¬ wadzi sie metoda stosowana zwykle do ekstraho¬ wania substancji roslinnych i grzybowych.Okreslenie „wodny rozpuszczalnik" stosowane w opisie oznacza wode lub roztwór wodny, zawie¬ rajacy sól metalu alkalicznego, taka jak na przyk¬ lad chlorek sodu, octan sodu, polarny rozpuszczal¬ nik organiczny, na przyklad metanol, etanol itp., przy czym w procesie, prowadzonym sposobem wedlug wynalazku, najbardziej wydajna jest eks¬ trakcja, prowadzona przez ogrzewanie z woda lub rozcienczonym roztworem alkalicznym, a w pro¬ cesach przemyslowych najbardziej korzystne jest zastosowanie wieloetapowej techniki ekstrakcji, przy uzyciu wymienionych powyzej roztworów do ekstrakcji. Otrzymany w ten sposób wyciag poddaje sie nastepnie rafinacji, która polega na usunieciu z niego substancji o ciezarze czasteczkowym mniejszym niz 5000. Operacje te przeprowadza sie stosujac dowolna, znana i nadajaca sie do zasto¬ sowania metode, toaka jajk odsalanie, dializa, ultra- filtracja, odwrotna osmoza, wymiana jonowa, sa¬ czenie zelu lub wytracanie rozpuszczalnikiem or¬ ganicznym. Wymienione metody mozna stosowac pojedynczo lub w polaczeniu.Z wymienionych metod rafinacji najkorzystniej* sza z punktu widzenia sposobu wedlug wynalazku jest utltraJBiltracja i odwrotna osmoza* Po usunieciu z roztworu po ekstrakcji skladnika o niskim ciezarze czasteczkowym, nizszym od 5000 na drodze opisanego powyzej procesu rafinacji roz-; twór suszy sie, stosujac metode suszenia rozpry- skowegp lub liofilizacje czyli suszenie sublimacyj* ne, a nastepnie produktowi nadaje sie forme pre¬ paratów handlowych.Wielocukier, otrzymany opasanym powyzej spo¬ sobem wedlug wynalazku, który w dalszej czesci opisu bedzie nazywany obecna substancja, jest wa- trobowobrazowy, ma zawartosc azotu 2—#/•, a w wiekszosci przypadków 3—6°/t. Temperatury top-r nienia otrzymanej substancji nie moze okreslic,: poniewaz w temperaturze wyzszj niz okolo 120°C stopniowo czernieje i ulega rozkladowi. Obecna, substancja jest rozpuszczalna w wodzie, a prawie nierozpuszczalna w alkoholu, pirydynie, chloroform 49 50 55 60tnie, benzenie i heksanie. Ponadto jest to substan¬ cja prawie bez smaku i zapachu.Zamieszczona ponizej tablica 1 jest zestawieniem róznych badan reakcji barwnych, którym poddano obecna substancje.Tablica 1 Reakcja barwna reakcja a-naftol — kwas si&rkowy (reak¬ cja MoJMia) reakcja indol — kwas siarkowy (reak¬ cja Disoha) reakcja antranon — kwas siarkowy reakcja fenol — kwas siarkowy reakcja tryptofan — kwas siarkowy proces^ Lowry —Folin reakcja ninhydrynowa po hydrolizie kwasem solnym Barwa purpuro¬ wa brazowa z&elonka- woniebie- ska brazowa slnawo- brazowa niebieska sinawo- niebieska Mfyntiki wielocukry potwier- - dzone wielocukry potwier¬ dzone wielocukry potwier- : dzone wielocukry potwier¬ dzone wielocukry potwier¬ dzone wiazania peptydowe ¦potwier¬ dzone a-amino¬ kwasy po¬ twierdzone Podane w tablicy 1 wyniki badan wskazuja, ze obecna substancja jest wdalocukrem zawieraja¬ cym azot. Ciezar czasteczkowy obecnej substancji oznaczony metoda ulitrawirowania, zawiera sie w zakresie 5000—300000, a sredni wagowy ciezar cza¬ steczkowy wynosi 10000—100000. Wartosci otrzy¬ mane przy uzyciu innych metod pomiarowych, ta¬ kich jak frakcjonowanie z zastosowaniem mebra- ny ultrafiltracyjnej, zawieraja sie .zawsze w zakre¬ sie 10000—100000. Dlatego jest calkowicie pewne, ze sredni ciezar czasteczkowy obecnej substancji zawiera sie w zakresie 10000—'100000.Wielocukier, zawierajacy azot, otrzymany sposo¬ bem wedlug wynalazku wykazuje bardzo wybitna aktywnosc przeoiwnowotworowa u myszy nie tyl¬ ko przy podawaniu dootrzewnowym, ale równiez przy podaniu doustnym. Ozfriacza to, ze obecna substancja jest doskonalym, dostepnym lekiem przeciwrakowym, który mozna stosowac doustnie.Rzeczywiscie, obecna substancja poza dzialaniem przeciwnowotworowym przy podawaniu doustnym wykazuje takze znaczna aktywnosc przywracania zniesionej odpornosci organizmu. Tak wiec, obec¬ na substancja jest przydatna nie tylko do zapobie¬ gania niepozadanym dzialaniom ubocznym, wy¬ stepujacym przy chemotenaplii raka i zwiekszaniu wrazliwosci na radioterapie, ale równiez do zapo¬ biegania spadku odpornosci lub sil fizycznych pac¬ jenta, które sa nastepstwem zabiegu chirurgiczne¬ go lub przetoczenia krwi_ oraz do opanowywania lub zapobiegania zakazeniom wirusowym lub bak¬ teryjnym, na które narazony jest chory w tym wiekszym stopniu, im bardziej spada jego odpor¬ nosc i sily fizyczne. Podawanie doustne obecnej substancji daje równiez doskonaly wynik w u- sprawnianiu czynnosci watroby, poprawie apetytu, leczeniu zaburzen jelitowych i pobudzaniu odda¬ wania moczu. Substancja jest równiez uzyteczna przy leczeniu tradu. io Sposób wedlug wynalazku zostanie bardziej szczególowo zilustrowany w nastepujacym przy¬ kladzie, w którym wszystkie procenty, jezeli nie zaznaczono, ze jest inaczej, sa procentami wago¬ wymi.Przyklad. 1600 litrów pozywki, zawierajacej % glukozy, l,5*/o wyciagu drozdzowego, 0,lf/o KH2P04 i 0,l°/o MgS04 • 7H20 wprowadza sie do pionowego fermentora o pojemnosci 2 m* i poz^fc- ke te iinokuluje sie 20 litrami zawiesiny grzyba Co- D riolus versicolor (Fr.) Quel FERM-P-2414, otrzy¬ manej podczas hodowli na trzesawkach, a nastep¬ nie w ciagu 7 dni prowadzi sie hodowle w tem¬ peraturze 26°C przy szybkosci napowietrzania 0,5 l/min na litr pozywki i szybkosci obrotów miesza- dla 150 obrotów na minute.Otrzymana w ten sposób brzeczke (zawiesine) hodowlana dzieli slie na czesci po okolo 500 litrów i kazda z tydh czesci suszy sie w suszarni typu dwubebnowego. Temperature powierzchni bebna - suszarni reguluje sie w ten sposób, aby tempera¬ tura powierzchni brzeczki hodowlanej, która przy¬ lega cienka warstwa do powierzchni bebna, wzra¬ stala odpowiednio do 65°C, 80°C, &0°C, 110°C i 140°C, a zawartosc wody w kazdym suszonym produkcie byla mniejsza niz 20g/§ wagowych (da¬ ne w tablicy 2).Wtedy kazdy z suszonych produktów zadaje sie 250 litrami goracej wody i poddaje sie ekstrakcji ^ w temperaturze 95±1°C, w ciagu 3 godzin, a po ochlodzeniu wyciag rozdziela sie na pozostala grzybnie i roztwór, przy uzyciu, odstojnika typu srubowego i rozdzielczej pólki typu separatora wi¬ rówkowego. Lepkosc pozorna mieszaniny i czas, 45 potrzebny do rozdzialu wirówkowego w tym pro¬ cesie ekstrakcji, podane sa w tablicy 2.Wyciag, otrzymany w tym procesie, przepuszcza sie przez membrane PM-5 ultrafiltru typu HF, produkcji firmy Aimieon Co., w celu uwolnienia 50 roztworu od skladnika o ciezarach czasteczkowych mniejszych niz 5000, przy czym otrzymuje sie oko¬ lo 100 litrów rafinowanego roztworu. Poniewaz stezenie rafinowanego roztworu wynosi okolo l0/t, zateza sie go w odparowywaczu do poziomu steze- 55 nia potrzebnego dla dalszego suszenia metoda roz- pylowa. Poniewaz rafinowany roztwór ulega zelo¬ waniu, prowadzanie obróbki jest utrudnione, jeze¬ li stezenie roztworu przekroczy pewien dopuszczal¬ ny poziom. Graniczna wartosc stezenia, przy któ- 40 rym nie nastepuje zelowanie, podana jest w tabli- jcy 2 jako stezenie krytyczne.. Czas, potrzebny, do suszenia rozpryskowego ste¬ zonego, roztworu i wydajnosc otrzymanego wie- iocukru sa podane równiez w tablicy 2. w W celu porównania, jako przyklad porównawr103 045 czy, brzeczke hodowlana, otrzymana w tein sam sposób, jaki podano powyzej obrabiano podobnie, po wysuszeniu w temperaturze 45°C i 160°C, albo * bez suszenia. Odpowiednie produkty poddano po¬ dobnym pomiarom, których wyniki zestawione sa w tablicy 2.Tablica 2 Numer próby T Temperatura suszenia (°C) Zawartosc wody po suszeniu (°/o wagowy) Ilosc suszonej hodowli (kg) Ilosc goracej wody uzytej do ekstrakcji (1) Lepkosc pozorna mieszaniny uzytej do ekstrak¬ cji (cP) Czas potrzebny na rozdzielenie (min.) Czas potrzebny na ultrafiltracje (godz.) Stezenie krytyczne rafinowanego roztworu (% wa¬ gowy) Czas potrzebny na suszenie rozpylowe (godz.) Wydajnosc (g) Aktywnosc przeciwnowotworowa (hamowanie no¬ wotworu °/o): podawanie dootrzewnowe podawanie doustne Uwagd Przyklady t 1 ~fr~ 65 31 250 150 ,5 900 96 65 2 3~~ 80 31 2150 150 &5 ,5 900 97/ 67, 3 *~ 90 17 260 100 ,5 900 95 70 4 IljO 12 28' 250 100 900 98 60 !* S~~ 145 6 27 250 100 900 97 62 Przyklady porównawcze 1 • • 7 45 50 50 050 200 60 8 24 950 93 1 65 Za- wie- ra- jacy za¬ rze¬ czysz- cze- inlia 2 8 160 2 26 2^0 100 #0 ' 5 16 600 610 , 10 3 9~~ bez su¬ sze¬ nia ¦—i ¦—- , 0 250 90 4 - 37 B50 95 71 Zpr wze¬ ra¬ jacy zp- nie- czysz- cze- nia _ I Z wielu wartosci, podanych w tablicy 2, wyni¬ ka w sposób oczywisty, ze jezeli hodowle, otrzy¬ mana w procesie, prowadzonym sposobem wedlug wynalazku, suszy sie w okreslonych warunkach temperaturowych, zwlaszcza w temperaturze za¬ wartej w zakresie 60—150°C, to ekstrakcje, rafino¬ wanie wyciagu, zatezenia rafinowanego wyciagu oraz suszenie rozpryskowe mozna przeprowadzic korzystnie i racjonalnie.Kazdy z otrzymanych w ten sposób produktów wielocukrowych byl brazowym proszkiem, latwo rozpuszczalnym w wodzie. Produkt, otrzymany w porównawczym przykladzie oznaczonym nr 3, za¬ wieral sladowa ilosc substancji nierozpuszczalnej.Wyniki analizy elementarnej produktów wykaza¬ ly, ze kazdy prodaikt sklada sie z C, H, N i O, przy czym azot wyliczony wynosil 3—35°/o. Rów¬ niez wyniki róznych badan reakcji barwnej, zesta¬ wione w tablicy 1, wykazuja dodatni charakter 50 55 60 06 produktów. Wyniki te potwierdzily poglad, ze pro¬ dukty te sa wielocukrami, zawierajacymi azot.Zdolnosc hamowania stalego nowotworu Sarco- ma-180, czyli miesaka u myszy, która wykazuje substancja, otrzymana sposobem wedlug wynalaz-" ku, podawana dootrzewnowo i doustnie, podana w tablicy 2, wykazuje doskonaly poziom we wszyst¬ kich przypadkach z wyjatkiem tego, kiedy pro¬ dukt suszono w temperaturze przewyzszajacej 150°C.Efekt hamowania nowotworu mierzono zwykle stosowana metoda, która opisana jest ponizej w skrócie.Komórki nowotworu Sarcoma-180, czyli miesa¬ ka, wszczepiano dootrzewnowo myszom i po 7 dniach zadowalajacego wzrostu 106 kawalków tych komórek wszczepiono pod skóre pach innym my¬ szom, tworzac staly nowotwór. Podawanie próbek rozpoczeto 24 godziny po wszczepieniu. W przy-d mi*4$ ló padku podawanda dootrzewnowego substancje po¬ dawano w dawce 10 mg/kg jeden raz dziennie, przy czym kazdego innego dnia w oiagu 20 dni uzyto calkowita dawke, wynoszaca 0,2 ml/20 g wa¬ gi ciala myszy.W przypadku podawania doustnego substancje podawano w dawce 1000 mg/kg raz dziennie, kon¬ tynuujac podawanie przez okres 20 dmi, przy czym calkowita dawka wynosila 0,2 ml/20 g wagi ciala myszy. Kazdy nowotwór wyluszczano 25 dni po wszczepieniu i stopien hamowania rozwoju nowo¬ tworu wyliczano ze sredniego ciezaru nowotworów w grupie myszy, którym podawano substancje i sredniego ciezaru nowotworów w grupie kontrol¬ nej. PL PL PL PL