PL103468B1 - Sposob wytwarzania polisacharydow zawierajacych azot - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polisacharydów, zawierajacych azot i majacych wlasci¬ wosci przeciwnowotworowe.Wiadomo, ze polisacharydy o wlasciwosciach przeciwnowotworowych mozna otrzymywac, oczyszczajac wyciag, otrzymany przez ekstrahowanie grzybów z gromady podstawczaków (Basidiomycetes) wodnym rozpusz¬ czalnikiem. Sposób ten nie nadaje sie jednak do stosowania w praktyce na skale techniczna, gdyz wydajnosc procesu ekstrakcji jest mala i straty czynnej substancji przeciwnowotworowej znaczne.Wad tych nie ma sposób wedlug wynalazku, umozliwiajacy otrzymywanie z wysoka wydajnoscia polisacha¬ rydów, zawierajacych azot, wykazujacych dzialanie przeciwnowotworowe i majacych inne cenne wlasciwosci farmakodynamiczne. Cecha sposobu wedlug wynalazku jest to, ze grzyb z rodzaju Coriolus, rzedu Polyporaceae, gromady Basidiomycetes ekstrahuje sie najpierw woda lub rozcienczonym, alkalicznym roztworem wodnym, a nastepnie kolejno alkalicznymi roztworami wodnymi o stopniowo wzrastajacych stezeniach.Okreslenie „grzyby z rodzaju Coriolus" oznacza znane gatunki grzybów z rzedu Polyporaceae, gromady Basidiomycetes, takie jak np. Coriolus versicolor (Fr.) Quel., Coriolus hirsutus (Fr.) Quel., Coriolus consors (Berk.) Imaz., Coriolus conchifer (Schw.) Pat., Coriolus pubescens (Fr.) Quel., Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. i Coriolus biformis (Klotz.) Pat. (patrz Colored lllustrations of Fungi of Japan, Rokuya Imazeki i Tsuguo Hongo, tom I, 1974 i tom II, 1975). Numery, pod którymi grzyby te zdeponowano w Fermentation Research Institute, Agency of Industral Science and Technology (Chiba-shi, Japonia) sa nastepujace: Coriolus versicolor FERM—P No. 2414, Coriolus consors FERM-P No. 988, Coriolus hirsutus FERM-P No. 2711 i Coriolus pargamenus FERM—P No. 2712. Okreslenie „grzyb z rodzaju Coriolus" oznacza owocnie i/albo grzybnie wymienionych wyzej gatunków grzybów. Zgodnie z wynalazkiem ekstrakcji poddaje sie naturalnie lub sztucznie hodowane owocnie i/albo grzybnie grzybów, najkorzystniej grzybnie sztucznie hodowanego Coriolus versicolor (Fr.) Quel.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze produkt wyjsciowy poddaje sie wielokrotnie ekstrakcji (ekstrakcja wielostopniowa), przy czym ekstrakcje prowadzi sie najpierw woda lub 0,01—0,05 n alkalicznym2 103 468 roztworem wodnym, a nastepnie kolejno alkalicznymi roztworami wodnymi o stezeniu, rosnacym stopniowo od powyzej 0,05 n do ponizej 2 n. W rezultacie ekstracji woda lub 0,01—0,05 n alkalicznym roztworem wodnym odczyn fazy wodnej, otrzymanej po mieszaniu z grzybem, odpowiada wartosci pH = 7 lub mniejszej.Stwierdzenie to oparte jest na fakcie, ze gdy czysta wode lub w przyblizeniu 0,01 n roztwór wodny wodorotlenku sodowego zmiesza sie z grzybem, wówczas na skutek buforowego dzialania wlasciwego dla grzyba wartosc pH roztworu wynosi okolo 4—7.Jako wodne roztwory alkaliczne o stopniowo wzrastajacych stezeniach korzystnie jest stosowac roztwory o stezeniu okolo 2 n lub mniejszym, poniewaz przy wyzszym stezeniu moze zachodzic rozklad czynnej substancji.Wodny rozpuszczalnik stosuje sie w kazdym zabiegu ekstrakcji w ilosci 5—200 razy wiekszej w stosunku wagowym od ilosci wyjsciowego produktu w jego suchym stanie. Zazwyczaj ekstrakcje prowadzi sie w tempera¬ turze 50—100°C wciagu 20 minut do 5 godzin. W temperaturze nizszej niz 50°C wydajnosc procesu ekstrakcji jest mala, zas w temperaturze powyzej 100°C moze zachodzic rozklad ostatecznego produktu. Zwykle stosuje sie 2—10 procesów ekstrahowania, korzystnie 3—8. Korzystnie laczny czas utrzymywania ekstrahowanego materialu w podanej wyzej temperaturze powinien byc krótszy niz 20 godzin, buz wzgledu na liczbe procesów ekstrakcji. Czas ten jednak nie powinen byc krótszy niz 1 godzina, gdyz w przeciwnym razie wydajnosc moze nie byc dostateczna. Jako alkalia zgodnie z wynalazkiem stosuje sie wodorotlenek sodowy, potasowy, wapniowy lub amonowy, korzystnie wodorotlenek sodowy.Stosujac wielostopniowa ekstrakcje przy uzyciu wodnych roztworów alkalicznych o rosnacych stezeniach, uzyskuje sie zgodnie z wynalazkiem wydajnosc koncowego produktu wyzsza od tej, jaka mozna osiagac znanymi sposobami, co ma duze znaczenie w technice. Wydajnosc, uzyskiwana sposobem wedlug wynalazku, jest nieoczekiwanie znacznie wyzsza od tej, jaka mozna uzyskac, stosujac wielokrotna ekstrakcje sama woda lub alkalicznym roztworem wodnym o jednakowym stezeniu.Mechanizm procesu, który zgodnie z wynalazkiem umozliwia uzyskiwanie tak wysokiej wydajnosci, nie zostal dokladnie poznany, ale przypuszcza sie, ze zachodzi tu nie tylko zwykle el jowanie rozpuszczalnych skladników grzybów Basidiomycetes, ale równiez lagodne rozkladanie ty^h grzybów, polaczone z wytwarza¬ niem rozpuszczalnego skladnika czynnego. Oznaczaloby to, ze przy kazdym zwiekszeniu stezenia alkalicznego roztworu wodnego, stosowanego do ekstrakcji, material wyjsciowy ulega rozkladowi, co umozliwia skuteczne wytwarzanie czynnej substancji.Z drugiej zas strony, jezeli proces ekstrakcji prowadzi sie, stosujac od poczatku wysoce stezony alkaliczny roztwór wodny, bez wstepnej ekstrakcji woda, wówczas w pierwszym stopniu procesu ekstakcji uzyskuje sie wprawdzie wysoka wydajnosc, ale w drugim i dalszych stopniach ekstrakcji wydajnosc malejo gwaltownie.Przyczyna tego jest prawdopodobnie fakt, ze produkt, który pwinien byc normalnie wyekstrahowany goraca woda lub rozcienczonym alkalicznym roztworem wodnyme ulega w nadmiernym stopniu rozkladowi przy prowadzeniu ekstrakcji w ostrzejszych warunkach, mianowicie, wieloczasteczkowy polisacharyd rozklada sie, dajac substancje o ciezarze czasteczkowym mniejszym niz 5000.Ekstrakt, otrzymany sposobem wedlug wynalazku, zobojetnia sie jak w znanych procesach mineralnym kwasem, takim jak rozcienczony kwas solny i nastepnie oczyszcza. Oczyszczaniu mozna poddawac oddzielnie roztwory, otrzymane w poszczególnych stopniach ekstrakcji, albo tez mozna je laczyc i nastepnie oczyszczac.Mozna stosowac rózne sposoby oczyszczania, takie jak ultrafiltracja, odwrócona osmoza, filtrowanie przez zel, wysalanie i wytracanie przy uzyciu organicznego rozpuszczalnika. Na drodze takiego oczyszczania otrzymje sie polisacharyd o korzystnych wlasciwosciach przeciwnowotworowych.Elementarna analiza otrzymanego polisacharydu zawierajacego azot wykazala, ze sklada sie on glównie zwegla, wodoru, azotu i tlenu. Zawartosc azotu zalezy od zawartosci azotu w produkcie wyjsciowym, ale stwierdzono, ze otrzymany produkt zawiera zwykle wiecej niz 2% a przewaznie 3—5% wagowych azotu.Wyniki róznych testowych reakcji barwnych z otrzymanym produktem podano w tablicy I.Tablica I Rodzaj reakcji Barwa Wynik Reakcja Molish'a (a-naftol i kwas siarkowy) Reakcja Disch'a/indol i kwas siarkowy Reakcja z antronem i kwasem siarkowym Reakcja z fenolem i kwasem siarkowym Purpurowa Potwierdzone sacharydy Brazowa Potwierdzone sacharydy Zielonawoniebieska Potwierdzone sacharydy Brazowa Potwierdzone sacharydy103 468 3 1 2 3 Reakcja z tryptofanem i kwasem siarkowym Purpurowobrazowa Potwierdzonesacharydy Reakcja Lowry-Folin Niebieska Potwierdzonewiazanie peptydowe Reakcja ninhydrynowa po Purpurowo- Potwierdzone hydrolizie kwasem solnym niebieska a-aminokwasy Wyniki podane w tablicy I swiadcza o tym, ze produkt, otrzymywany sposobem wedlug wynalazku, jest polisacharydem zawierajacym azot (zawiera pierwszorzedowy atom azotu zwiazany peptydowo).Badania metoda chromatografii kolumnowej wykazaly, ze produkt ma ciezar czasteczkowy okolo 5000—300000, a przecietny jego ciezar czasteczkowy, mierzony metoda ultrawirówki, wynosi 10000—100000.Frakcje o nizszym ciezarze czasteczkowym (mniej niz 5000), otrzymywane przy oczyszczaniu produktu, nio wykazuja prawie wcale inhibitujacego dzialania przeciwko stalym nowotworom Sarcoma-180 u myszy, przy dootrzewnowym podawaniu, a przy tym wykazuja gorycz, maja nieprzyjemny zapach i powoduja uboczne reakcje. Z tych tez wzgledów uwaza sie, ze te substancje o malym ciezarze czasteczkowym nie maja cennych wlasciwosci farmakodynamicznych i ich wplyw na wytwarzane sposobem wedlug wynalazku polisacharydy zawierajace azot jest raczej ujemny.Wytwarzane sposobem wedlug wynalazku polisacharydy zawierajace azot przejawiaja silne dzialanie przeciwnowotworowe u myszy nie tylko przy podawaniu sródot zewnowym ale i przy podawaniu doustnym.Badania wykazaly, ze stanowia one bardzo skuteczny lek przeciwnowotworowy do podawania doustnego, a poza tym przywracaja organizmowi gospodarza odpornosc. W szczególnosci, substancje te sa skuteczne nie tylko przez zapobieganie ubocznym reakcjom, które wystepuja w chemoterapii raka i przez zwiekszanie wrazliwosci na leczenie promieniami, ale równiez zapobiegaja obnizaniu sie odpornosci organizmu i spadkowi sil pacjenta po operacji lub transfuzji krwi. Poza tym, zapobiegaja one zarazliwym chorobom, powodowanym przez wirusy lub bakterie przy zmniejszeniu sie odpornosci organizmu. Polisacharydy, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, podawane doustnie, wplywaja korzystnie na prace watroby, zwiekszaja apetyt, lagodza zaklócenia w przewodzie pokarmowym i nasilaja wydalanie moczu. Sa one tez skuteczne przy leczeniu tradu.Przyklad I. 200 g suchej grzybni (zawartosc wilgoci 9,9% wagowych) Coriolus Versicolor (Fr.) Quel.(FERM—P No. 2414), otrzymanej z sztucznej hodowli i 3 litry wody umieszcza sie w wyposazonej w mieszadlo kolbie o pojemnosci 5 litrów i miesza wciagu 3 godzin, utrzymujac kolbe we wrzacej kapieli wodnej tak, aby temperatura wewnatrz kolby wynosila 95°C±2°C. Nastepnie mieszanine chlodzi sie, odsacza grzybnie na saczku Buchnera, przemywa osad okolo 1 litrem wody i poluczyny miesza z przesaczem, otrzymujac okolo 3,5 litra roztworu o wartosci pH = 5,8. Pozostala grzybnie miesza sie z 2 litrami wody i ekstrahuje w wyzej opisany sposób w ciagu 2 godzin, odsacza i przemywa osad 1 litrem wody, otrzymujac okolo 3 litry przesaczu z popluczynami. Osad z saczka miesza sie z 2 litrami 0,1 n roztworu wodorotlenku sodowego, ekstrahuje jak wyzej opisano wciagu 2 godzin w temperaturze 95°C±2°C, po czym chlodzi, zobojetnia 2 n kwasem solnym i odsacza. Osad przemywa sie okolo 500 ml wody i miesza popluczyny z przesaczem, otrzymujac 2,5 litra roztworu. Operacje te powtarza sie, stosujac po 2 litry 0,2 n, 0,3 n i 0,4 n roztworów wodorotlneku sodowego i polukujac 0,5 litra wody. Z kazdego zabiegu ekstrakcji otrzymuje sie po okolo 2,5 litra roztworu.Otrzymane 6 wyciagów o lacznej objetosci 16,5 litra miesza sie i w prózniowej wyparce obrotowej odparowuje w temperaturze 60°C do objetosci 700 ml, po czym umieszcza w celulozowej rurze do dializy (Visking Tube firmy Union Carbid Corp.) i dializuje w temperaturze 5°C w ciagu 72 godzin. Produkt dializy steza sie i suszy przez wymrazanie, otrzymujac 60 g produktu w postaci proszku o barwie watroby, zawierajacego 7% wagowych wilgoci. Wydajnosc wynosi 31,3%. Analiza elementarna wykazuje, ze produkt zawiera 40,3% C, 6,2% H, 2,9% N i 50,6% O. Ciezar czasteczkowy, mierzony metoda chromatografii kolumnowej wynosi okolo 10000-250000, a przecietny ciezar czasteczkowy, mierzony metoda ultrawirówki w wodzie jako rozpuszczalni¬ ku wynosi 94000. Podana wyzej zawartosc tlenu stanowi róznice, otrzymana po odjeciu sumy 3 pozostalych skladników od 100%.Produkt po rozpuszczeniu w wodzie daje barwne reakcje takie same, jak podane w tablicy I, co potwierdza, ze jest to polisacharyd zawierajacy azot. Wskaznik zahamowania twardych nowotworów Sarcoma-180 u myszy wynosi 95% przy podawaniu sródotrzewnowym i 70% przy podawaniu doustnym. Wskaznik ten ustalono znana4 103 468 metoda, która polega na tym, ze komórki nowotworu Sarcoma—180 przeszczepia sie do jamy brzusznej myszy i pozwala im wzrastac wciagu 7 dni. 106 tych komórek przeszczepia sie pod skóre w pachwinie innej myszy, wytwarzajac stale nowotwory. Po uplywie 24 godzin, myszy podaje sie badana substancje, przy czym sródotrzewnowo stosuje sie co drugi dzien wciagu 20 dni dawke 10 mg/kg, to jest lacznie 0,2 ml dla myszy o masie ciala 20 g, zas doustnie podaje sie raz dziennie 1000 mg/kg w ciagu 20 dni, to jest lacznie równiez 0,2 ml dla myszy o masie ciala 20 g. Po uplywie 25 dni od przeszczepienia wyluskuje sie nowotwory i okresla stopien zahamowania ich wzrostu w procentach, jako stosunek przecietnej wagi nowotworu u myszy, którym podawano badany srodek, do przecietnej wagi nowotworu u myszy z próby kontrolnej.W sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I, stosujac 200 g grzybni, prowadzi sie ekstrakcje sama woda w temperaturze 95°C±2°C. Wyniki podano w tablicy 2. W próbach tych wszystkie procesy ekstrakcji i przemywania prowadzi sie, stosujac wode w takich ilosciach, w jakich w przykladzie I stosowano rozpuszczal¬ nik. Wyciag wraz z popluczynami steza sie pod zmniejszonym cisnieniem, dializuje, chlodzi i suszy produkt.Wyniki podano w tablicy 2. Wyniki te swiadcza o tym, ze wydajnosc ekstrakcji maleje gwaltownie od drugiego procesu ekstrakcji i wydajnosc w dalszych procesach jest mniejsza niz w poprzedzajacych.Tablica II Numer procesu Objetosc wyciagu Objetosc popluczyn Wydajnosc suchego ekstrakcji w litrach w litrach produktu w % wagów/eh 1 2 3 4 6 Razem 3 2 2 2 2 2 13 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 3,5 7 2,1 0,8 0,3 0,1 0,1 ,4 Przyklad II. W sposób analogiczny do opisanego w przyklrdzie I, 200 g suchej grzybni (zawartosc wilgoci 8,8% wagowych) grzyba Voriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM—P No 2414) ekstrahuje sie, stosujac kolejno po 2 litry 0,05 n, 0,1 n, 0,2 n i 0,4 n roztworów wodorotlenku sodowego. Kazdy zabieg ekstrakcji prowadzi sie w ciagu 2 godzin w temperaturze 90—95°C, po czym chlodzi, zobojetnia mieszanine 2 n kwasem solnym, odsacza grzybnie, przemywa w kazdym zabiegu 500 ml wody, przesacz miesza z poluczynami i otrzymane roztwory steza pod zmniejszonym cisnieniem, dializuje, steza i suszy pnez wymrazanie, jak w przykladzie I, otrzymujac produkty o barwie watroby. Wyniki prób podano w taolicy III.Tablica III Numer procesu ekstrakcji 1 2 3 4 Stelenie wodoro¬ tlenku sodu 0,05 n 0,1 n 0,2 n 0,4 n Wartosc pH podczas ekstrakcji 9,0 11,5 12,5 13,0 Wydajnosc suchego produktu w % wagowych ,1 3,5 6,8 6,6 Calkowita wydajnosc wynosi 27%, a analiza elementarna produktu daje nastepujacy sklad: 41,0% C, 6,3% H, 3,7%N, 49,0% O. Próby przeprowadzone jak podano w przykladzie I wykazuja, ze produkt jest zawierajacym azot polisacharydem o ciezarze czasteczkowym 10000-250000 i przecietnym ciezarze czasteczkowym 100000.103468 5 Zdolnosc hamowania rozwoju stalego nowotworu Sarcoma—180 u myszy wynosi 93% przy podawaniu sródotrzewnowym i 73% przy podawaniu doustnym.W celach porównawczych powtórzono proces w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I, lecz stosujac roztwory wodorotlenku sodowego o stezeniu 1 n i 0,4 n. Wyniki podane w tablicy 4 swiadcza o tym, ze przy ponawianiu ekstrakcji z uzyciem roztworu o takim samym stezeniu wydajnosc procesu maleje i nie mozna uzyskac wydajnosci takiej, jak przy stosowaniu roztworów o rosnacym stezeniu.Tablica IV Numer procesu Wydajnosc w % wagowych przy ekstrahowaniu ekstrakcji 1 n NaOH 0,4 n NaOH 1 10,5 13,8 2 2,4 2,9 3 1,1 2,0 4 0,5. 1,5 Razem 14,5 20,2 Przyklad III. Postepujac w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I, 200 g suchej grzybni (zawartosc wilgoci 9,9% wagowych) Corio'us versicolor (Fr.) Quel. (FERM—P No. 2414) ekstrahuje sie najpierw 3 litrami wody wciagu 3 godzin w temperaturze 95°£2°C, po czym chlodzi, odsacza grzybnie, przemywa ja 1 litrem wody i popluczyny miesza z przesaczem, otrzymujac okolo 3,5 litra roztworu. Nastepnie ekstrahuje sie grzybnie 2 litrami 1 n roztworu wodorotlenku sodowego w ciagu 0,5 godziny w temperaturze 90—95°C, chlodzi, zobojetnia 2 n kwasem solnym, odsacza osad i przemywa go 1 litrem wody, otrzymujac 3 litry wyciagu z poluczynami. Wszystkie otrzymane roztwory miesza sie, steza pod zmniejszonym cisnieniem, dializuje, ponownie steza i suszy przez wymrazanie, otrzymujac 33 g produktu o barwie watroby, zawierajacego 7,0% wilgoci. Wydajnosc wynosi 21,0%. Elementarna analiza wykazuje, ze produkt zawiera 41,7% C, 6,4% H, 3,9% N 48,0% O. Próby, opisane w przykladzie I, wykazuja, ze produkt jest zawierajacym azot polisacharydem o ciezarze czasteczkowym 10000—300000 i o przecietnym ciezarze czasteczkowym 98000. Wskaznik zdolnosci hamowania rozwoju nowotworów Sarcoma—180 u myszy wynosi 94% przy sródotrzewnowym podawaniu produktu i 68% przy podawaniu doustnym.Przyklad IV. 200 g owocni Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM—P No. 2414) o zawartosci wilgoci 8,7% wagowych ekstrahuje sie w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I najpierw 2,4 litrami wody w temperaturze 95°C£2°C wciagu 3 godzin, po czym chlodzi} odsacza, przemywa osad 500 ml wody i popluczyny miesza z przesaczem, otrzymujac okolo 2,5 litra roztworu. Nastepnie miesza sie osad z 2 litrami 0,4 n wodorotlenku sodowego i ekstrahuje w ciagu 1 godziny w temperaturze 90°C±2°C, po czym chlodzi, zobojetnia 2 n kwasem solnym, odsacza osad i przemywa go 500 ml wody, otrzymujac wraz z przesaczem 2,5 litra roztworu. Osad ekstrahuje sie ponownie 2 litrami 1 n wodorotlenku sodowego w temperaturze 80°C±2°C wciagu 1 godziny, otrzymujac po przemyciu 2,5 litra roztworu.Otrzymane roztwory miesza sie, steza pod zmniejszonym cisnieniem, dializuje, ponownie steza i suszy przez wymrazanie, otrzymujac 43,4 g produktu w postaci proszku o barwie watroby, zwierajacego 7,5% wagowych wody. Wydajnosc wynosi 22%. Produkt zawiera 42,3% wegla, 6,5% wodoru, 2,2% azotu i 49,0% tlenu, a próby opisane w przykladzie I wykazuja, ze produkt ten jest polisacharydem zawierajacym azot, jego ciezar czasteczkowy wynosi 10000—300000, a przecietny ciezar czasteczkowy 110000. Zdolnosc produktu hamowania rozwoju nowotworów Sarcoma—180 u myszy wynosi 96% przy podawaniu sródotrzewnowym i 75% przy podawaniu doustnym. Prowadzac w analogicznych warunkach ekstrakcje sama tylko woda uzyskuje sie wydajnosc wynoszaca 7,6%. PL PL PL PL

Claims (7)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania polisacharydów, zawierajacych azot i majacych wlasciwosci przeciwnowotworowe, przez ekstrakcje wodnym rozpuszczalnikiem grzybów z gromady podstawczaków (Basidiomycetes), znamien¬ ny ty m, ze grzyb z rodzaju Coriolus z rzedu Polyporaceae ekstrahuje sie najpierw woda lub 0,01—0,05 n alkalicznym roztworem wodnym, a nastepnie kolejno alkalicznymi wodnymi roztworami o stezeniu, rosnacym stopniowo od powyzej 0,05 n do ponizej 2 n.6 103 468

2. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze ekstrahuje sie naturalne lub sztucznie hodowane owocnie i/albo grzybnie grzybów.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ekstrahuje sie grzyb Coriolus versicolor (Fr.) Quel.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ekstrakcje prowadzi sie w temperaturze 50—100°C.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, z n a m i e n n y t y m, ze proces ekstrakcji stosuje sie 3-8 razy.

6. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze ekstrakcje prowadzi sie w ciagu 1—20 godzin.

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wodne roztwory alkaliczne stosuje sie roztwory wodorotlenku sodowego. * Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 45 zl PL PL PL PL